柴胡桂枝湯揮發(fā)油的GC-MS分析及對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞體外增殖的抑制作用研究

文冉 李壯壯 杜以晴 楊勇 容蓉 呂青濤

摘 要 目的：研究復(fù)方柴胡桂枝湯揮發(fā)油的組成成分，并評(píng)價(jià)其對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞體外增殖的抑制作用。方法：根據(jù)2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2204揮發(fā)油測(cè)定法中甲法提取柴胡桂枝湯中的揮發(fā)油。采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法（GC-MS）結(jié)合Kováts指數(shù)分析其揮發(fā)油成分，并采用峰面積歸一化法計(jì)算各成分的相對(duì)含量。以不同質(zhì)量濃度順鉑（4、8、16、32、64 mg/L）為陽(yáng)性對(duì)照，采用MTT法檢測(cè)不同質(zhì)量濃度柴胡桂枝湯揮發(fā)油（25、50、100、200、400 mg/L）作用48 h后對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的抑制作用;另設(shè)陰性對(duì)照組（加細(xì)胞但不加藥物）。結(jié)果：從揮發(fā)油中共分離出71個(gè)成分，鑒定出其中59個(gè)成分，其峰面積之和占總峰面積的84.99%。其中，相對(duì)含量較高的成分為芳姜黃烯（17.65%）、β-甜沒(méi)藥烯（9.57%）、β-羅勒烯（7.05%）、α-姜黃烯（5.35%）、 ?2，5-二甲基苯甲醛（4.24%）、異丁酸芳樟酯（2.70%）、α-雪松烯（2.48%）、δ-杜松烯（2.07%）。與陰性對(duì)照組比較，4～64 mg/L順鉑組和25～400 mg/L柴胡桂枝湯揮發(fā)油組細(xì)胞的增殖率均顯著降低（P<0.05）;順鉑和柴胡桂枝湯揮發(fā)油對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的半數(shù)抑制濃度分別為10.150、73.526 mg/L。結(jié)論：柴胡桂枝湯揮發(fā)油中主要以芳姜黃烯、β-甜沒(méi)藥烯、β-羅勒烯、α-姜黃烯等成分為主，其對(duì)A549細(xì)胞的體外增殖具有一定的抑制作用。

關(guān)鍵詞 柴胡桂枝湯;揮發(fā)油;氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法;Kováts指數(shù);人肺腺癌A549細(xì)胞

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To study the composition of the volatile oil from Compound chaihu guizhi decoction， and to evaluate its in vitro anti-proliferative activity on human lung adenocarcinoma A549 cells. METHODS： The volatile oil from Chaihu guizhi decoction was extracted according to the steam distillation method of general rules 2004 in the 2015 edition of Chinese Pharmacopoeia （part Ⅳ）. The volatile oil components were analyzed by GC-MS combined with Kováts index， and the relative content of each component was calculated by peak area normalization method. Using different concentrations of cisplatin （4， 8， 16， 32， 64 mg/L） as positive control， MTT assay was used to detect the inhibitory effects of different concentrations of volatile oil from Chaihu guizhi decoction （25， 50， 100， 200， 400 mg/L） on in vitro proliferation of A549 cell after 48 h of treatment. Negative control group （with cells but without drugs） was set up. RESULTS： A total of 71 chemical components were isolated from the volatile oil， among which there were 59 compounds identified， sum of peak areas accounting for 84.99% of the total peak area. The compounds with relatively high content included ar-curcumene （17.65%）， β-bisabolene （9.57%）， β-ocimene （7.05%）， α-curcumene （5.35%）， 2，5-dimethylbenzaldehyde （4.24%）， linalyl isobutyrate （2.70%）， α-cedrene （2.48%）， δ-cadinene （2.07%）. Compared with negative control group， the proliferation rate of cells were decreased significantly in 4-64 mg/L cisplatin groups and 25-400 mg/L volatile oil from Chaihu guizhi decoction groups （P<0.05）. IC50 of cisplatin and volatile oil from Chaihu guizhi decoction to in vitro proliferation of A549 cells were 10.150 and 73.526 mg/L. CONCLUSIONS： The volatile oil from Chaihu guizhi decoction mainly includes ar-curcumene， β-bisabolene， β-ocimene， α-curcumene， which shows certain inhibitory effect on ?in vitro proliferation of A549 cells.

