百花花楸果中β-谷甾醇及其衍生物的制備及抗抑郁活性研究

劉曉峰 曹馨元 尹永霞 王波 黃文華

摘 要 目的：制備百花花楸果中β-谷甾醇（簡(jiǎn)稱為“Sit”）及其衍生物，并考察其抗抑郁活性。方法：以百花花楸果實(shí)為原料，經(jīng)過75%乙醇和20%KOH溶液提取，并經(jīng)萃取結(jié)晶后得到Sit。以Sit的C3位羥基作為結(jié)構(gòu)修飾位點(diǎn)，以二氯甲烷為反應(yīng)溶劑、4-二甲氨基吡啶為催化劑、1-（3-二甲胺基丙基）-3-乙基碳二亞胺為脫水劑，分別加入4種有機(jī)酸（水楊酸、2-四氫糠酸、苯丙氨酸、山梨酸），通過羧合反應(yīng)生成相應(yīng)的酯類衍生物Sit-S、Sit-T、Sit-P、Sit-Sr，并采用紅外和核磁共振等波譜技術(shù)鑒定其化學(xué)結(jié)構(gòu)。根據(jù)懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)初步探討Sit及其4種衍生物的抗抑郁活性，然后再根據(jù)懸尾實(shí)驗(yàn)和自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力實(shí)驗(yàn)篩選抗抑郁活性較好的化合物的有效劑量。將篩選出的該化合物單用以及分別與阿戈美拉汀[40 mg/kg，5-羥基色胺（5-HT）和5-HT 2C受體拮抗劑]、氟哌啶醇[0.2 mg/kg，非選擇性D2受體拮抗劑]和荷包牡丹堿[4 mg/kg，競(jìng)爭(zhēng)性γ-氨基丁酸（GABA）拮抗劑]聯(lián)用，腹腔注射給藥60 min后，進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)，然后通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)小鼠腦組織中5-HT、多巴胺（DA）、GABA水平，初步探索該化合物的抗抑郁作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)均設(shè)置空白對(duì)照組，腹腔注射等量10%丙二醇溶液。結(jié)果：經(jīng)波譜技術(shù)鑒定，Sit與4種有機(jī)酸成功地反應(yīng)生成了相應(yīng)的酯類衍生物。在Sit及其4種衍生物中，Sit-S組小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間均最短，且顯著短于空白對(duì)照組（P<0.05）。Sit-S的篩選結(jié)果顯示，其抗抑郁的有效劑量為4 mg/kg，且與空白對(duì)照組比較不影響小鼠的自發(fā)活動(dòng)（P>0.05）。該劑量作用下，Sit-S可顯著縮短小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間（P<0.01），顯著提高小鼠腦組織中5-HT、DA和GABA水平（P<0.05或P<0.01），但該作用效果可被阿戈美拉汀、氟哌啶醇和荷包牡丹堿不同程度地逆轉(zhuǎn)。結(jié)論：Sit的水楊酸酯衍生物Sit-S具有良好的抗抑郁活性，其作用機(jī)制可能是通過提高腦組織中5-HT、DA和GABA水平所介導(dǎo)的。

