利什曼原蟲感染樹突狀細胞早期基因表達差異分析及關鍵基因篩選①

余 鵬 宋詠剛 黃 卓 閔 海 黃江濤 張世超 陳 晉 胡祖權 王 赟 曾 柱

(貴州醫(yī)科大學基礎醫(yī)學院，貴陽 550025)

利什曼病是蟲媒介導的由利什曼原蟲感染引起的人畜共患病，主要分為內臟利什曼病(又稱黑熱病)、皮膚利什曼病以及皮膚黏膜利什曼病，其中以內臟利什曼病最為嚴重，主要表現為長期不規(guī)則發(fā)熱、脾臟腫大、貧血、消瘦、白細胞計數減少和血清球蛋白增加[1]。目前利什曼病的防治尚無有效措施，化療是唯一的治療方法，臨床一線藥物僅有以葡萄糖酸銻鈉為主的少數幾種，用藥成本高，且具有較為嚴重的以細胞毒性為主的副作用，導致治療效果不理想。多個疾病流行國家研究發(fā)現，原蟲耐藥性逐年提高是影響利什曼病治療的潛在不利因素[2]。關于利什曼病發(fā)病機制及其治療的研究中，研究人員嘗試采用細胞因子、免疫調節(jié)劑作用于免疫系統(tǒng)，激活Th1細胞反應，進而觸發(fā)免疫系統(tǒng)中各種免疫因子，發(fā)揮治療作用[3]。免疫治療有望成為治療利什曼病的重要方法[4]。

樹突狀細胞(dendritic cells,DCs)是目前已知功能最為強大的抗原提呈細胞(antigen presenting cells,APCs)，可向幼稚T細胞呈遞抗原激活免疫系統(tǒng)，從而誘導免疫應答，是連接天然免疫應答與適應性免疫應答的橋梁[5]。DCs在機體抗感染、抗腫瘤等免疫反應中發(fā)揮重要作用，在寄生蟲感染中的作用逐漸被重視。研究發(fā)現，利什曼原蟲可抑制DCs成熟并改變CCR7表達，從而干擾其遷移，并抑制DCs抗原提呈，下調DCs表面分子CD40、CD86、HLA-DR表達[6-8]。DCs對利什曼原蟲感染后機體免疫應答的產生發(fā)揮重要作用，DCs 的任何生物學行為信息都可能在臨床上開發(fā)出新的治療方法[9]。FAVILA等[10]研究發(fā)現，利什曼原蟲感染DCs 4 h后，DCs基因表達譜明顯變化，因此認為利什曼原蟲感染DCs 4 h是DCs啟動相應信號通路從而改變基因表達、啟動針對利什曼原蟲抗原提呈反應，進而影響機體免疫學功能的關鍵時期，早期DCs對病原體的識別捕獲對其免疫功能發(fā)揮以及后續(xù)啟動機體免疫應答具有重要意義。綜上，本研究采用生物信息學技術方法分析利什曼原蟲感染DCs早期相關差異表達基因(differentially expressed genes，DEGs)，篩選關鍵基因，探索DCs在感染早期的應答、相關信號通路及其分子機制，為尋找利什曼原蟲感染后基于DCs的免疫治療方法提供新的思路。

1 材料與方法

1.1數據來源 通過美國國家生物技術信息中心(National Center for Biotechnology Information， NCBI)的GEO數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)檢索并下載GSE42088芯片數據，比較分析利什曼原蟲感染DCs后4 h樣本數據與未感染組數據。

1.2方法

1.2.1差異基因分析 采用RStudio軟件對芯片原始數據進行標準化處理及歸一化處理。通過limma Package篩選，以顯著差異表達基因DEGs|log2FC|≥1且P<0.05為篩選標準進行統(tǒng)計學分析。

1.2.2蛋白質相互作用網絡(protein-protein interaction network,PPI)構建 采用STRING在線工具構建DEGs PPI，Cytoscape的“MCODE”插件對PPI結果進行K-核解析(K-core decomposition，KO)，以自帶算法篩選出DEGs。

