右美托咪啶在南海近灘海水條件下對開放性顱腦損傷的抗炎和腦保護作用

馮龍 尹一恒 鄭楊睿 湯浩 段明達 曹江北 袁維秀 張宏 余新光

創(chuàng)傷性腦損傷（traumatic brain injury，TBI）是全球范圍內(nèi)嚴重威脅人民健康的問題之一，是導(dǎo)致青壯年死亡或永久性殘疾的重要因素，且具有很高的致死率和致殘率，同是TBI 也是海軍戰(zhàn)爭死亡和致殘的主要原因[1-3]。由于海水低溫、高滲、偏堿性及含有大量細菌等原因，導(dǎo)致開放性TBI 后繼發(fā)性損傷程度均強于陸戰(zhàn)傷，故海戰(zhàn)傷的傷情和救治模式有很大不同。而南海海域的水溫較高，海水理化性質(zhì)及微生物分布與其他海域也有所不同，且針對南海海戰(zhàn)顱腦損傷研究相對較少。目前研究發(fā)現(xiàn)新型鎮(zhèn)靜藥右美托咪啶可通過降低藍斑中去甲腎上腺素能神經(jīng)元的活性來誘導(dǎo)鎮(zhèn)靜作用，從而增加腹側(cè)前視神經(jīng)核中抑制性γ-氨基丁酸神經(jīng)元的活性[4]。同時該藥對心律、血壓和躁動有良好的作用，因此對于TBI患者的鎮(zhèn)靜是一種非常有用的鎮(zhèn)靜劑[5]。本研究主要通過建立開放性TBI 實驗兔模型后經(jīng)南海近灘海水浸泡后研究右美托咪啶是否具有抗炎癥及腦保護作用。現(xiàn)報道如下。

材料與方法

一、實驗動物

挑選3 月齡清潔健康雄性新西蘭兔12 只，體質(zhì)量2.5～3.0 kg，平均（2.7±0.3）kg，購自湖南長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，許可證號：scxk (湘)2014-0010。本研究所有涉及動物的程序均已獲得中國人民解放軍醫(yī)學(xué)院倫理委員會批準，并按照《實驗動物的護理和使用指南》進行。

二、動物分組及模型制作

將12 只新西蘭兔隨機分為右美托咪啶組（Dex組，6 只）和對照組（Con 組，6 只）；其中Dex 組選擇使用右美托咪啶注射液50 μg/kg （江蘇恒瑞醫(yī)藥股份有限公司），Con 組給予相同劑量生理鹽水。

根據(jù)Feeney 等[6]的實驗?zāi)Ｐ瓦M行改良制作開放性TBI。實驗開始前2 d 所有實驗兔進行單籠喂養(yǎng)，自由飲水及進食，且在實驗前12 h 開始禁食。使用地西泮（3～5 mg/kg）進行靜脈麻醉，觀察5 min 后確認實驗兔意識完全喪失后制作開放TBI 模型。兔頭備皮后用碘伏消毒，全層切開頭皮并于右側(cè)頂部開顱，磨鉆形成大小約2.0 cm×1.5 cm 骨窗，十字切開硬膜后翻轉(zhuǎn)硬膜，顯露右側(cè)大腦半球皮質(zhì)并用尖刀切開皮層約1 cm，由同一個操作者在顱腦開窗處挫裂損傷腦組織。全部實驗兔建立模型后用南海近灘海水（海水取自海南省三亞市三亞灣）沖洗傷口60 min，隨后Dex 組實驗兔經(jīng)腹腔注射給予50 mg/kg 鹽酸右美托咪啶，Con 組給予相應(yīng)劑量的生理鹽水。沖洗傷口結(jié)束后，無菌操作全層縫合頭皮，骨瓣未回納。實驗兔單獨回籠繼續(xù)觀察48 h。