關(guān)鍵詞 百花花楸果;β-谷甾醇;衍生物;抗抑郁活性

ABSTRACT OBJECTIVE： To prepare β-sitosterol （shorted for “Sit”） and its derivatives from the fruit of Sorbus pohuashanensis， and to investigte their antidepressant activities. METHODS： Using the fruit of S. pohuashanensis as raw material， extracted with 75% ethanol and 20%KOH solution， Sit was obtained after extraction and crystallization. C3 hydroxyl group of Sit was used as the structural modification site， CH2Cl2 was used as the reaction solvent， DMAP was used as catalyst， EDCI was used as dehydrating agent， 4 kinds of organic acids （salicylic acid， 2-tetrahydrofuranic acid， phenylalanine， sorbic acid） were added to make the carboxylation reaction to produce ester derivatives Sit-S， Sit-T， Sit-P and Sit-Sr. The chemical structure of its derivatives were elucidated by IR and NMR. The tail suspension test and the forced swimming model were used to preliminarily explore the antidepressant active components of Sit and 4 kinds of derivatives; tail suspension test and the spontaneous exercise capacity test were used to screen effective dose of the compounds with antidepressant active. The compound was used alone or in combination with agomelatin [40 mg/kg， 5-hydroxytryptamine （5-HT） and 5-HT 2C receptor antagonist]， haloperidol [0.2 mg/kg， non-selective D2 receptor antagonist] and bicuculline [4 mg/kg， competitive γ-aminobutyric acid （GABA） antagonist]， respectively. Sixty minutes after intraperitoneal injection， tail suspension test was performed. The levels of 5-HT， dopamine （DA） and GABA in brain tissues of mice were detected by ELISA. The blank control group was given intraperitoneal injection of 10% propylene glycol solution. RESULTS： By spectrum technology， the corresponding ester compounds were synthesized by the reaction of Sit with four kinds of organic acids. Among Sit and its four derivatives， the immobility time of Sit-S group was the shortest in tail suspension test and forced swimming test， which was significantly shorter than that of blank control group （P<0.05）. Screening results of Sit-S showed that the effective antidepressant dose was 4 mg/kg， and it did not affect the spontaneous activity of mice compared with the blank control group （P>0.05）. With this dose， Sit-S could significantly shorten the immobility time of mice in tail suspension test （P<0.01）， and can significantly increase the levels of 5-HT， DA and GABA in the brain tissue of mice （P<0.05 or P<0.01）， but its effect can be reversed by agomelatine， haloperidol and bicuculline to different extent. CONCLUSIONS： Sit salicylate derivatives Sit-S exhibits good antidepressant activity， and its mechanism of action may be mediated by increasing the levels of 5-HT， DA and GABA.

2.3 Sit衍生物的合成

按照文獻(xiàn)報(bào)道的方法[15]，本研究選用二氯甲烷為反應(yīng)溶劑、DMAP為催化劑、EDCI為脫水劑，分別加入不同有機(jī)酸（水楊酸、2-四氫糠酸、苯丙氨酸、山梨酸），使之發(fā)生羧合反應(yīng)生成酯類化合物。以水楊酸β-谷甾醇酯（Sit-S）為例的合成過程：將水楊酸41.4 mg和Sit 83.0 mg在5 mL二氯甲烷中混合后，加入脫水劑EDCI 76.8 mg脫水10 min后，加入催化劑DMAP 7.4 mg，將該溶液加熱回流6 h;減壓除去溶劑，將殘余物先在常溫下通過硅膠254色譜柱洗脫，然后再采用石油醚-二氯甲烷-乙酸乙酯（7 ∶ 7 ∶ 1，V/V/V）洗脫，得到淺黃色油狀膠體（95.8 mg），即為Sit-S。同法制備2-四氫糠酸、苯丙氨酸、山梨酸與Sit生成的酯類衍生物Sit-T、Sit-P、Sit-Sr。通過HPLC法確定4種衍生物的純度均大于98%。Sit的母核及其衍生物的結(jié)構(gòu)見圖2。

2.4 Sit衍生物的結(jié)構(gòu)確證

采用傅里葉變換紅外光譜法（IR）和核磁共振氫譜（1H-NMR）、碳譜（13C-NMR）等技術(shù)對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)構(gòu)確證。

