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    副豬嗜血桿菌河南分離株的優(yōu)勢(shì)血清型和毒力基因研究

    2021-01-27 03:33:04張青嫻徐引弟王治方朱文豪焦文強(qiáng)李海利
    養(yǎng)豬 2020年6期
    關(guān)鍵詞:嗜血血清型毒力

    張青嫻,徐引弟,王治方,朱文豪,焦文強(qiáng),李海利

    (1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所,河南 鄭州 450002;2.河南省畜禽繁育與營(yíng)養(yǎng)調(diào)控重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,河南 鄭州 450002)

    副豬嗜血桿菌(Haemophilus parasuis, HPS)是豬多發(fā)性漿膜炎和關(guān)節(jié)炎(Glasser's disease, 格拉瑟?。┑牟≡w,常定植在豬的上呼吸道,在環(huán)境應(yīng)激和感染免疫抑制性疾病時(shí)副豬嗜血桿菌進(jìn)入血液暴發(fā)本病,引發(fā)全身性細(xì)菌感染[1]。

    HPS至少分為15種血清型,我國(guó)流行的血清型為1、4、5和13,河南省以4型和5型居多[2-6]。目前防控本病的主要措施是使用抗生素和疫苗接種,常用的疫苗為全細(xì)菌滅活苗,但只對(duì)血清型1、4、5和6有保護(hù)力[7-9]。血清型之間的交叉保護(hù)不一致,也缺乏區(qū)分感染豬和疫苗豬的可用方法,當(dāng)疫苗株與臨床分離株血清型不一致時(shí),疫苗無(wú)法提供足夠的免疫保護(hù)。HPS血清型被視為毒力的重要標(biāo)志,根據(jù)Oliveira等[10]的方法,不同血清型的HPS被分為3類:強(qiáng)毒力(血清型1、5、10、12、13和14)、中等毒力(血清型2、4和15)和無(wú)毒力(血清型3、6、7、8、9和11)。不同血清型的副豬嗜血桿菌分離株可攜帶不同的毒力基因,相同血清型的分離株也可表現(xiàn)出不同程度的毒力[11-13]。

    目前HPS致病性毒力因子的數(shù)量與功能尚未完全探究清楚。樂(lè)敏首次繪制出HPS SH0165株基因組的潛在毒力因子圖,篩選出部分主要的毒力相關(guān)基因或操縱子基因(nanH、oapA、ompP5、pilA、ompP2、cdtABC、hhdAB、prtC、sodAC、sphB、espP、fkpA、mip、mviN和HAPS-0694),發(fā)現(xiàn)這些基因在我國(guó)HPS流行菌株中高度保守,很有可能是引起HPS致病力的關(guān)鍵因子[14]。研究發(fā)現(xiàn),lsgB基因只存在于毒性菌株中[15];capD基因編碼一種多糖生物合成蛋白,且與副豬嗜血桿菌的毒性有關(guān)[16];wza基因在毒力因子莢膜多糖轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程起重要作用,缺失wza基因能使HPS毒力顯著降低[17];體內(nèi)感染條件下,cdtABC和hhdAB均出現(xiàn)上調(diào)表達(dá),是HPS直接發(fā)揮細(xì)胞毒性作用的重要武器[14];vta3在毒力菌株和無(wú)毒力菌株中均高度保守,而vta1和vta2主要在致病菌株中為陽(yáng)性[18];HPS具有神經(jīng)氨酸酶基因nanH和神經(jīng)氨酸酶活性[19],與細(xì)菌黏附有關(guān)的外膜蛋白o(hù)mpP2在毒力株中存在部分堿基缺失[20-21],而胞外絲氨酸蛋白酶(extracellular serine protease,espP2)在HPS感染過(guò)程中表達(dá)[22]。對(duì)田間分離株檢測(cè)毒力基因,并分析毒力基因與血清型的相關(guān)性,有助于預(yù)測(cè)HPS分離株的致病力和防控格拉瑟病。

    本試驗(yàn)通過(guò)對(duì)河南省HPS血清型分型和毒力基因擴(kuò)增試驗(yàn),分析毒力因子的功能及其與血清型的相關(guān)性,為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)該菌致病機(jī)理及研發(fā)新型亞單位疫苗和診斷試劑提供重要依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 菌株

    受試菌株分離于2017—2018年河南地區(qū)具有典型格拉瑟病癥狀的病豬,由河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所傳染病研究室分離、鑒定與保存,共計(jì)46株HPS(表1)。

    1.2 主要試劑

    胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)、胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基(TSB),美國(guó)BD公司;煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD),Sigma公司;革蘭氏染色液,珠海貝索生物技術(shù)有限公司;新生牛血清,鄭州益康生物工程有限公司;PCR分子生物學(xué)試劑,寶生物(大連)工程有限公司;DMSO和甘油等普通化學(xué)試劑,北京陸橋技術(shù)股份有限公司。

    1.3 血清分型

    參考Howell等[23-24]的方法,合成用于鑒定HPS血清型的引物,由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共25 μL,包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix,上下游引物(50 μmol/L)各1.5 μL,2 μL DNA模板(濃度約20 ng/μL),0.25 μL DMSO和7.25 μL超純水。PCR反應(yīng)條件:94 ℃初始變性2 min;94 ℃ 30 s,58 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,30個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳后在凝膠成像儀上進(jìn)行觀察分析。