1.2.3GO及KEGG功能富集分析 對DEGs核心模塊進行GO功能富集分析，采用RStudio軟件的Cluster Profiler Package進行數據統(tǒng)計和可視化呈現，以P<0.05且基因數>2為篩選標準。

2 結果

2.1差異基因分析 RStudio軟件對GSE42088芯片數據分析結果顯示，利什曼原蟲感染4 h前后DCs共有129個基因出現差異表達(|log2FC|≥1,P<0.05)，見圖1，其中上調基因49個，下調基因80個。按照|log2FC|大小分別從上調基因和下調基因中篩選變化倍數最大的10個基因，見表1、2。

2.2PPI及核心模塊分析 PPI結果見圖2。共分析出核心模塊中17個關鍵節(jié)點基因(圖3)，其中RSAD2、IFI44L、IFI44、IFIT3、IFIT2、IFIT5、MX1、IRF7、CMPK2與IFN表達調控相關，且在利什曼原蟲感染后表達上調(表3)。

2.3GO分析和KEGG富集分析 GO富集分析結果顯示有23個富集結果(圖4)，多數涉及病毒感染過程的相關細胞反應，包括對病毒的響應(GO∶0009615)、對病毒的防御反應等細胞反應(GO∶0051607)以及Ⅰ-IFN相關免疫反應(GO∶0060337、0071357、0034340)。KEGG富集分析結果顯示存在3個通路富集(圖5)，分別涉及甲型流感(hsa05164，圖6)、麻疹(hsa05162，圖7)及DNA復制(hsa03030)。

表1 利什曼原蟲感染早期DCs部分DEGs(上調基因)

表2 利什曼原蟲感染早期DCs部分DEGs(下調基因)

表3 核心模塊分析與IFN相關基因表達情況

圖1 差異基因分析聚類圖Fig.1 Cluster diagram of differential gene analysisNote:A.Experiment group;B.Control.Red represents up-regulated expression;green represents down-regulated expression.

圖2 差異表達蛋白PPI網絡Fig.2 PPI networks of differentially expressed proteins

圖3 核心模塊分析Fig.3 Core module analysis

圖4 DEGs GO富集分析Fig.4 GO enrichment analysis of DEGs

圖5 DEGs KEGG富集分析Fig.5 KEGG enrichment analysis of DEGs

圖6 KEGG富集分析-甲型流感Fig.6 KEGG enrichment analysis-Influenza A

圖7 KEGG富集分析-麻疹Fig.7 KEGG enrichment analysis-Measles

3 討論

WHO統(tǒng)計數據顯示，利什曼病全球每年約有70萬～100萬新發(fā)病例，死亡人數達2.6萬～6.5萬，主要集中于非洲東部地區(qū)、南美洲及東地中海地區(qū)[11]。目前利什曼病治療尚無特效藥。利什曼病治療藥物主要殺傷利什曼原蟲，如銻劑、米替福辛、巴龍霉素、兩性霉素B等，但總體療效并不理想[2，12-15]。隨著研究的深入，免疫治療有望成為攻克利什曼病的重要治療方式。GUPTA等[16]研究發(fā)現，利什曼原蟲感染機體后，會出現免疫逃逸行為，主要表現為通過阻止C5-C9膜攻擊復合物形成阻斷補體系統(tǒng)激活、改變TLR2/TLR4信號通路抑制細胞因子級聯反應、防止巨噬細胞內吞小體與溶酶體的融合、降低B7和CD40表達從而抑制T細胞抗寄生蟲效應、抑制JAK/STAT通路抑制巨噬細胞細胞因子激活信號激活以及改變細胞因子和趨化因子表達水平等。SCOTT等[3]發(fā)現，機體Th1/Th2平衡是利什曼病患者治療及預后的重要指標，通過細胞因子調節(jié)其平衡于利什曼病治療可能具有積極作用，且DCs在維持利什曼原蟲感染后機體Th1/Th2平衡中發(fā)揮重要作用[17]。通過改善感染后體內相應細胞因子水平、阻斷不利的信號途徑以及化療與免疫治療聯用等方式治療利什曼病已取得一定進展[18-19]。DCs作為目前已知體內功能最為強大的APCs，在抗細菌、抗病毒、抗寄生蟲感染機體的早期及抗感染免疫反應的整個過程中發(fā)揮重要作用。因此，闡明病原體感染過程對DCs生物學行為的影響有利于理解其免疫學過程發(fā)生發(fā)展，為基礎及臨床研究發(fā)掘出新的更有針對性的免疫療法提供參考。