2.4.1 Sit-T 分子式為C34H56O4，分子量為528。IR光譜：2 964～2 888 cm-1處有飽和烷烴的碳?xì)鋯捂I伸縮振動(dòng)信號(hào)（υCH），提示存在飽和烷烴基團(tuán);1 738 cm-1處有羰基碳氧雙鍵的伸縮振動(dòng)信號(hào)（υC=O），提示存在羰基; ? 1 629 cm-1處有碳碳雙鍵的伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示存在碳碳雙鍵（υC=C）;1 384、1 372 cm-1處有甲基碳?xì)渥冃握駝?dòng)信號(hào)，提示有多個(gè)甲基存在。1H-NMR（300 MHz， CDCl3）δ：5.377（d，1H，J=4.8 Hz，6-H），4.681（m，1H，2″-H），4.433（m，1H，3-H），4.025（dd，1H，J=7.2、14.4 Hz，5″-Ha），3.940（m，1H，5″-Hb），1.010（s，3H，10-CH3），0.922（d，3H，2′-CH3），0.859（t，3H，5′-CH3），0.813（d，6′，6′-CH3），0.668（s，3H，13-CH3）;2.343～0.753處的信號(hào)為甾體母核、甾體17側(cè)鏈和2-四氫糠酸中其他飽和碳上的氫信號(hào)。13C-NMR（75 MHz，CDCl3）δ：172.67（C1′），139.41（C5），122.68（C6），76.79（C2″），74.33（C3），69.17（C5″），56.63（C14），56.01（C17），49.99（C9），45.82（C24），42.25（C13），39.67（C12），37.95（C4），36.89（C1），36.51（C10），36.06（C20），33.91（C22），31.81（C3″），30.12（C7，8），29.16（C25），28.13（C2），27.63（C23），26.13（C15），25.09（C4″），24.20（C16），23.04（C28），20.96（C11），19.70（C26），19.20（C27），18.98（C21），18.70（C18），11.89（C29），11.76（C19）。

2.4.2 Sit-P 分子式為C37H59NO3，分子量為565。IR光譜：3 450 cm-1處有氨基氮?dú)鋯捂I的伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示有氨基存在;3 044 cm-1處有碳?xì)滏I伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示有碳?xì)滏I的存在;1 734、1 722 cm-1處有羰基碳氧雙鍵伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示有羰基存在;1 670 cm-1處有雙鍵碳碳骨架伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示甾體母核中有雙鍵的存在; ? ? ?1 384、1 370 cm-1處有甲基碳?xì)渥冃握駝?dòng)信號(hào)，提示有多個(gè)甲基存在。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.311（m，2H，3′，5′-H），7.276（m，2H，2′，6′-H），7.140（m，1H，4′-H），5.371（d，1H，J=4.8 Hz，6-H），5.034（d，1H，J=8.1 Hz，2′-NH），4.642（m，1H，3-H），3.080（m，1H，2′-H），1.416[s，3H，1[″][″]-（CH3）3]，1.001（s，3H，18-H），0.936（d，3H，J=6.6 Hz，21-H），0.873（t，3H，J=7.2 Hz，29-H），0.828（d，6H，J=6.6 Hz，26，27-H），0.679（s，3H，19-H）;2.383～0.767 處的信號(hào)為甾體母核、甾體17側(cè)鏈和2-丁基羰基氨基苯丙酸基團(tuán)中其他飽和碳上的氫信號(hào)。13C- NMR（75 MHz，CDCl3）δ：171.14（C1′），154.98（C1[″][′]），139.30（C5），136.06（C1″），129.36（C3″，5″），128.34（C2″，6″），126.82（C4″），122.78（C6），79.62（C1[″][″]），73.52（C3），56.59（C14），55.95（C17），54.46（C2′），49.92（C9），45.74（C24），42.22（C13），39.63（C12），37.83（C4），36.91（C3′），36.82（C1），36.47（C10），36.07（C20），33.85（C22），31.81（C7），31.76（C8），29.07（C25），28.23[C1[″][″]-（CH3）3]，28.17（C2），27.59（C23），25.99（C15），24.21（C16），22.99（C28），20.94（C11），19.76（C26），19.20（C27），18.98（C21），18.71（C18），11.91（C29），11.78（C19）。

