血清7型豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌的分離鑒定與耐藥性分析

夏倫斌，陳桂萍，蔣 平，孫桃桃，劉 平

(1.皖西學院 生物與制藥工程學院，安徽六安 237012；2.六安市齊禮農牧科技有限責任公司，安徽六安 237012)

豬傳染性胸膜肺炎(Porcinecontagiouspleuropneumonia，PCP)是由豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacilluspleuropneumoniae，APP)引起的一種急性呼吸道傳染病，造成感染豬胸膜肺炎與肺部出血性壞死，急性病例死亡率可達80%以上，慢性經過者生長發(fā)育受阻，易繼發(fā)其他病原感染而死亡[1]。豬場一旦感染本病就很難根除，其原因在于存在慢性感染和帶菌豬。本病是國際上公認的危害現(xiàn)代養(yǎng)豬業(yè)的主要疾病之一，給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經濟損失[2]。近年來，中國多地報道有該病發(fā)生[3-5]，由于APP存在多種血清型，不同地方流行的優(yōu)勢菌株血清型存在差異，不同血清型菌株之間又缺乏交叉免疫性[1]，這給PCP的有效防控增加了難度。豬場對疑似APP感染的豬只，須及時隔離，同時采取病原分離鑒定和篩選敏感藥物進行治療，才能阻斷和治療該病。本研究對安徽省皖西地區(qū)一豬場疑似APP感染的實驗室診斷和治療效果進行報道，為該病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 患病豬來源及病料采集 2019年12月，安徽省皖西地區(qū)某豬場有12頭豬發(fā)病，體溫升高達40 ℃以上，伴有明顯的呼吸道癥狀，臨床癥狀出現(xiàn)3 d后有2頭豬死亡。為了確診，無菌采集死亡豬鼻腔分泌物和肺臟組織病料，并及時送至皖西學院小動物診療實驗實訓中心進行病原分離培養(yǎng)和鑒定。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑 胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基(TSA)，細菌生化鑒定管和標準藥敏紙片， 革蘭氏染色試劑等均購自杭州濱和微生物試劑有限公司；APP(1～12型)標準陽性血清購自中國獸藥監(jiān)察所；微生態(tài)制劑購自山東寶來利來生物工程股份有限公司；電解多維購自山東富利特藥業(yè)有限公司；所用治療藥物均購自安徽天安生物科技股份有限公司。

1.1.3 主要儀器設備 SW-CJ-2FD型超凈工作臺，蘇州凈化設備有限公司生產；LDZX-75KBS型高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠生產；GHP-9270型恒溫培養(yǎng)箱，上海齊欣科學儀器有限公司生產；BK6000生物顯微鏡，重慶奧特光學儀器有限公司生產；YP5002型電子天平，上海越平科學儀器有限公司生產；其他儀器和耗材均為皖西學院小動物診療實驗實訓中心提供。

1.2 方 法

1.2.1 臨床癥狀與病理剖檢觀察 對發(fā)病豬進行連續(xù)體溫檢測、精神狀態(tài)觀察并記錄；對病死豬進行病理剖檢，觀察肺臟、氣管、支氣管、肝臟等臟器的病理變化情況。

1.2.2 病菌的分離培養(yǎng) 無菌采集的病料用劃線方法接種于TSA培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，挑選單個菌落進行革蘭氏染色，并在顯微鏡下觀察。

1.2.3 血清型鑒定 取單個菌落進行純培養(yǎng)，然后用滅菌生理鹽水制備成適宜濃度的細菌懸液，分別與1～12型APP標準陽性血清進行玻板凝集試驗，觀察是否出現(xiàn)凝集現(xiàn)象，確定分離株的血清型。

1.2.4 生化鑒定 用接種環(huán)無菌挑取單個分離菌株的菌落于細菌生化鑒定管中，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，按照說明書進行鑒定。