    表1 46株HPS分離株的背景信息

    1.4 毒力基因鑒定

    參考樂(lè)敏等[14,25-26]的方法,合成鑒定HPS毒力因子的引物(表2),由上海生工生物工程有限公司合成。PCR反應(yīng)體系共25 μL,包括12.5 μL 2×Taq PCR master mix,上下游引物(50 μmol/L)各2 μL,7.5 μL超純水和1 μL DNA模板(濃度約20 ng/μL)。反應(yīng)體系如下:94 ℃初始變性4 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 30 s,72 ℃ 1 min,35個(gè)循環(huán),72 ℃延伸5 min。使用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物。

    表2 毒力基因引物序列

    2 結(jié)果

    2.1 副豬嗜血桿菌的分離情況

    根據(jù)分離部位統(tǒng)計(jì),2017—2018年河南省副豬嗜血桿菌的分離率在肺組織中最高(47.8%,22/46),其次是氣管(37%,17/46),心血、腦組織和關(guān)節(jié)分離率均不高(表3)。

    表3 副豬嗜血桿菌分離株在不同樣品中的血清型分離率

    2.2 副豬嗜血桿菌的血清型分布

    46株HPS一共鑒定出7種血清型(表3)。血清型5/12(32.6%,15/46)最常見(jiàn),其次是血清型4(26.1%,12/46)、血清型7(15.2%,7/46),血清型2和血清型13均分離到3株(6.5%,3/46),血清型6分離到1株(2.2%,1/46),血清型11分離到2株(4.3%,2/46),未分離到血清型1、3、8、9、10、14和15,有3株為未定型菌株(6.5%,3/46)。

    2.3 副豬嗜血桿菌的毒力基因測(cè)定

    46株HPS的毒力基因分布情況見(jiàn)表4,wza(4/46,8.7%)分離率很低,只出現(xiàn)在強(qiáng)毒株中。lsgB(5/46,10.8%)、capD(4/46,8.7%)分離率低,且在高、中等毒力菌株中呈陽(yáng)性。vta2(22/46,47.8%)、vta3(16/46,34.8%)、hhdA(24/46,52.2%)、hhdB(25/46,54.3%)、cdtA(24/46,52.2%)、cdtB(28/46,60.8%)、cdtC(26/46,56.5%)分離率較高,且均存在于強(qiáng)毒株或中等毒力菌株中。vta1、nanH、ompP2、espP2在分離株中陽(yáng)性率較高,陽(yáng)性率分別為73.9%(34/46)、67.4%(31/46)、80.4%(37/46)和56.5%(26/46),且無(wú)毒力區(qū)分。強(qiáng)毒株所含毒力基因最多,其次是中等毒力毒株。

    表4 副豬嗜血桿菌血清型相關(guān)的毒力基因分布信息

    2.4 血清型與毒力基因的關(guān)系

    所有血清型的菌株至少攜帶1個(gè)毒力基因(表4)。毒力菌株與某些毒力基因的存在有很強(qiáng)的相關(guān)性。試驗(yàn)顯示,無(wú)毒力菌株一般只含有vta1、ompP2、nanH和espP2基因,大多數(shù)毒力基因分布在高度和中等毒力組(表4)。相比之下,中等和無(wú)毒力性菌株出現(xiàn)vta3的概率非常低,中高度毒力菌株與lsgB、capD、vta1有很強(qiáng)的相關(guān)性。

    3 討論

    2017—2018年從河南省不同地區(qū)具有典型格拉瑟病癥狀的病豬中分離到46株HPS,其血清型和毒力基因分布呈現(xiàn)多樣性和復(fù)雜性。肺臟和氣管為HPS主要分離部位,血清型5氣管檢出率高于肺組織,而血清型4肺組織檢出率高于氣管。血清型分型結(jié)果顯示,HPS河南分離株流行的血清型為4型和5型,未分離到血清型1、3、8、9、10、14和15,與河南省副豬嗜血桿菌歷年流行的血清型一致[3-6]。心血、腦組織和關(guān)節(jié)的分離率很低,但其分離株均為中等毒力或強(qiáng)毒株,肺臟的高分離率提示2017—2018年HPS在河南省仍以強(qiáng)毒株流行為主[27]。

    所篩選的14個(gè)毒力基因多存在于強(qiáng)毒株和中等毒力株中,無(wú)毒力株一般只含有vta1、ompP2、nanH和espP2基因。vta1、nanH、ompP2、espP2在河南省HPS流行菌株中高度保守,在毒力菌株和無(wú)毒力菌株中均存在,推測(cè)所篩選的毒力基因很有可能是HPS致病關(guān)鍵因子。由此推測(cè)可能存在多個(gè)毒力基因協(xié)同作用,使HPS菌株產(chǎn)生相對(duì)較高的毒力,對(duì)毒力基因的檢測(cè)可以作為將HPS血清型分為不同毒力組的補(bǔ)充方法。HPS毒力因子的界定將大幅提高毒力和非毒力菌株的鑒別,需要更多的研究來(lái)驗(yàn)證副豬嗜血桿菌各毒力蛋白的具體作用[26,28]。

    綜上所述,本研究分離的46株HPS多數(shù)含有多個(gè)毒力基因,可能存在多個(gè)毒力基因的協(xié)同作用,是否上述毒力因子是決定HPS致病力的基因還有待于進(jìn)一步的基因敲除與回歸試驗(yàn)驗(yàn)證[29];是否被界定為中等和強(qiáng)毒株的血清型中均含有上述毒力基因有待進(jìn)一步擴(kuò)大田間分離株范圍[30-31]。

    本文提供了2017—2018年河南省HPS血清型和毒力基因的第一手資料,研究了血清型與毒力基因的相關(guān)性,對(duì)了解河南省HPS流行病學(xué)特征和防控該病具有重要意義。

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