2.4.3 Sit-Sr 分子式為C35H56O3，分子量為524。IR光譜：3 075 cm-1處有碳?xì)渖炜s振動(dòng)信號(hào)，提示有碳?xì)滏I的存在;2 975～2 877 cm-1處有飽和烷烴的碳?xì)鋯捂I伸縮振動(dòng)信號(hào)（υCH），提示有飽和烷烴基存在;1 733 cm-1處有羰基碳氧雙鍵伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示有羰基的存在;1 644 cm-1處有碳碳雙鍵骨架伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示甾體母核中有雙鍵存在;1 383、1 369 cm-1處有甲基碳?xì)渥冃握駝?dòng)信號(hào)，提示有多個(gè)甲基存在。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：7.259（dd，1H，J=9.9，15.3 Hz，3′-H），6.213（dd，1H，J=9.9，15.3 Hz，4′-H），5.759（d，1H，J=15.3 Hz，2′-H），5.367（m，1H，6-H），5.357（m，1H，5′-H），4.675（m，1H，3-H），1.839（d，3H，J=5.7 Hz，6′-H），1.011（s，3H，18-H），0.914（d，3H，J=6.3 Hz，21-H），0.851（t，3H，J=7.2 Hz，29-H），0.806（d，6H，J=6.6 Hz，26，27-H），0.661（s，3H，19-H）;2.347～0.745處的信號(hào)為甾體母核、甾體17側(cè)鏈和（2E，4E）-己烷-2，4-二壬基中其他飽和碳上的氫信號(hào)。13C-NMR（75 MHz，CDCl3）δ：166.67（C=O），144.68（C3′），139.70（C5），139.00（C5′），129.77（C4′），122.54（C6），119.43（C2′），73.67（C3），56.64（C14），55.98（C17），49.98（C9），45.78（C24），42.26（C13），39.68（C12），38.17（C4），36.98（C1），36.57（C10），36.11（C20），33.88（C22），31.86（C7），31.82（C8），29.09（C25），28.21（C2），27.82（C23），26.01（C15），24.25（C16），23.01（C28），20.98（C11），19.78（C26），19.29（C27），18.99（C21），18.73（C18），18.60（C6′），11.94（C29），1.81（C19）。

2.4.4 Sit-S 分子式為C36H54O4，分子量為550。IR光譜：3 450 cm-1處有羥基氫氧伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示有羥基存在;3 080 cm-1處有碳?xì)浠衔锷炜s振動(dòng)信號(hào)，提示有飽和烷烴基團(tuán)的存在;2 964 ～2 876 cm-1處有飽和烷烴的碳?xì)鋯捂I伸縮振動(dòng)信號(hào)（υCH），提示有飽和烷烴基團(tuán)存在;1 724 cm-1處有羰基碳氧雙鍵伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示有羰基存在;1 614 cm-1處有雙鍵碳碳骨架伸縮振動(dòng)信號(hào)，提示甾體母核中有雙鍵的存在;1 604、1 582 cm-1處有碳碳雙鍵伸縮振動(dòng)信號(hào)（υArC=C），提示有苯環(huán)存在;1 384、1 372 cm-1處有甲基碳?xì)渥冃握駝?dòng)信號(hào)，提示有多個(gè)甲基存在。1H-NMR（300 MHz，CDCl3）δ：10.836（s，1H，2″-H），7.781（dd，1H，J=1.5，7.8 Hz，6″-H），7.377（dt，1H，J=1.5，7.8 Hz，5″-H），6.896（dd，1H，J=0.9，8.4 Hz，3″-H），6.807（dt，1H，J=0.9，8.4 Hz，4″-H），5.356（d，1H，J=4.5 Hz，6-H），4.818（m，1H，3-H），0.988（s，3H，10-CH3），0.864（d，3H，2′-CH3），0.798（t，3H，5′-CH3），0.752（d，6′，6′-CH3），0.612（s，3H，13-CH3）;2.403～0.630 處的信號(hào)為甾體母核、甾體17側(cè)鏈中其他飽和碳上的氫信號(hào)。13C-NMR（75 MHz，CDCl3）δ：168.60（1′），160.76（C2″），138.30（C5），134.39（C4″），128.86（C6″），122.08（C6），117.90（C5″），116.51（C3″），111.90（C1″），74.26（C3），55.70（C14），55.11（C17），49.09（C9），44.89（C24），421.34（C13），38.75（C12），37.11（C4），35.99（C1），35.64（C10），35.15（C20），32.99（C22），30.93（C7），30.89（C8），28.25（C25），27.23（C2），26.80（C23），25.22（C15），23.30（C16），22.12（C28），20.07（C11），18.80（C26），18.33（C27），18.08（C21），17.80（C18），10.99（C29），10.86（C19）。

