肝爽顆粒浸膏減輕對(duì)乙酰氨基酚所致肝細(xì)胞損傷的作用機(jī)制

吳 橋，余朋飛，畢研貞，王寶增，王子璇，李志杰，陳 煜，段鐘平

1 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京佑安醫(yī)院 a.疑難肝病及人工肝中心, b.肝衰竭與人工肝治療研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100069； 2 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院 感染中心，北京 100070； 3 解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心肝膽外科中心，北京 100039

對(duì)乙酰氨基酚(N-乙?；?對(duì)氨基苯酚，APAP)是用于鎮(zhèn)痛和解熱的常用藥物,但過(guò)量服用時(shí)有很高的毒性，并可以導(dǎo)致急性肝衰竭[1-2]。在歐美國(guó)家，高劑量的APAP是藥物引起肝損傷的主要原因[3]。在中國(guó)，APAP誘發(fā)了約0.40%的藥物性肝損傷[4]。目前臨床治療藥物有限，其特效藥乙酰半胱氨酸治療窗狹窄，迫切需要尋找安全有效的治療藥物。APAP在體內(nèi)的代謝涉及肝臟Ⅰ相和Ⅱ相酶相關(guān)解毒途徑。在肝Ⅱ相結(jié)合酶[包括UDP-葡糖醛酸糖基轉(zhuǎn)移酶(UDP-glucosyltransferase，UGT)和磺基轉(zhuǎn)移酶(sulfotransferases，SULT)]的作用下大約85%的APAP被處理為APAP-gluc和APAP-sulfur，并通過(guò)尿液排出[4-5]。 目前廣泛認(rèn)為APAP的毒性產(chǎn)物N-乙?；?對(duì)苯醌亞胺(N-Acetyl-p-benzo-quinoneimine，NAPQI)主要是通過(guò)肝 Ⅰ 相反應(yīng)通過(guò)細(xì)胞色素P450(CYP)途徑(主要是通過(guò)CYP2E1/CYP1A2)產(chǎn)生的[4]。在APAP過(guò)量的情況下，Ⅱ相反應(yīng)變得飽和，但NAPQI的過(guò)量產(chǎn)生會(huì)耗盡肝谷胱甘肽(GSH)并修飾細(xì)胞蛋白。這破壞了氧化還原平衡，造成了線粒體損傷，從而導(dǎo)致氧化應(yīng)激引起的肝損傷[6]。

肝爽顆粒是臨床上常見(jiàn)的保肝藥物，主要功能為舒肝健脾、清熱散瘀、保肝護(hù)肝、軟堅(jiān)散結(jié)，用于急慢性肝炎、肝硬化、肝損傷。有前期研究[7-8]表明，肝爽顆粒對(duì)慢性肝損傷患者具有保護(hù)性作用，但其具體機(jī)制仍不清楚。目前，氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙被認(rèn)為是APAP肝細(xì)胞毒性的主要細(xì)胞過(guò)程，因此，抑制氧化應(yīng)激和改善線粒體功能在減輕APAP誘導(dǎo)的急性肝損傷中具有重要作用[9]。肝爽顆粒及其主要有效成分(柚皮苷)可以抗氧化及降低CYP2E1表達(dá)的作用[10-11]，據(jù)此筆者推測(cè)肝爽顆?？梢杂行Ц纳艫PAP引起的肝損傷。為此建立了體外APAP損傷的細(xì)胞模型(HepG2細(xì)胞)，驗(yàn)證肝爽顆粒的細(xì)胞保護(hù)作用及抗氧化作用，檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)[GSH、超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、活性氧(ROS)]，觀察肝爽顆粒對(duì)APAP代謝相關(guān)的Ⅰ相酶(CYP2E1/1A2)和Ⅱ相酶(UGT1A1/1A3/1A6/2B7、GSTα1/m1、SULT1A1/2A1)的影響，探討其對(duì)線粒體功能[線粒體膜電位、上清谷氨酸脫氫酶(GDH)]的影響，并進(jìn)一步對(duì)機(jī)制進(jìn)行研究，從而為臨床治療提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 胎牛血清(SH30406，Hyclone)，APAP(HY-66005，MCE)，0.25%EDTA-trypsin(25200056，Gibco)，肝爽顆粒浸膏(山東步長(zhǎng)制藥股份有限公司)，RIPA裂解液(R0010，Solarbio)、TRIzol試劑(15596018)、Image-iTTMTMRM Reagent (mitochondrial membrane potential indicator)(I34361)、Hoechst 33342(H3570)購(gòu)自Invitrogen，AMV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)(TakaRa，大連，中國(guó))、實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀器(Stepone plus，Applied Biosystems)，MDA測(cè)定試劑盒(TBA法)(A003-1)、ROS測(cè)定試劑盒(化學(xué)熒光法)(E004)、SOD測(cè)定試劑盒(WST-1 法)(A001-3)、GSH測(cè)定試劑盒(微板法)(A006-2)、GLDH/GDH測(cè)試盒(紫外比色法)(A125)購(gòu)自南京建成生物工程研究所。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組設(shè)置 本實(shí)驗(yàn)設(shè)置5組細(xì)胞培養(yǎng)組，分別為正常對(duì)照組、APAP損傷組、3組不同肝爽顆粒浸膏濃度的損傷保護(hù)組。使用20 mmol/L APAP加入細(xì)胞培養(yǎng)液孵育24 h構(gòu)建造體外藥物肝損傷模型，損傷保護(hù)組提前加用不同濃度肝爽顆粒浸膏(0.2 μg/ml、1 μg/ml、5 μg/ml)8 h孵育后加入APAP損傷24 h。

