瑞舒伐他汀抑制JNK1/2的活化對(duì)急性心力衰竭大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)、氧化應(yīng)激及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)①

韋迎娜 韓圣娜 周祥群 王 芳 劉尚軍 陽(yáng) 飛

(海南省第三人民醫(yī)院，三亞 572000)

心力衰竭(heart failure，HF)是各種心血管疾病的終末階段，同時(shí)也是死亡的最主要原因[1]。隨著老齡化加重，HF的發(fā)生率和死亡率不斷增加，但目前還沒有找到完全有效的避免和預(yù)測(cè)方式[2]。GARDNER等[3]研究表明，HF是一個(gè)復(fù)雜的、連鎖的動(dòng)態(tài)過程，在HF過程中，神經(jīng)激素和細(xì)胞因子在HF的病理生理機(jī)制中起重要作用，這些分子能對(duì)心臟和循環(huán)產(chǎn)生直接毒害作用，心肌損傷后細(xì)胞因子的連鎖激動(dòng)能對(duì)心臟血流動(dòng)力學(xué)及后期的心室重塑產(chǎn)生重要影響。HF患者體內(nèi)炎癥細(xì)胞因子發(fā)生紊亂，其表達(dá)水平的增高及抗炎癥細(xì)胞因子的不足可誘發(fā)心功能不全[4]。目前治療HF的藥物較多，瑞舒伐他汀(rosuvastatin，RST)是其中較為有效的藥物之一[5]。RST可通過降低炎癥細(xì)胞因子水平并誘導(dǎo)特異性抗炎癥細(xì)胞因子升高保護(hù)心肌功能，促進(jìn)心肌重構(gòu)[6]。但目前對(duì)RST通過抑制c-Jun氨基末端激酶1/2(c-jun N-terminal Kinase1/2，JNK1/2)的活化來(lái)調(diào)控心臟血流動(dòng)力學(xué)、氧化應(yīng)激及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制的研究較少。本文旨在研究RST抑制JNK1/2的活化對(duì)急性HF大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)、氧化應(yīng)激及免疫應(yīng)答的影響，以期了解RST抑制JNK1/2的活化對(duì)急性HF大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)、氧化應(yīng)激及免疫應(yīng)答的調(diào)節(jié)機(jī)制，從而為急性HF的治療提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 SPF級(jí)3周齡大鼠100只，體重(200±30)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2017-0022，分20個(gè)籠子飼養(yǎng)，每個(gè)籠子5只。飼養(yǎng)于我院動(dòng)物中心實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2藥物與試劑 瑞舒伐他汀片(國(guó)藥準(zhǔn)字H20080670)購(gòu)自南京正大天晴制藥有限公司；超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、活性氧(reactive oxygen species，ROS)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)檢測(cè)試劑盒均自上海恒遠(yuǎn)生物科技有限公司；IL-1β試劑盒購(gòu)自上海紀(jì)寧酶聯(lián)科技有限公司；肌紅蛋白(myoglobin,Mb) 試劑盒購(gòu)自上海基免實(shí)業(yè)有限公司；誘生型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide species,iNOS)試劑盒購(gòu)自安徽大千生物；IL-6免疫組化試劑盒購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特有限公司；Caspase-3、Caspase-9抗體均購(gòu)自武漢華聯(lián)科有限公司；JNK1/2抗體購(gòu)自南京建成生物工程研究所；蘇木素、伊紅購(gòu)自武漢博士德生物有限公司；中性福爾馬林、酒精、二甲苯購(gòu)自天津科密歐有限公司。

1.1.3儀器 BS-124s 型電子天平購(gòu)自北京賽多斯儀器系統(tǒng)有限公司；TDL-5 型臺(tái)式離心機(jī)購(gòu)自上海安亭科學(xué)儀器廠；光學(xué)顯微鏡購(gòu)自東莞市同創(chuàng)儀器有限公司；切片機(jī)購(gòu)自德國(guó)Leica公司；低溫離心機(jī)購(gòu)自湖南恒諾離心機(jī)有限公司；蛋白電泳及轉(zhuǎn)膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Rad公司；彩色多普勒超聲診斷儀購(gòu)自飛利浦公司。