2.5 Sit及其衍生物對(duì)抑郁模型小鼠的抗抑郁活性考察

本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sit-T、Sit-P、Sit-Sr和Sit-S在1～20 mg/kg的劑量范圍內(nèi)均有一定的抗抑郁樣活性，故本研究初步選取2.5、10 mg/kg作為給藥劑量，考察Sit及其4種衍生物的抗抑郁活性。分別取2批小鼠（每批88只），均隨機(jī)分為空白對(duì)照組（10%丙二醇溶液）和Sit及其4個(gè)衍生物（Sit-T、Sit-P、Sit-Sr、Sit-S）的低、高劑量組（劑量均為2.5、10 mg/kg，以10%丙二醇溶液為溶劑溶解），每組8只。各組小鼠均腹腔注射給藥，給藥體積均為1.0 mL。給藥1 h后，各取1批小鼠分別進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)[16-17]。（1）懸尾實(shí)驗(yàn)：將小鼠的尾巴懸掛固定在一個(gè)距離地面約40 cm的水平桿上，小鼠頭部朝下呈倒懸狀。每只小鼠均用不透明的硬紙板隔開，小鼠距離其周圍空間不少于15 cm。觀察小鼠的扭攀掙扎情況，當(dāng)其四肢靜止不動(dòng)時(shí)，記錄其不動(dòng)時(shí)間。（2）強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)：將小鼠單獨(dú)放置在一個(gè)水位高15 cm的開放型玻璃瓶（14 cm×30 cm×25 cm）內(nèi)，水溫為（24±2） ℃。從小鼠入水后開始計(jì)時(shí)，總實(shí)驗(yàn)時(shí)間為6 min，記錄后4 min內(nèi)小鼠的持續(xù)不動(dòng)時(shí)間（即小鼠在水中停止掙扎或呈漂浮狀態(tài)，僅使頭部露出水面的不動(dòng)時(shí)間）。上述不動(dòng)時(shí)間越長(zhǎng)，表明小鼠抑郁狀況越嚴(yán)重。采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果以x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組小鼠懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)的不動(dòng)時(shí)間測(cè)定結(jié)果見表1。

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，Sit低劑量組，Sit-T低劑量組，Sit-P低、高劑量組，Sit-Sr低劑量組和Sit-S低、高劑量組小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間顯著縮短（P<0.05或P<0.01），而Sit高劑量組小鼠在懸尾實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P<0.05）;Sit-T低劑量組，Sit-Sr低劑量組和Sit-S低、高劑量組小鼠在強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的不動(dòng)時(shí)間顯著縮短（P<0.05）。結(jié)果提示，衍生物Sit-S對(duì)小鼠不動(dòng)時(shí)間影響最為顯著，故后續(xù)研究中重點(diǎn)對(duì)Sit-S的抗抑郁作用進(jìn)行考察。