1.3 HepG2細(xì)胞培養(yǎng) HepG2細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基于37 ℃，濕度為95%，5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(購(gòu)自美國(guó) Thermo Forma公司)中培養(yǎng)。細(xì)胞貼壁85%～90%時(shí)用 EDTA-胰酶消化，細(xì)胞活率在90%以上進(jìn)行1∶4傳代培養(yǎng)。

1.4 體外細(xì)胞模型的建立 將HepG2 細(xì)胞以2×106/ml接種到6孔板中，每孔2 ml，培養(yǎng)24 h細(xì)胞全部貼壁后，分別設(shè)對(duì)照組、損傷組(20 mmol/L APAP)和3組損傷保護(hù)組，提前8 h分別換液加入：正常培養(yǎng)基、正常培養(yǎng)基、0.2 μg/ml肝爽浸膏、1 μg/ml肝爽浸膏、5μg/ml肝爽浸膏對(duì)損傷保護(hù)組進(jìn)行預(yù)保護(hù)，隨后換液加入：正常培養(yǎng)基(對(duì)照組)、20 mmol/L APAP(損傷組及損傷保護(hù)組)進(jìn)行干預(yù)處理。

1.5 MTT實(shí)驗(yàn) 將 HepG2 細(xì)胞以1×104/ml接種于96孔板，每孔100 μl，培養(yǎng)24 h，細(xì)胞全部貼壁后，按1.3步驟進(jìn)行造模后，加入MTT工作液，用多功能酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)細(xì)胞的存活率，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3遍。

1.6 GSH、SOD、MDA、ROS檢測(cè) 將細(xì)胞按1.3步驟干預(yù)后，棄上清，用PBS清洗1～2遍后，使用RIPA裂解液將細(xì)胞裂解下來(lái)，取上清，按檢測(cè)方法參照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗(yàn)步驟處理，用多功能酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞中MDA含量及 GSH、SOD、GDH活性。

1.7 高內(nèi)涵檢測(cè)線粒體膜電位 將細(xì)胞按1.3步驟干預(yù)后，棄上清，用HBSS清洗1～2遍后，將線粒體膜電位染料(Image-iT-TM TMRM Reagent)1∶1000加入HBSS，細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)孵育30 min 37 ℃，HBSS洗3遍，加普通培養(yǎng)基，后拍照，3 h后繼續(xù)拍照。

1.8 RT-PCR及Western Blot檢測(cè) RT-PCR：收集上述各組細(xì)胞，使用TRIzol試劑(Invitrogen，美國(guó))提取總RNA。使用隨機(jī)引物和AMV逆轉(zhuǎn)錄酶系統(tǒng)由1 μg RNA合成cDNA。使用ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)進(jìn)行SYBR Green實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄PCR。引物由上海生工公司合成(表1)。以管家基因GAPDH為內(nèi)參，用2-ΔΔCt法計(jì)算靶基因的相對(duì)表達(dá)。

表1 引物序列

Western Blot檢測(cè):收集上述各組細(xì)胞，提取細(xì)胞總蛋白，以BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度，每個(gè)樣品取34 μg蛋白，采用30%丙稀酰胺-甲叉雙丙稀酰胺凝膠電泳。用濕轉(zhuǎn)法，轉(zhuǎn)膜完成后麗春紅染色試劑對(duì)膜進(jìn)行染色，觀察轉(zhuǎn)膜效果。用5%BSA-TBST稀釋一單克隆抗體4 ℃搖動(dòng)孵育過(guò)夜。次日洗滌后孵育第二抗體，室溫?fù)u動(dòng)40 min，再用TBST洗脫3遍后發(fā)光液進(jìn)行化學(xué)顯色并拍照。