KEYWORDS ? Chaihu guizhi decoction; Volatile oil; GC-MS; Kováts index; Human lung adenocarcinoma A549 cells

柴胡桂枝湯出自《傷寒論》，為東漢末年中醫(yī)名家張仲景創(chuàng)立的經(jīng)典方劑，由小柴胡湯和桂枝湯加減而來(lái)，全方由柴胡、桂枝、黃芩、人參、甘草、半夏、生姜、芍藥、大棗共9味中藥組成[1]。隨著人們對(duì)經(jīng)方的深入研究，發(fā)現(xiàn)柴胡桂枝湯在現(xiàn)代臨床可用于治療呼吸系統(tǒng)類、神經(jīng)系統(tǒng)類、消化系統(tǒng)類和運(yùn)動(dòng)系統(tǒng)類等疾病，如其在感冒[2]、失眠[3]、抑郁癥[4]、功能性消化不良[5]、頸椎病[6]等的治療中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)。另有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，柴胡桂枝湯中桂枝的揮發(fā)性成分桂皮醛聯(lián)合熱療，可通過(guò)調(diào)控活性氧和絲裂原活化蛋白激酶家族來(lái)誘導(dǎo)非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞的凋亡[7];生姜中的8-姜辣素可通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子/細(xì)胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶通路來(lái)調(diào)節(jié)結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖和遷移[8]，而生姜中的6-姜辣素可通過(guò)誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯、活性氧的產(chǎn)生和線粒體膜電位的破壞從而促進(jìn)人胃癌（AGS）細(xì)胞的凋亡[9]。由此可見(jiàn)，柴胡桂枝湯揮發(fā)油的單一成分具有一定的抗癌藥效。那么，柴胡桂枝湯揮發(fā)油是否具有體外抗癌作用值得探究，加之目前針對(duì)柴胡桂枝湯揮發(fā)油組成的基礎(chǔ)研究較少，故本研究采用氣相色譜-質(zhì)譜法（GC-MS）對(duì)柴胡桂枝湯揮發(fā)油的成分進(jìn)行分析，結(jié)合Kováts指數(shù)（KI值）對(duì)揮發(fā)油組分進(jìn)行準(zhǔn)確定性，為柴胡桂枝湯揮發(fā)油組成成分的研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)評(píng)價(jià)該揮發(fā)油對(duì)人肺腺癌A549細(xì)胞體外增殖的抑制作用，旨在為柴胡桂枝湯的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7000B型三重四極桿GC-MS聯(lián)用儀（美國(guó)Agilent公司）;AE240型十萬(wàn)分之一電子天平（瑞士Mettler Toledo公司）;立式壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠）;熱電Thermo MK3酶標(biāo)儀（上海賽默飛生物有限公司）;HF90型CO2恒溫培養(yǎng)箱（上海力申科學(xué)儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

柴胡（批號(hào)：17090609）、桂枝（批號(hào)：17092603）、黃芩（批號(hào)：17041516）、甘草（批號(hào)：17082005）、生姜（批號(hào)：17030803）、人參（批號(hào)：17031503）、大棗（批號(hào)：17052411）、半夏（批號(hào)：17071501）、白芍（批號(hào)：17072801）等飲片均購(gòu)自山東省中醫(yī)院，由山東中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院李峰教授鑒定均符合2015年版《中國(guó)藥典》（一部）標(biāo)準(zhǔn);注射用順鉑（山東齊魯制藥有限公司，批號(hào)：H37021358，規(guī)格：20 mg）;正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品C8～C36（美國(guó)Sigma-Aidrich公司，批號(hào)：11521014，純度：≥98%）;MTT試劑（江蘇凱基生物技術(shù)有限公司，批號(hào)：14069927）;胎牛血清（FBS，美國(guó)HyClone公司，批號(hào)：LT22906）;DMEM高糖培養(yǎng)基（美國(guó)Gibco公司，批號(hào)：8118192）;二甲基亞砜（DMSO，北京索萊寶科技有限公司，批號(hào)：6768521）;其余試劑均為分析純，水為自制雙蒸水。