2.6 Sit-S抗抑郁有效劑量的篩選

分別另取2批小鼠（每批48只），均隨機(jī)分為空白對(duì)照組（10%丙二醇溶液）和Sit-S不同劑量組（0.5、1、2、4、6 mg/kg，以10%丙二醇溶液為溶劑制備），每組8只。各組小鼠均腹腔注射給藥，給藥體積均為1.0 mL。給藥1 h后，各取1批小鼠分別進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)和自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)[18]。（1）懸尾實(shí)驗(yàn)：方法同“2.5”項(xiàng)下，測(cè)定各組小鼠的不動(dòng)時(shí)間。（2）自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)：將小鼠放置于小鼠自主活動(dòng)測(cè)試儀器中，觀察每只小鼠在黑暗、安靜的環(huán)境中的自發(fā)運(yùn)動(dòng)活性。在小鼠適應(yīng)3 min后，觀察并記錄其在后續(xù)4 min內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)。按照“2.5”項(xiàng)下統(tǒng)計(jì)學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。各組小鼠的不動(dòng)時(shí)間和4 min內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)測(cè)定結(jié)果見表2。

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，2、4、6 mg/kg Sit-S組小鼠的不動(dòng)時(shí)間均顯著縮短（P<0.05或P<0.01），而4 min內(nèi)的活動(dòng)次數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。這提示，2、4、6 mg/kg劑量下，Sit-S具有較好的抗抑郁作用，并且不會(huì)影響小鼠的自主活動(dòng)，其中以4 mg/kg劑量的效果最好，故本項(xiàng)目組后續(xù)選擇此劑量進(jìn)行作用機(jī)制研究。

2.7 Sit-S抗抑郁作用的機(jī)制研究

將剩余40只小鼠隨機(jī)分為空白對(duì)照組（10%丙二醇溶液）、Sit-S組（4 mg/kg，以10%丙二醇溶液為溶劑制備）、荷包牡丹堿+Sit-S組[4 mg/kg荷包牡丹堿（競(jìng)爭(zhēng)性GABA 拮抗劑）+4 mg/kg Sit-S]、阿戈美拉汀+Sit-S組[40 mg/kg阿戈美拉汀（5-HT和5-HT 2C受體拮抗劑）+4 ?mg/kg Sit-S]、氟哌啶醇+Sit-S組[0.2 mg/kg氟哌啶醇（非選擇性D2受體拮抗劑）+4 mg/kg Sit-S]，每組8只。3種拮抗劑的給藥劑量均按照臨床成人用量換算而得。各組小鼠均腹腔注射給藥，給藥體積均為1.0 mL。給藥60 min后，按“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行懸尾實(shí)驗(yàn)，測(cè)定其不動(dòng)時(shí)間。懸尾實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將小鼠脫頸處死，于無(wú)菌操作臺(tái)上取出其腦組織，用生理鹽水沖洗干凈，稱質(zhì)量，并加入約9倍體積（mL/g）的生理鹽水，勻漿，然后以10 000 ?r/min離心10 min，取上清液，在-80 ℃條件下凍存，待測(cè)。采用ELISA法測(cè)定小鼠腦組織中5-HT、DA、GABA水平，具體操作嚴(yán)格按照相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。按照“2.5”項(xiàng)下方法進(jìn)行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。各組小鼠不動(dòng)時(shí)間和腦組織中5-HT、DA、GABA水平測(cè)定結(jié)果見表3。

結(jié)果顯示，與空白對(duì)照組比較，Sit-S組小鼠的不動(dòng)時(shí)間顯著縮短（P<0.01），腦組織中5-HT、DA、GABA水平顯著升高（P<0.05或P<0.01）。與Sit-S組比較，3種抑制劑聯(lián)用組小鼠的不動(dòng)時(shí)間均有一定延長(zhǎng)，其中阿戈美拉汀+Sit-S組、氟哌啶醇+Sit-S組的不動(dòng)時(shí)間顯著延長(zhǎng)（P<0.05），并且阿戈美拉汀+Sit-S組的5-HT水平、氟哌啶醇+Sit-S組的DA水平和荷包牡丹堿+Sit-S組的GABA水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。