2 結(jié)果

2.1 肝爽顆粒浸膏對(duì)APAP引起的肝細(xì)胞毒性的影響 APAP組細(xì)胞活力明顯下降，經(jīng)肝爽顆粒浸膏預(yù)處理后，細(xì)胞活力得到改善，尤其1 μg/ml及5 μg/ml兩組與APAP組比較有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P值均<0.05)。加入APAP后細(xì)胞培養(yǎng)上清中的AST、ALT、LDH含量顯著上升，而肝爽顆粒浸膏的預(yù)處理組明顯下降，提示肝爽顆粒體外可以保護(hù)APAP引起的肝細(xì)胞損傷(P<0.05)(表2)。

表2 肝爽浸膏對(duì)APAP誘導(dǎo)的HepG2細(xì)胞急性損傷的影響

2.2 肝爽顆粒浸膏對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝臟氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響 與對(duì)照組相比，加入APAP導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)MDA、ROS水平顯著增加，GSH水平降低(P值均<0.05)，表明APAP引起了肝細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。APAP還將SOD活性水平降低了20%。肝爽顆粒浸膏預(yù)處理以劑量依賴(lài)性方式顯著阻止了APAP的所有作用(表3)。

表3 肝爽浸膏對(duì)APAP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

2.3 肝爽顆粒浸膏對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體損傷的影響 圖1使用高內(nèi)涵熒光實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞線粒體膜電位變化，可見(jiàn)3 h對(duì)照組熒光強(qiáng)度隨著細(xì)胞的增殖強(qiáng)度變強(qiáng)，而APAP損傷造成熒光強(qiáng)度降低，肝爽顆粒浸膏預(yù)處理以劑量依賴(lài)性方式增強(qiáng)了線粒體膜電位，保護(hù)了線粒體膜的穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步驗(yàn)證肝爽顆粒浸膏對(duì)線粒體損傷的保護(hù)作用，檢測(cè)了不同組別上清中GDH的含量，可見(jiàn)1 μg/ml及5 μg/ml肝爽顆粒浸膏處理組的GDH顯著下降(表4)。

表4 肝爽浸膏對(duì)APAP誘導(dǎo)的線粒體損傷的影響

2.4 肝爽顆粒浸膏對(duì)CYP2E1/1A2表達(dá)的影響 通過(guò)RT-PCR檢測(cè)CYP2E1/1A2 mRNA表達(dá)水平，觀察到單獨(dú)使用APAP可以提高CYP2E1/1A2 mRNA水平。而與此同時(shí)，1 μg/ml及5 μg/ml肝爽顆粒浸膏可以抑制CYP1A2表達(dá)，同時(shí)顯著抑制CYP2E1表達(dá)(表5)。

表5 肝爽浸膏對(duì)不同組別CYP2E1/1A2 mRNA表達(dá)水平的影響

2.5 肝爽顆粒浸膏對(duì)肝細(xì)胞Ⅱ相酶表達(dá)的影響 如圖2所示，Ⅱ相酶水平受最低劑量的肝爽顆粒浸膏影響。與對(duì)照組相比，單用APAP顯著下調(diào)了肝臟Ⅱ相酶的表達(dá)。同樣，肝爽顆粒浸膏以劑量依賴(lài)性方式使Ⅱ期酶的mRNA水平升高。 最終劑量為5 μg/ml的損傷保護(hù)組顯著選擇性地上調(diào)了Ⅱ期酶的靶基因，導(dǎo)致上調(diào)程度比對(duì)照組高785%、936%、1275%和725%分別為UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6和SULT2A1。

注：高內(nèi)涵監(jiān)測(cè)不同組別0、3 h后線粒體膜電位TRME強(qiáng)度。

注：與APAP組相比,*P<0.05，**P<0.001。

2.6 肝爽顆粒浸膏可以誘導(dǎo)Nrf2及其下游基因的表達(dá)

使用蛋白質(zhì)印跡法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)肝細(xì)胞系中Nrf2的表達(dá)。與對(duì)照組相比，在預(yù)處理組中，Nrf2的蛋白質(zhì)水平及mRNA水平顯示均展現(xiàn)出上升的趨勢(shì)(P值均<0.05)(圖3，表6)。 此外，與單獨(dú)的APAP組相比，1 μg/ml及5 μg/ml肝爽顆粒浸膏預(yù)處理組的GCLC及NQO-1(Nrf2的靶基因)mRNA水平的表達(dá)顯著增強(qiáng)(P值均<0.05)(表6)。