1.3 細(xì)胞

人肺腺癌細(xì)胞株A549購(gòu)自山東省中醫(yī)院。

2 方法

2.1 柴胡桂枝湯揮發(fā)油的提取

取柴胡桂枝湯處方10倍量的藥材，粉碎后過(guò)三號(hào)篩，加入8倍質(zhì)量水，按2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2204揮發(fā)油測(cè)定法中甲法[10]提取該復(fù)方中的揮發(fā)油。加熱回流提取8 h后，冷卻，收集揮發(fā)油，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，稱質(zhì)量并計(jì)算其得率（揮發(fā)油質(zhì)量/藥材總質(zhì)量×100%）為1.12%。

2.2 溶液的制備

2.2.1 揮發(fā)油樣品溶液 取揮發(fā)油樣品適量，用三氯甲烷稀釋成質(zhì)量濃度為65 g/L的溶液（以揮發(fā)油質(zhì)量計(jì)），作為樣品溶液，待GC-MS進(jìn)樣分析。

2.2.2 正構(gòu)烷烴C8～C36標(biāo)準(zhǔn)品溶液 取正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品C8～C36適量，加三氯甲烷稀釋成5 mg/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，待GC-MS進(jìn)樣分析。

2.2.3 體外增殖試驗(yàn)揮發(fā)油母液 取揮發(fā)油樣品適量，用DMSO稀釋，制備成質(zhì)量濃度為35 g/L（以揮發(fā)油質(zhì)量計(jì)）的溶液，作為體外抗增殖試驗(yàn)的母液。

2.3 柴胡桂枝湯揮發(fā)油的GC-MS分析

2.3.1 GC條件 石英毛細(xì)管色譜柱：Agilent HP-5 MS（250 μm×0.25 μm，30 m）;載氣：氦氣（純度為99.999%）：載氣流速：1.0 mL/min;載氣壓力：7.652 2 psi;隔膜吹掃速率：1 mL/min;進(jìn)樣口溫度：250 ℃;升溫程序：初始溫度100 ℃并保持10 min，以2 ℃/min速率升至150 ℃并保持15 min，再以2 ℃/min速率升至280 ℃并保持18 min;進(jìn)樣量：1.0 μL;分流比：20 ∶ 1;溶劑延遲時(shí)間：3 min。

2.3.2 MS條件 離子源：電子轟擊源（EI）;離子源溫度：230 ℃;電離能量：70 eV;傳輸線溫度：280 ℃;掃描范圍：質(zhì)荷比（m/z）35～1 000。

2.3.3 樣品分析 在全掃描（SCAN）檢測(cè)模式下，分別取“2.2.1”項(xiàng)下?lián)]發(fā)油樣品溶液和“2.2.2”項(xiàng)下正構(gòu)烷烴C8～C36標(biāo)準(zhǔn)品溶液，按“2.3.1”“2.3.2”項(xiàng)下條件進(jìn)樣分析，記錄總離子流圖。根據(jù) Vanden Dool 和 Kratz 線性程序升溫的KI原理，利用公式求得各成分的KI值[KI=100n+100（tx-tn）/（tn+1-tn），式中n為碳原子數(shù)，tx為被分析組分x的保留時(shí)間，tn、tn+1分別為碳原子數(shù)為n和n+1的正構(gòu)烷烴標(biāo)準(zhǔn)品的保留時(shí)間]，并與NIST 11質(zhì)譜庫(kù)中檢索得到的KI值進(jìn)行比對(duì)，從而對(duì)揮發(fā)油成分進(jìn)行定性分析，最后通過(guò)峰面積歸一化法計(jì)算各組分的相對(duì)含量。