1.2方法

1.2.1建立模型 制作急性HF模型及判斷造模是否成功參考周彥希等[7]研究結(jié)果。具體操作如下：麻醉大鼠后，分離右頸總動(dòng)脈 1.5 cm，動(dòng)脈夾夾住近心端，經(jīng)頸動(dòng)脈朝近心端方向注入肝素鈉生理鹽水，使用鑷子夾住頸總動(dòng)脈及導(dǎo)管，將導(dǎo)管插入左室腔。當(dāng)大鼠血壓波變成下沿達(dá)0 mmHg 附近，表明導(dǎo)管已經(jīng)通過主動(dòng)脈瓣進(jìn)入左室腔內(nèi)，所有信號(hào)均同步記錄于生理記錄儀，記錄一段正常值后，各組于股靜脈注射鹽酸普羅帕酮注射液，注射劑量為16.5 mg/kg，當(dāng)左心室內(nèi)壓最大上升速率和內(nèi)壓最大下降速率降到正常值的 2/3 以下并維持 5 min 以上且無(wú)上升傾向時(shí)，可認(rèn)定造模成功。

1.2.2分組及藥物干預(yù) 將100只大鼠分為5組，每組20只，分別為健康對(duì)照組(Control)、模型組(Cardiac failure)、低濃度RST組(2.5 mg/kg)、中濃度RST組(5 mg/kg)、高濃度RST組(10 mg/kg)；RST用研缽研磨成粉末后按比例用生理鹽水配制成混懸液，每日早晨7:00按劑量灌胃，持續(xù)14 d；對(duì)照組灌胃給予等量生理鹽水。

1.2.3血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè) RST治療結(jié)束 24 h 后使用10%水合氯醛麻醉大鼠，彩色多普勒超聲儀檢測(cè)各組大鼠平均動(dòng)脈壓(mean artery pressure，MAP)、左室收縮壓(left ventricular systolic pressure，LVSP)以及心率(heart rate，HR)。

1.2.4ELISA檢測(cè)大鼠血清內(nèi)相關(guān)酶水平 從頸總動(dòng)脈插管接取2 ml大鼠血液，按照肌酸激酶(creatine kinase,CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、Mb、iNOS和IL-1β試劑盒說明書的操作方法，使用ELISA法檢測(cè)大鼠血清中各成分水平。

1.2.5HE染色觀察大鼠心肌損傷 HE染色觀察大鼠心肌損傷，常規(guī)脫水、染色、切片厚度為4～6 μm，×400倍光學(xué)顯微鏡下觀察大鼠心肌損傷情況。

1.2.6免疫組化檢測(cè)IL-6表達(dá) 取各組大鼠心肌組織樣本經(jīng)多聚甲醛固定后，做成組織切片，按照試劑盒說明書操作進(jìn)行IL-6免疫組化染色，步驟如下：將組織切片用二甲苯溶液以5 min/次浸泡2次后，梯度濃度乙醇水合，即依次在無(wú)水乙醇、95%、85%、70%乙醇中各浸泡5 min；PBS浸洗3次，加2滴3% H2O2-甲醇溶液孵育10 min，PBS清洗3次；加入血清封閉20 min，用一抗、二抗依次室溫孵育30 min，PBS清洗3次，DAB顯色、復(fù)染、脫水、封片，顯微鏡下觀察組織中蛋白表達(dá)。

1.2.7Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 10%SDS-PAGE提取總蛋白，半干法將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜，置于5%脫脂奶粉室溫封閉2 h后加入各需要檢測(cè)蛋白的一抗孵育過夜、二抗孵育2 h，TBS洗凈，以GAPDH為內(nèi)參蛋白，顯色液顯色后行吸光度分析，計(jì)算各蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS20.0軟件和GraphPda Prism5軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析作圖，方差分析使用單因素方差分析(ANOVA)，當(dāng)組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，進(jìn)一步采用SNK方法進(jìn)行比較；使用ANOVA時(shí)，P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，本研究所有檢驗(yàn)均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1大鼠心臟功能檢測(cè)結(jié)果 由圖1可知，相比于健康對(duì)照組，模型組大鼠MAP、LVSP、HR顯著降低(P<0.05)；相比于模型組，RST各組大鼠MAP、LVSP、HR水平呈劑量依賴性升高(P<0.05)。

2.2大鼠血清相關(guān)酶檢測(cè)結(jié)果 如圖2，相比于健康對(duì)照組，模型組大鼠CK、Mb、CK-MB水平顯著升高(P<0.05)；相比于模型組，RST各組大鼠CK、Mb、CK-MB水平呈劑量依賴性降低(P<0.05)。