3 討論

本研究以百花花楸干燥成熟果實(shí)為材料，經(jīng)過75%乙醇和20%KOH溶液提取，并經(jīng)萃取、結(jié)晶得到了Sit。為提高Sit 的生物利用度和藥理活性，本項(xiàng)目組對(duì)Sit進(jìn)行了衍生化，最終得到了Sit-T、Sit-P、Sit-Sr、Sit-S等4種酯類衍生物，并通過NMR和IR法驗(yàn)證了各衍生物的結(jié)構(gòu)。同時(shí)，采用懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)對(duì)Sit及其衍生物的抗抑郁活性進(jìn)行了篩選。結(jié)果表明，Sit的水楊酸酯衍生物Sit-S（4 mg/kg）可顯著縮短懸尾實(shí)驗(yàn)和強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn)中的小鼠不動(dòng)時(shí)間，表現(xiàn)出優(yōu)良的抗抑郁活性。此外，為了排除小鼠不動(dòng)時(shí)間的減少是由于藥物對(duì)其運(yùn)動(dòng)能力的影響所致，本研究還進(jìn)行了小鼠自發(fā)運(yùn)動(dòng)能力測(cè)試實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示Sit-S不影響小鼠的自發(fā)活動(dòng)。

5-HT不但可以與腦組織中的其他中樞神經(jīng)相互作用，參與機(jī)體對(duì)外界刺激的適應(yīng)和調(diào)節(jié)，而且也是情緒、睡眠和其他生理活動(dòng)的重要調(diào)節(jié)因子，5-HT水平的增加對(duì)抑郁癥的恢復(fù)具有積極的作用[19-21]。本研究發(fā)現(xiàn)，Sit-S給藥后可明顯升高小鼠腦組織中5-HT水平，但聯(lián)用阿戈美拉?。?-HT受體拮抗劑）后，可以有效逆轉(zhuǎn)Sit-S的這種作用，表明Sit-S可通過5-HT途徑發(fā)揮其抗抑郁作用。DA受體廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，其中D2受體是DA參與抑郁生物調(diào)控的重要物質(zhì)，在抑郁癥的發(fā)生和恢復(fù)中也起著至關(guān)重要的作用[22-24]。有研究表明，重癥抑郁患者的下丘腦組織中DA含量極少，給予抗抑郁藥物治療后，其DA水平開始上調(diào)，同時(shí)功能也趨于正常[25]。本研究發(fā)現(xiàn)，給予Sit-S后可顯著升高小鼠腦組織中DA水平，但聯(lián)用氟哌啶醇（非選擇性D2受體拮抗劑）后，能明顯消除Sit-S的抗抑郁作用。該結(jié)果證實(shí)了Sit-S的抗抑郁作用是由D2受體的激活所引起的。GABA是神經(jīng)元傳遞信息電路中重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，當(dāng)其與GABA受體（GABARs）結(jié)合后，會(huì)促進(jìn)電路中Cl-流出、Ca2+流入，從而強(qiáng)化神經(jīng)元樹突生長(zhǎng)和突觸發(fā)生，這一功能保證了細(xì)胞間興奮性信息的成功傳遞[26-27]。因此，補(bǔ)充GABA含量可以有效減輕抑郁癥。本研究發(fā)現(xiàn)，給予Sit-S后可顯著升高小鼠腦組織中GABA水平，而聯(lián)用荷包牡丹堿（抑制性神經(jīng)遞質(zhì) GABA拮抗劑）后，可一定程度上逆轉(zhuǎn)Sit-S的抗抑郁作用，但是作用不顯著。該結(jié)果提示Sit-S的抗抑郁樣作用可能部分由GABA能系統(tǒng)介導(dǎo)的。

綜上，本研究成功從百花花楸果實(shí)中分離、制備了Sit，并合成了4種酯類衍生物。其中，Sit與水楊酸經(jīng)羧合反應(yīng)得到的酯類衍生物Sit-S具有良好的抗抑郁活性，其作用機(jī)制可能是通過提高腦組織中5-HT、DA和GABA水平所介導(dǎo)的。

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