本研究采用生物信息學技術方法篩選出利什曼原蟲感染DCs早期的差異基因，以期為準確理解該免疫學過程、尋找相關靶點、尋找利什曼原蟲感染的免疫治療方法提供思路。結果表明，感染前后共有129個基因出現差異表達(|log2FC|≥1,P<0.05)，其中上調基因49個，下調基因80個，進一步篩選出變化最為顯著的10個上調基因(IL12B、CXCL10、RSAD2、CSRP2、IFIT2、CMPK2、GALNT3、IFIT3、IFI44L、MX1)和10個下調基因(EGR3、NR4A2、EGR1、SNORD3、DEPTOR、MEF2C、LRRC25、DDIAS、CDCA7L、NUDT7)，其中IL12B、CXCL10差異最為顯著。IL12B是編碼IL12的亞單位，IL12主要由受抗原刺激的炎癥細胞(如DCs)產生，可作用于T細胞和NK細胞，具有廣泛的生物學活性，細菌、寄生蟲、真菌等病原體均是強有力的刺激因素。IL12誘導Th1細胞免疫應答，促進Th1類細胞因子如IFN-γ產生，又可抑制Th2類因子如IL-4、IL-13產生，從而抑制Th2細胞免疫應答，引發(fā)機體抗寄生蟲感染的免疫反應[20]。利什曼原蟲感染可刺激DCs產生IL12，且IL12可使機體免疫系統(tǒng)啟動Th1細胞介導的免疫反應[21-24]。由此猜測IL12B在利什曼原蟲感染DCs后IL12的產生過程中發(fā)揮重要作用，可能是潛在的治療靶點。CXCL10參與多種疾病的免疫調控過程，如腫瘤、自身免疫性疾病、感染性疾病等，主要參與T細胞趨化遷移，當DCs受到抗原刺激后分泌CXCL10，從而趨化效應T細胞向炎癥部位遷移，進而發(fā)揮免疫學效應[25-27]。在寄生蟲感染過程中，CXCL10對于維持T細胞免疫學功能具有重要作用[28]。CXCL10可降低宿主肝臟及脾臟的利什曼原蟲負載，抑制局部臟器感染加重，對感染宿主具有部分保護作用，但具體機制尚未明確[29-30]。最新研究發(fā)現，包括利什曼原蟲在內的多種病原體感染機體后可抑制CXCL10表達，引發(fā)免疫逃逸或免疫抑制反應，進而導致病原體與宿主免疫系統(tǒng)相互作用削弱以提高病原體存活率[31]。因此認為對抗CXCL10的抑制作用可能是針對病原體感染新的治療策略，值得進一步研究。