1.2.5 藥敏試驗 采用Kirby-Bauer(K-B)紙片擴散法進行敏感藥物篩選[6-7]，在超凈工作臺上，將分離的細菌均勻涂布接種在TSA培養(yǎng)基上，分別將6類7種藥敏紙片緊貼于培養(yǎng)基表面，紙片間距不小于20 mm，放置于恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，觀察并測量記錄抑菌圈直徑的大小，參照美國國家臨床實驗室標準化研究所(CLSI)推薦的標準[8]判定藥敏試驗結果。

1.2.6 病豬治療 病豬及時隔離，單獨場所飼喂，用篩選的敏感藥物進行肌內注射，同時進行對癥和提高免疫力治療。

2 結果與分析

2.1 臨床特征與病理剖檢觀察

發(fā)病豬的體質量為20～35 kg，體溫 40.3～42.1 ℃，精神沉郁，廢食，呼吸困難，張口喘氣，打噴嚏，鼻腔帶有淡紅色泡沫狀分泌物，病豬常呈犬坐姿勢，咳喘并伴有腹式呼吸，耳部及頸部皮膚有發(fā)紺斑塊(圖1)。病理剖檢可見胸膜和肺臟表面有廣泛性纖維素滲出，肺與胸壁、縱膈有纖維素性粘連(圖2)，肺腫大、充血，呈紫紅色(圖3)，肺切面似肝，易碎、膈葉有炎性壞死灶，間質充滿血色膠樣液體(圖4)。

2.2 病菌的分離培養(yǎng)

在TSA培養(yǎng)基上可見呈圓形、隆起、表面光滑、灰白色、邊緣整齊的半透明小菌落(圖5)，革蘭氏染色為革蘭氏陰性短桿菌，菌體多為球桿菌，較小，有的成雙排列(圖6)，命名為WXC1901。

2.3 生化鑒定結果

由表1可知，該菌能發(fā)酵蔗糖、木糖、果糖，發(fā)酵葡萄糖產酸，硝酸鹽還原、脲酶、氧化酶和接觸酶試驗均為陽性，其他如乳糖、阿拉伯糖、蜜二糖、甘露醇、七葉苷、海藻糖、V-P反應和M.R.試驗等指標均為陰性，將生化試驗結果與《伯杰氏細菌鑒定手冊》[9]對照，確定分離菌WXC1901的生化特性與APP的相一致。

表1 分離菌株WXC1901生化特性鑒定結果

2.4 血清型鑒定結果

分離菌WXC1901純培養(yǎng)物懸液與血清7型APP標準陽性血清發(fā)生明顯的凝集現(xiàn)象，與其他型標準陽性血清及生理鹽水對照均未見有凝集現(xiàn)象。結果表明分離菌WXC1901為血清7型APP。

2.5 藥敏試驗結果

由圖7和表2可知，分離菌WXC1901對β-內酰胺類藥物氨芐西林和多肽類藥物萬古霉素、多粘菌素B敏感，對環(huán)丙沙星、頭孢他啶、麥迪霉素和復方新諾明等其他類別藥物耐藥。

表2 分離菌株WXC1901藥敏試驗結果

2.6 治療效果觀察

用篩選的敏感藥物氨芐西林(獸用氨芐西林鈉注射液，每瓶1.0 g)進行肌內注射，按 20 mg/kg體質量給患病豬給藥，每日2次，早晚各 1次；柴胡注射液每日2次，每次4 mL，肌內注射；黃芪多糖注射液每日2次，每次5 mL，肌內注射；在飲水中加入微生態(tài)制劑(由枯草芽孢桿菌、乳酸片球菌、植物乳桿菌及其代謝產物等組成，活菌總數(shù)≥2.0×108CFU/g，添加量為0.1%)和電解多維(每千克含VA1500 000 IU、VD3300 000 IU、VE1430 mg、VB1500 mg、VB2900 mg、VB121 000 mg、VK3700 mg，VC 600 mg、NaCl 2 000 mg、KCl4500 mg、氨基酸20 000 mg等，輔料為寡糖，含量為0.033%)，供給充足的干凈飲水，飼喂采用少飼多餐。用藥1 d后，發(fā)病豬出現(xiàn)好轉，采食量增加，連續(xù)用藥5 d后，患病豬呼吸道癥狀基本消失，精神狀態(tài)和采食量恢復正常，用藥后未再出現(xiàn)死亡，具體見表3。