三、標本制備

建立模型48 h 后使用地西泮（3～5 mg/kg）麻醉，先抽取實驗兔耳緣靜脈血并使用臨床可凝結(jié)生化管收集，隨后在3000 r/min 離心3 min（離心半徑13 cm）后收集血清，-80℃凍存以備后續(xù)使用。安樂處死實驗兔完整取出傷側(cè)大腦半球，觀察傷側(cè)大腦半球大體形態(tài)變化，從腦創(chuàng)傷區(qū)域部分取材，標本置于10%的福爾馬林液中固定，石蠟包埋后行HE 染色。HE 染色具體步驟：首先將腦組織樣本固定與切片，進行常規(guī)的石蠟包埋；然后把腦組織樣本脫蠟處理，把腦組織樣本依次置于95%、85%、70%乙醇中各浸泡5 min 進行水化；隨后把腦組織切片分別行蘇木素染色、分化與反藍處理以及伊紅染色和脫水處理；最后把腦組織切片風干封片在顯微鏡下1∶200倍數(shù)下拍照。

四、ELISA 法檢測血清中炎性介質(zhì)的表達

實驗兔腦損傷48 h 后，取外周血離心后通過ELISA 法檢測血清中各組炎性介質(zhì)的表達變化。采用流式高通量多因子檢測技術(shù)試劑盒（北京曠博生物技術(shù)有限公司） 測定血清細胞因子：白細胞介素1β（interleukin 1β，IL-1β）、白細胞介素6（interleukin 6，IL-6）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）及中樞神經(jīng)特異性蛋白（S100-β），經(jīng)流細胞檢測儀分析。實驗步驟主要按照說明書進行，簡要過程如下：把樣品從-80℃冰箱取出，化融離心后加樣，分別設(shè)空白孔、標準孔、待測樣品孔；棄去液體，甩干，每個孔中加入工作液，酶標板加上覆膜，37℃溫育1 h；再次棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板3 次，每次浸泡1～2 min，大約350 μL/孔，甩干并在吸水紙上輕拍將孔內(nèi)液體拍干；每孔加工作液，加上覆膜，37℃溫育30 min；重復(fù)上述操作3 次，棄去孔內(nèi)液體，甩干，洗板5 次；每孔加底物溶液，酶標板加上覆膜37℃避光孵育15 min；最后每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)，此時藍色立轉(zhuǎn)黃色，即刻采用450 nm 波長的酶標儀測量各孔的光密度值。

五、統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS17.0 軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，所有數(shù)據(jù)均行正態(tài)分布和方差齊性檢驗，計量資料均符合正態(tài)分布，以均數(shù)±標準差（±s）表示，采用Student’s t檢驗。實驗用圖使用GraphPad Prism6 制作。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié)果

一、實驗兔腦組織HE 染色結(jié)果

Con 組腦細胞水腫主要表現(xiàn)為神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細胞胞體明顯腫脹，原有的椎體形狀無法清晰辨認，細胞核濃染色，并且出現(xiàn)細胞核周圍環(huán)形低染甚至是空白染色區(qū)（圖1A）；而Dex 組經(jīng)右美托處理后可明顯改善以上組織細胞損傷和水腫的變化（圖1B）。

圖1 創(chuàng)傷性腦損傷后實驗兔腦組織HE 染色結(jié)果

二、ELISA 法檢測結(jié)果

與Con 組相比，Dex 組的炎癥因子IL-1β、TNF-α、S100-β 水平均明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而IL-6 水平變化差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）（表1）。