2.3大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果 由圖3可知，相比于健康對(duì)照組，模型組大鼠ROS、MDA水平顯著升高，SOD水平顯著降低(P<0.05)；相比于模型組，RST組大鼠ROS、MDA水平呈劑量依賴性降低(P<0.05)，SOD水平呈劑量依賴性升高(P<0.05)。

2.4大鼠急性HF病理檢測(cè)結(jié)果 HE染色顯示，相比于健康對(duì)照組，模型組大鼠心肌細(xì)胞排列混亂，且死亡細(xì)胞較多；相比于模型組，RST組有較少的心肌細(xì)胞死亡，細(xì)胞排列較為整齊；RST組基本無(wú)死亡心肌細(xì)胞且排列較為整齊；高濃度RST組大鼠心肌細(xì)胞排列整齊且較為完整(圖4A)。相比于健康對(duì)照組，模型組大鼠IL-6陽(yáng)性率、IL-1β、iNOS水平顯著升高(P<0.05)；相比于模型組，RST組IL-6陽(yáng)性率、IL-1β、iNOS水平呈劑量依賴性降低(P<0.05，圖4B、C)。

圖1 大鼠心臟功能檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Test results of rat cardiac functionNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with Cardiac failure group,#.P<0.05.

2.5大鼠心肌組織內(nèi)相關(guān)凋亡因子水平檢測(cè)結(jié)果

圖2 大鼠血清相關(guān)酶檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Test results of serum related enzymes in ratsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with Cardiac failure group,#.P<0.05.

圖3 大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)檢測(cè)結(jié)果Fig.3 Test results of oxidative stress response in ratsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with Cardiac failure group,#.P<0.05.

圖4 大鼠急性HF病理檢測(cè)結(jié)果Fig.4 Pathological test results of acute HF in ratsNote:Compared with Control,*.P<0.05;compared with Cardiac failure group,#.P<0.05.

圖5 大鼠心肌組織內(nèi)相關(guān)凋亡因子水平檢測(cè)結(jié)果Fig.5 Test results of related apoptotic factors levels in rat myocardial tissuesNote:1.Control；2.Cardiac failure；3.RST(2.5 mg/kg)；4.RST(5 mg/kg)；5.RST(10 mg/kg).Compared with Control,*.P<0.05;compared with Cardiac failure group,#.P<0.05.

圖6 大鼠心肌組織內(nèi)JNK1/2磷酸化水平檢測(cè)Fig.6 Phosphorylation level detection of JNK1/2 activation in rat myocardial tissuesNote:1.Control；2.Cardiac failure；3.RST(2.5 mg/kg)；4.RST(5 mg/kg)；5.RST(10 mg/kg).Compared with Control,*.P<0.05;compared with Cardiac failure group,#.P<0.05.

由圖5可知，相比于健康對(duì)照組，模型組大鼠心肌組織內(nèi)Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)顯著升高(P<0.05)；相比于模型組，RST各組大鼠心肌組織內(nèi)Caspase-3、Caspase-9蛋白表達(dá)呈劑量依賴性降低(P<0.05)。

2.6大鼠心肌組織內(nèi)JNK1/2磷酸化水平檢測(cè) 相比健康對(duì)照組，模型組大鼠JNK1/2磷酸化水平顯著升高(P<0.05)；與模型組相比，低、中、高劑量RST組大鼠 JNK1/2磷酸化水平顯著降低(P<0.05)，見圖6。

3 討論

LVSP是心臟向動(dòng)脈射血的主要?jiǎng)恿Γ谛呐K舒張時(shí)內(nèi)壓降低，腔靜脈血壓回流入心臟，心臟每收縮和舒張1次構(gòu)成1個(gè)心動(dòng)周期[8]。1個(gè)心動(dòng)周期中動(dòng)脈血壓的平均值稱為MAP。心臟功能檢測(cè)結(jié)果顯示，RST處理后MAP、LVSP、HR顯著升高，說明RST可有效調(diào)節(jié)大鼠心臟的收縮和舒張，使大鼠HF得到有效緩解。閆志琳等[9]研究表明，他汀類藥物可有效調(diào)節(jié)心臟功能，與本研究結(jié)論一致。