通過對篩選出的上下調DEGs進行PPI網絡構建，并篩選核心模塊，共分析出17個關鍵基因，其中RSAD2、IFI44L、IFI44、IFIT3、IFIT2、IFIT5、MX1、IRF7、CMPK2與IFN調控相關，且表達均上調。GO分析結果顯示DEGs涉及的生物學過程主要包括對病毒的防御反應(GO∶0051607)、對病毒的響應(GO∶0009615)、Ⅰ-IFN信號通路(GO∶0060337)、細胞對Ⅰ-IFN的反應(GO∶0071357)、對Ⅰ-IFN的反應(GO∶0034340)，說明利什曼原蟲感染DCs可引起強烈的免疫學效應，猜測利什曼原蟲感染可能呈現類似病毒感染的現象，抗病毒療法尤其是Ⅰ-IFN可能對利什曼原蟲感染有一定治療效果。IFN可分為3類：Ⅰ型、Ⅱ型、Ⅲ型，具有抗腫瘤、抗病毒等作用。既往研究認為Ⅱ型IFN主要參與抗寄生蟲感染，但隨著研究的深入，發(fā)現Ⅰ-IFN在機體抗錐蟲、瘧原蟲、弓形蟲、利什曼原蟲等原蟲感染中也發(fā)揮重要作用[32-35]。機體在利什曼原蟲感染過程中，可激活Ⅰ-IFN信號通路，且通過刺激DCs促進IFN-α和IFN-β表達[36-37]。利什曼原蟲感染后刺激DCs產生IL-12，該過程受Ⅰ-IFN信號通路調控[10]。動物實驗發(fā)現，給予感染利什曼原蟲的BALB/c小鼠低劑量IFN-β可使小鼠NK細胞活力得到一定恢復，并促進淋巴細胞增殖及IL-12產生[38]。綜上，猜測Ⅰ-IFN及Ⅰ-IFN信號通路介導的DCs IL12產生在抗利什曼原蟲感染過程中發(fā)揮重要作用。

KEGG分析富集到甲型流感通路(hsa05164)、麻疹感染通路(hsa05162)、DNA復制信號通路(hsa03030)，甲型流感通路及麻疹感染通路均與IL12密切相關，且2條通路均涉及TLR4/NF-κB調控。Toll樣受體(toll-like receptors,TLR)是單個跨膜非催化性蛋白質，屬于跨膜模式識別受體，參與機體非特異性免疫，是連接非特異性免疫和特異性免疫的橋梁，可識別病原體相關分子等外源性配體，激活機體免疫應答，廣泛存在于髓源性細胞、DCs、單核細胞等免疫細胞細胞膜與細胞器膜表面[39]。目前發(fā)現的13個TLR中，有9個與寄生蟲感染相關，分別為TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR6、TLR7、TLR9、TLR11和TLR12[40]。TLR信號通路涉及多種信號分子，包括MyD88、TRAF6 MAPKs、NF-κB、IRFs等[41]。針對利什曼原蟲感染，WHITAKER等[42]研究發(fā)現，可通過表面P8蛋白集落復合體激活免疫細胞膜表面TLR4，進而產生炎癥細胞因子和趨化因子。此外，TLR4還可通過識別利什曼原蟲的脂磷聚糖激活NF-κB，誘導TNF-α和趨化因子表達[43-44]。利什曼原蟲感染機體后，刺激DCs產生IL12也受NF-κB調控[21]。研究發(fā)現利什曼原蟲的糖基磷脂酰肌醇可激活TLR4，從而誘導IFN-α/β分泌，增強一氧化氮合酶表達并合成NO殺傷利什曼原蟲[45]。由此猜測，利什曼原蟲感染DCs可能通過甲型流感、麻疹通路影響TLR4表達，進而影響IL-12表達，且TLR4變化可能影響Ⅰ-IFN分泌。

本文采用生物信息學技術分析利什曼原蟲感染DCs的早期分子機制，以期為基礎和臨床研究提供新的思路。本研究結果提示利什曼原蟲感染早期差異表達最為顯著的基因為IL12B與CXCL10，IL12B的差異表達可影響IL12分泌，而CXCL10有望成為新的治療靶點。GO分析和KEGG分析結果顯示，IL12分泌受Ⅰ-IFN信號通路和TLR4/NF-κB信號通路影響，2條通路協同作用，由此猜測Ⅰ-IFN/IL12信號通路與TLR4/NF-κB/IL12信號通路可能成為利什曼原蟲感染治療的靶點。另一方面利什曼原蟲感染DCs后，根據富集分析結果猜測可能會出現類似病毒感染的現象，結合既往研究推測抗病毒免疫療法可能對利什曼原蟲感染具有一定療效。