2.4 柴胡桂枝湯揮發(fā)油對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的抑制作用考察

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的A549細(xì)胞制備成5×104個(gè)/mL的單細(xì)胞懸液，以100 μL/孔接種于96孔培養(yǎng)板中（取2塊培養(yǎng)板，分別用來(lái)考察順鉑和柴胡桂枝湯揮發(fā)油的體外增殖抑制作用），將細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h待細(xì)胞貼壁后，棄上清，然后將細(xì)胞分為順鉑組、柴胡桂枝湯揮發(fā)油組（分別用1塊板），試驗(yàn)均設(shè)陰性對(duì)照組。順鉑組分別添加含10%FBS和不同質(zhì)量濃度順鉑（4、8、16、32、64 mg/L，劑量參考文獻(xiàn)[11]設(shè)置）的DMEM培養(yǎng)基，柴胡桂枝湯揮發(fā)油組分別添加含10%FBS和不同質(zhì)量濃度揮發(fā)油（25、50、100、200、400 mg/L，以揮發(fā)油質(zhì)量計(jì)，劑量由前期試驗(yàn)摸索得出）的DMEM培養(yǎng)基，陰性對(duì)照組僅加入含10%FBS和0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基（記為0 mg/L組），并另設(shè)不含細(xì)胞但加入含10%FBS和0.1%DMSO的DMEM培養(yǎng)基的空白對(duì)照組，每組均設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。加藥后，將各組細(xì)胞置于37 ℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，再在每孔避光加入MTT溶液（5 mg/mL）10 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清;每孔加入DMSO溶液150 μL，于搖床上振搖15 min，采用酶標(biāo)儀測(cè)定490 nm波長(zhǎng)處各孔的吸光度（A），計(jì)算各組細(xì)胞的增殖抑制率[增殖抑制率=（A陰性對(duì)照- ?A揮發(fā)油）/（A陰性對(duì)照-A空白對(duì)照）×100%]，并采用GraphPad Prism 7.00軟件計(jì)算藥物的半數(shù)抑制濃度（IC50）。試驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。試驗(yàn)數(shù)據(jù)用x±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 柴胡桂枝湯揮發(fā)油成分的GC-MS分析結(jié)果

在柴胡桂枝湯揮發(fā)油中共分離出71個(gè)成分，通過(guò)質(zhì)譜庫(kù)檢索和人工圖譜解析，并結(jié)合KI值比對(duì)，初步鑒定了其中59個(gè)揮發(fā)性成分，占揮發(fā)油總峰面積的84.99%，包括烯烴類成分（序號(hào)1～18的化合物）的相對(duì)含量總和為51.47%、醛類成分（序號(hào)19～33的化合物）的相對(duì)含量總和為13.62%、醇類成分（序號(hào)34～43的化合物）的相對(duì)含量總和為5.29%、酯類成分（序號(hào)44～49的化合物）的相對(duì)含量總和為6.68%、酸類成分（序號(hào)50～53的化合物）的相對(duì)含量總和為2.14%、酚類成分（序號(hào)54～55的化合物）的相對(duì)含量總和為0.77%、其他類成分（序號(hào)56～59的化合物）的相對(duì)含量總和為5.03%。其中，含量較高的化合物為芳姜黃烯（17.65%）、β-甜沒(méi)藥烯（9.57%）、β-羅勒烯（7.05%）、α-姜黃烯（5.35%）、2，5-二甲基苯甲醛（4.24%）、異丁酸芳樟酯（2.70%）、α-雪松烯（2.48%）、δ-杜松烯（2.07%）。正構(gòu)烷烴混合標(biāo)準(zhǔn)品總離子流圖見(jiàn)圖1，柴胡桂枝湯揮發(fā)油總離子流圖見(jiàn)圖2，柴胡桂枝湯揮發(fā)油成分鑒定和相對(duì)含量測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

3.2 柴胡桂枝湯揮發(fā)油對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的抑制作用

與陰性對(duì)照組比較，順鉑不同質(zhì)量濃度組和柴胡桂枝湯揮發(fā)油不同質(zhì)量濃度組細(xì)胞的增殖抑制率均顯著升高（P<0.05），且均呈一定的濃度依賴趨勢(shì)。經(jīng)計(jì)算，順鉑和柴胡桂枝湯揮發(fā)油對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的IC50分別為10.150、73.526 mg/L。各組細(xì)胞的體外增殖抑制率測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