表1 2 組實驗兔腦創(chuàng)傷后48 h 后炎癥因子水平的比較

討論

TBI 是海軍戰(zhàn)爭死亡和致殘的主要原因，海戰(zhàn)傷后繼發(fā)性損傷程度均強于陸戰(zhàn)傷。夏照帆和馬兵[7]在現(xiàn)代戰(zhàn)爭條件下海戰(zhàn)創(chuàng)傷救治中指出，海戰(zhàn)傷傷情復(fù)雜、重傷多，同時爆炸傷（沖擊傷）的發(fā)生明顯高于其他環(huán)境條件下的作戰(zhàn)，同時落水傷員救治難，受氣候、海況等因素影響明顯。海戰(zhàn)傷患者經(jīng)海水浸泡后，機體主要的抗氧化酶-超氧化物歧化物含量會降低，加重機體的二次損傷[8,9]。我國南海海域的水溫較高，海水理化性質(zhì)及微生物分布有所不同，Du 等[10]研究發(fā)現(xiàn)TBI 患者被南海高溫海水浸泡后有助于細菌滋生加重感染，同時高鹽度也可加重腦組織脫水性損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，嚴重腦創(chuàng)傷患者中有7.7%～33%易并發(fā)陣發(fā)性交感神經(jīng)過度興奮（paroxysmal sympathetic hyperactivity，PSH）綜合征，可引起嚴重的高體溫、心動過速、高血壓、呼吸急促、肌張力異常、高代謝狀態(tài)以及難以控制的炎癥反應(yīng)等，嚴重影響患者預(yù)后[9,11]。正常應(yīng)激反應(yīng)時的交感神經(jīng)興奮對機體具有保護作用，而TBI 患者持續(xù)過度的交感神經(jīng)興奮可導(dǎo)致血流動力學(xué)不穩(wěn)定或增加二次腦損傷等風險[11]。目前在TBI 患者中常用的鎮(zhèn)靜藥中，丙泊酚具有降低腦灌注壓的優(yōu)點，但長期輸注可導(dǎo)致乳酸中毒、心功能不全和胰腺炎等；咪唑安定也可引起該類患者發(fā)生譫妄，長期輸注會出現(xiàn)易耐受和增加代謝產(chǎn)物等，因此常用的鎮(zhèn)靜藥在TBI患者中的使用明顯受限[12]。Lump 和Moyer[13]發(fā)現(xiàn)右美托咪啶可有效地抑制TBI 患者PSH 綜合征導(dǎo)致的自主神經(jīng)不穩(wěn)定，同時也可減少麻醉藥和鎮(zhèn)靜藥的使用。本研究通過建立開放性TBI 實驗兔模型，探討經(jīng)南海近灘海水浸泡后，使用右美托咪啶是否具有抗炎癥及腦保護作用。

從TBI 初期腦組織的直接震蕩損傷，到繼發(fā)腦疝和后期腦血管損傷引起缺血損傷過程中，生物化學(xué)的變化對病變早期的病理改變起重要調(diào)控作用，而后期的病理生理改變是以炎癥介質(zhì)（包括IL-1β、TNF-α、IL-6）持續(xù)釋放為主[14]。本研究結(jié)果顯示，在TBI 兔模型的創(chuàng)傷初期，給予右美托咪啶可明顯降低腦組織水腫和損傷，TBI 后48 h，給予右美托咪啶可顯著降低血液中IL-1β、TNF-α 的水平，而起到抗炎腦保護作用。2 組的IL-6 水平無明顯變化，其原因可能與觀察時間相關(guān)。Taupin 等[15]研究發(fā)現(xiàn)IL-6 水平在TBI 后8 h 達高峰，18 h 候開始下降，而本研究觀察時間為TBI 后48 h，可能該介質(zhì)在48 h 后已恢復(fù)到創(chuàng)傷前水平。此外，Ding 等[16]和Singhal 等[17]也發(fā)現(xiàn)右美托咪啶在TBI 后使用可明顯降低損傷后24 h 后和48 h 后的炎癥因子水平，具有明顯的抗炎作用。

眾所周知，血漿中S-100β 可早期預(yù)估創(chuàng)傷程度、繼發(fā)腦損傷以及預(yù)后的指標[18]。本研究也發(fā)現(xiàn)右美托咪啶可明顯降低TBI 模型實驗兔48 h 后的S100-β水平，說明該藥具有很好的腦保護作用，與Li 等[19]、Shen 等[20]、Schoeler 等[21]的結(jié)果一致。該藥的神經(jīng)保護作用機制可能與激動α2受體和咪唑啉Ⅰ1 受體相關(guān)[19-21]。Dahmani 等[22]也發(fā)現(xiàn)右美托咪啶具有神經(jīng)保護作用，其作用機制主要是通過α2 腎上腺素受體-FAK-PI3K-AKt 和咪唑啉Ⅰ1 受體-ERK1&2-MitoKATP 信號通路調(diào)控。其中細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶（extracellular signal-regulated protein kinase，ERK）信號通路與ERK 受體有關(guān)，該蛋白激酶是細胞存活的重要調(diào)控者和各種藥物起神經(jīng)保護作用的重要中介物[23]。

綜上所述，南海近灘海水海戰(zhàn)開放性TBI 后給予右美托咪啶可顯著降低炎癥因子水平，且可明顯降低腦損傷指標S100-β 的水平。因此，在海戰(zhàn)開放性TBI 后使用右美托咪啶具有一定的抗炎和腦保護作用，但其具體作用機制還有待進一步研究明確。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突