表3 患病豬治療效果

3 討 論

本研究結合患病豬臨床癥狀分析，對病原進行分離，生化及血清型鑒定，成功分離并鑒定出1株APP血清7型菌株，將其命名為WXC1901。目前，國內報道的APP流行菌株主要優(yōu)勢血清型為7、1和3型，2、4、5、8、9、10和12型等也有報道[10-11]，本研究分離的血清7型是造成PCP常見的血清型。王丹丹等[12]2019年報道了江蘇泰州某規(guī)?；B(yǎng)豬場育肥豬感染APP血清8型菌株，李海利等[13]2016年報道鑒定了APP血清3型菌株，鄭培等[14]2019年報道了新疆奇臺和昌吉市規(guī)?；i場發(fā)生育肥豬感染APP血清5型菌株，徐引弟等[15]2019年報道了河南省汝州市某大型規(guī)模化養(yǎng)豬場育肥豬感染APP血清1型菌株，李凱明等[4]2020年報道了河南洛陽某豬場感染的APP為血清型5型，由此可見，中國不同地區(qū)的規(guī)模化豬場常有APP感染，且不同地域的優(yōu)勢血清型存在差異，這給PCP的有效防控增加了難度。原因在于APP不同血清型菌株之間的交叉免疫性弱，目前還沒有研制出包括所有血清型菌株抗原的多價疫苗或聯(lián)苗，如果所預防接種的疫苗株血清型與當?shù)亓餍兄暄逍筒灰恢?，就不能發(fā)揮有效的免疫保護作用。因此，豬場一旦發(fā)生PCP，及時隔離患病豬并篩選敏感藥物治療，是阻斷APP進一步感染豬群的有效手段。本研究中，分離株WXC1901藥敏試驗結果顯示，其對多種抗菌藥物呈多重耐藥，這與近幾年的一些國內外報道一致[16-20]。同時，藥敏試驗表明，不同區(qū)域的分離株雖然多呈多重耐藥，但是耐藥的藥物類別卻有差異，敏感藥物也存在差異，從本病例分離的APP菌株WXC1901對β-內酰胺類藥物氨芐西林和多肽類藥物萬古霉素、多粘菌素B敏感，對環(huán)丙沙星、頭孢他啶、麥迪霉素和復方新諾明等藥物耐藥，王丹丹等[12]從江蘇泰州某規(guī)?；B(yǎng)豬場分離的APP對氨芐西林為中介，對頭孢他啶敏感，這與分離株WXC1901存在差異；李凱明等[4]報道了河南洛陽的APP分離株對頭孢他啶耐藥，對氨芐西林和硫酸多粘菌素表現(xiàn)敏感，這與分離株WXC1901是一致的。這種現(xiàn)象可能由于不同區(qū)域豬場長期使用的抗菌藥物不同所致。

基于APP在中國豬場感染的現(xiàn)狀，如何防控PCP的發(fā)生，是獸醫(yī)工作者面臨的主要挑戰(zhàn)之一。研究者們提出了很多預防措施，如針對當?shù)貎?yōu)勢菌株做好疫苗接種、改善飼養(yǎng)環(huán)境、給予均衡營養(yǎng)、施行全進全出制、做好生物安全防護以及加強豬支原體病、偽狂犬病、繁殖與呼吸障礙綜合征等疾病的預防[21]。結合本病例，筆者認為豬群一旦疑似感染APP ，應從以下三方面進行防控：一是及時對有臨床癥狀或密切接觸豬進行隔離，并全場進行消毒；二是根據(jù)臨床癥狀進行初步診斷，及時分離病原并篩選敏感藥物；三是用篩選的敏感藥物進行治療，同時采用對癥治療、提高豬體免疫力等治療措施。采用以上措施，本研究中的發(fā)病豬場對該病取得了較好的治療效果，減少豬場的損失，為豬場診斷和治療APP感染提供參考。