4 討論

柴胡桂枝湯由9味中藥組成，化學(xué)構(gòu)成復(fù)雜，其揮發(fā)油中同系物及同分異構(gòu)體眾多，單憑質(zhì)譜檢索數(shù)據(jù)庫(kù)無(wú)法達(dá)到較高匹配度。KI值是一種重現(xiàn)性較好的定性參數(shù)，僅與固定相的性質(zhì)、柱溫有關(guān)[12]。黃慶暉等[13]采用超臨界流體萃取法提取柴胡桂枝湯中的揮發(fā)油，依靠質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)鑒定出揮發(fā)油中28種成分，占揮發(fā)油總成分的85%。本研究采用2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則2204揮發(fā)油測(cè)定法中甲法提取柴胡桂枝湯中的揮發(fā)油，采用GC-MS法測(cè)定并結(jié)合KI值對(duì)揮發(fā)油組分進(jìn)行定性分析，共鑒定出了其中59個(gè)成分，其峰面積之和占總峰面積的84.99%。相比之下，本研究更能夠?qū)]發(fā)油中更多組分進(jìn)行表征。雖然超臨界流體萃取法與傳統(tǒng)提取方法相比，不殘留有機(jī)溶劑、萃取速度快，但其局限性為設(shè)備造價(jià)高、對(duì)脂溶性成分溶解能力強(qiáng)、對(duì)水溶性成分溶解能力差。相比而言，按揮發(fā)油測(cè)定法中甲法提取揮發(fā)油的成本低廉，并且更貼近柴胡桂枝湯水煎服的用藥方式。

近年來(lái)，多采用放化療、靶向藥物等手段治療肺癌。順鉑是一種細(xì)胞周期非特異性的抗腫瘤藥物，同時(shí)也是目前應(yīng)用最廣泛的實(shí)體瘤治療藥物之一[14]，故本研究以順鉑為陽(yáng)性對(duì)照藥物來(lái)考察柴胡桂枝湯揮發(fā)油對(duì)A549細(xì)胞體外增殖的影響。本研究結(jié)果顯示，柴胡桂枝湯揮發(fā)油對(duì)A549細(xì)胞的體外增殖具有一定的抑制作用，該作用雖不及順鉑（IC50明顯高于順鉑），但考慮到順鉑在腫瘤的治療過(guò)程中易產(chǎn)生耐受現(xiàn)象，且對(duì)肝臟毒副作用大[15]，因此尋求有效、低毒的天然抗腫瘤藥物仍有重要意義。

從《傷寒論》首載柴胡桂枝湯，到現(xiàn)代臨床的古方新用，該方的適用范圍逐漸擴(kuò)大，其在神志病治療方面也得到了運(yùn)用[16]。目前有臨床報(bào)道稱，柴胡桂枝湯揮發(fā)油可能通過(guò)降低興奮性氨基酸/抑制性氨基酸的比值、增強(qiáng)自由基清除能力、阻止過(guò)氧化物生成以及減少一氧化氮（NO）神經(jīng)毒性來(lái)發(fā)揮抗癲癇作用[17-18]。柴胡桂枝湯揮發(fā)油組分較多，其中姜辣素類成分在柴胡桂枝湯揮發(fā)油定性分析結(jié)果中有體現(xiàn)且占比較大。有研究指出，柴胡桂枝湯揮發(fā)油中的姜辣素、單萜類、丁香酚等主要成分在抗氧化與抗癲癇過(guò)程中可能發(fā)揮了一定的作用[19]。并且，姜辣素能夠調(diào)節(jié)與癌癥有關(guān)的多種細(xì)胞信號(hào)通路，包括核因子κB（NF-κB）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子和轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）、激活蛋白1（AP-1）、β-連環(huán)蛋白、表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和促炎介質(zhì)腫瘤壞死因子α（TNF-α）、環(huán)氧合酶2（COX-2）等，發(fā)揮其體內(nèi)外抗癌作用[20]。據(jù)報(bào)道，在烏拉坦誘導(dǎo)的小鼠肺癌模型中，6-姜辣素可誘導(dǎo)小鼠肺組織中抗原重組蛋白1（MSR1）、脂肪酸受體蛋白36（CD36）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）的表達(dá)，升高肺泡細(xì)胞因子γ-干擾素（IFN-γ）和白細(xì)胞介素12（IL-12）的水平，降低IL-10和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1（TGF-β1）的水平，增加M1巨噬細(xì)胞比例，降低M2巨噬細(xì)胞比例，減少肺部腫瘤結(jié)節(jié)數(shù)和直徑，改善肺組織病理結(jié)構(gòu)異常[21]。由此也可推測(cè)，姜辣素類成分或?yàn)椴窈鹬珦]發(fā)油抑制肺癌細(xì)胞A549增殖的潛在活性成分之一。