氧化應(yīng)激是加重急性HF的重要原因之一[10]?？寡趸w系主要包括酶系和非酶系兩類，酶體系中， 最主要的是 SOD， 其含量可直接反映氧化應(yīng)激的程度[11]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，模型組大鼠體內(nèi)SOD含量顯著減少，說明大鼠心肌組織中氧化應(yīng)激反應(yīng)顯著增強(qiáng)。RST處理后，SOD含量顯著增加，提示其氧化應(yīng)激受到了抑制，且隨著RST處理濃度增加，SOD含量顯著升高，說明RST可呈劑量依賴性降低大鼠體內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)。趙高遠(yuǎn)等[12]研究表明，SOD可反映體內(nèi)氧化應(yīng)激能力的強(qiáng)弱，提高SOD濃度可有效抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，與本研究結(jié)論一致。李博萍等[13]研究表明，急性HF患者體內(nèi)過氧化產(chǎn)物如MAD含量增加，且會(huì)導(dǎo)致患者機(jī)體的抗氧化能力減弱，促使心肌細(xì)胞和線粒體膜受損，引起血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高，同時(shí)也會(huì)使心肌組織游離脂肪酸(FFAs)水平明顯升高，誘發(fā)細(xì)胞功能障礙[14]。MAD含量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，使自由基與生物膜中的多不飽和脂肪酸發(fā)生反應(yīng)并使氧化產(chǎn)物分解，提示MAD含量可間接反映細(xì)胞損傷程度[15]。血清中IL-6、iNOS水平與心肌炎癥呈正相關(guān)，心肌細(xì)胞炎癥越嚴(yán)重，則IL-6、iNOS水平越高，心肌細(xì)胞損傷的程度越高[16]。本研究表明，RST處理后IL-6、iNOS、IL-1β、iNOS水平顯著降低，說明RST可以有效降低大鼠心肌組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，緩解大鼠急性HF癥狀。高好考等[17]研究表明，他汀類藥物可調(diào)節(jié)心肌組織中的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，與本研究結(jié)論一致。

細(xì)胞凋亡是一種在形態(tài)學(xué)上和壞死完全不同的細(xì)胞死亡類型[18]。Caspase-3和Caspase-9是細(xì)胞中重要的凋亡因子。Caspase 家族中主要執(zhí)行凋亡的基因?yàn)镃aspase-3，這種有活性的 Caspase-3可通過剪切另外的 Caspase底物達(dá)到引起級(jí)聯(lián)反應(yīng)的目的最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[19]。本研究表明，RST處理后心肌組織中Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)顯著降低，說明RST可有效降低Caspase-3和Caspase-9蛋白表達(dá)。謝亞芹等[20]研究表明，RST可降低細(xì)胞內(nèi)凋亡因子表達(dá)，緩解細(xì)胞凋亡，與本研究結(jié)論一致。

JNK信號(hào)通路屬于 MAPK(mitogenactivated protein kinase)信號(hào)通路[21]。WANG等[22]研究表明，JNK 信號(hào)通路在調(diào)控急性HF中發(fā)揮重要作用。目前關(guān)于JNK 信號(hào)通路在調(diào)控急性HF的中主要存在以下方式：①通過炎癥因子激活JNK 信號(hào)通路。目前主要可以激活JNK信號(hào)通路的炎癥因子為IL-1和TGF-β，這些炎癥因子可以直接激活 TGF-β激酶 1，同時(shí)也可以通過激活Toll樣受體(包括TLR-3、TLR-4 和 TLR-9和 B 細(xì)胞、T 細(xì)胞受體)激活TGF-β，使JNK通路被激活；②王慧蓮等[23]研究表明，活性氧ROS可通過抑制 MAPK 磷酸酶獲得持續(xù)性的 JNK 通路激活。本研究發(fā)現(xiàn)，RST處理后心肌組織中p-JNK1/2和JNK1/2比值顯著降低，說明JNK1/2蛋白的磷酸化和JNK1/2的活化被抑制。提示RST可通過抑制JNK1/2的活化抑制大鼠心肌組織內(nèi)的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，緩解大鼠心肌細(xì)胞損傷。黃宏超等[24]研究表明，RST可通過抑制JNK通路緩解大鼠心肌細(xì)胞損傷，與本研究結(jié)論一致。

綜上所述，RST可抑制JNK1/2的活化，調(diào)節(jié)急性HF大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)及免疫應(yīng)答并抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，且在一定濃度范圍內(nèi)呈濃度依賴性，其作用機(jī)制可能與抑制JNK1/2磷酸化和促進(jìn)凋亡因子表達(dá)有關(guān)。但本研究設(shè)置的濃度梯度較少，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)中將進(jìn)一步增加濃度梯度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，研究不同濃度RST對(duì)急性HF大鼠心臟血流動(dòng)力學(xué)及免疫應(yīng)答并抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)。