注：Western Blot檢測(cè)不同組別Nrf2蛋白水平表達(dá)結(jié)果。

3 討論

APAP誘導(dǎo)的肝損傷是發(fā)達(dá)國(guó)家急性肝衰竭的主要原因。由于現(xiàn)有的治療方法有限，因此迫切需要開(kāi)發(fā)新的治療方法。氧化應(yīng)激在APAP誘導(dǎo)的肝損傷中起到了至關(guān)重要的作用。在之前的文章報(bào)道中，肝爽顆粒已經(jīng)顯示出抗氧化的能力。根據(jù)現(xiàn)有研究，筆者以經(jīng)APAP處理的HepG2細(xì)胞為體外肝損傷模型進(jìn)行肝爽顆粒保護(hù)作用研究。APAP可被CYP2E1/1A2酶代謝為NAPQI，其可以與GSH發(fā)生化學(xué)和酶結(jié)合，這可能導(dǎo)致脂質(zhì)過(guò)氧化、硝化蛋白和隨后的線粒體損傷[12]。已有研究[13-14]表明，APAP過(guò)量可降低抗氧化酶活性，一些藥物已被證實(shí)可以恢復(fù)酶的部分功能。在本研究中，APAP使肝細(xì)胞內(nèi)GSH、SOD濃度減少，MDA、ROS濃度升高，這些都是氧化應(yīng)激的指標(biāo)。肝爽顆粒浸膏預(yù)處理的細(xì)胞組較APAP組抗氧化酶水平升高，ROS、MDA濃度降低。這些數(shù)據(jù)表明，肝爽顆粒浸膏可以提高抗氧化酶水平，從而對(duì)APAP誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)起到了保護(hù)作用。APAP可導(dǎo)致肝臟中CYP2E1/1A2表達(dá)增加，肝爽顆粒浸膏可顯著抑制CYP2E1/1A2的表達(dá)，減少了毒性代謝產(chǎn)物NAPQI的產(chǎn)生，同時(shí)也提高抗氧化酶的水平，這可能就是肝爽顆粒具有較強(qiáng)的抗氧化作用的原因。UGT、SULT和GST等 Ⅱ 相酶的催化代謝對(duì)于APAP無(wú)毒代謝有著重要作用，APAP在肝臟中經(jīng)歷 Ⅱ 期解毒途徑，約85%的APAP被包括UGT和SULT在內(nèi)的 Ⅱ 相肝酶以APAP-gluc和APAP-sulf的形式處理代謝掉[15]。在本研究中，有7種Ⅱ相酶(UGT1A1/1A3/1A6、SULT1A1/2A1、GSTα1/m1)參與了APAP的解毒，它們是UGT、SULT和GST的主要酶和主要亞型。本研究明確了大部分Ⅱ期酶mRNA的表達(dá)由肝爽顆粒浸膏調(diào)節(jié)呈劑量依賴(lài)性增加。同時(shí)，肝爽顆粒浸膏顯著提高了UGT1A9和SULT2A1的mRNA水平。本研究結(jié)果表明，Ⅱ相酶的調(diào)節(jié)可能參與了肝爽顆粒浸膏保護(hù)肝細(xì)胞損傷的機(jī)制。線粒體功能障礙在APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞毒性中起重要作用，最小化線粒體損傷和/或增強(qiáng)線粒體功能的治療可以提高APAP誘導(dǎo)的肝損傷中的肝細(xì)胞存活率和治療結(jié)果[9]。不同濃度的肝爽顆粒浸膏預(yù)處理組的線粒體膜電位得到了不同程度的恢復(fù)，線粒體損傷指標(biāo)GDH呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性下降。

Nrf2激活是誘導(dǎo)Ⅱ相酶表達(dá)的關(guān)鍵。Nrf2的重要性是非常明確的，有報(bào)道[16-17]顯示，在Nrf2缺陷小鼠中，Ⅱ相酶基因水平顯著降低。本研究結(jié)果顯示，肝爽顆粒浸膏顯著增加了SULT和UGT的水平。此外，有報(bào)道[18]表明，Nrf2缺失小鼠對(duì)APAP誘導(dǎo)的肝損傷表現(xiàn)出更高的易感性，這表明Nrf2是肝保護(hù)的一個(gè)靶點(diǎn)。Nrf2是一種CNC-bZIP蛋白，被認(rèn)為是氧化防御的主要調(diào)節(jié)因子。肝爽顆粒浸膏預(yù)處理誘導(dǎo)肝細(xì)胞組Nrf2蛋白水平和mRNA水平表達(dá)均有不同程度上調(diào)。有學(xué)者[19]發(fā)現(xiàn)，通過(guò)上調(diào)HepG2細(xì)胞的Nrf2來(lái)激活GCLC，GCLC是谷胱甘肽(細(xì)胞中主要的抗氧化劑分子)合成中的主要限速酶[20]。肝爽顆粒浸膏可增加Nrf2下游基因GCLC及NQO-1的mRNA水平的表達(dá)，導(dǎo)致GSH水平升高。上述結(jié)果表明，Nrf2參與了肝爽顆粒浸膏誘導(dǎo)的解毒和抗氧化信號(hào)通路。

表6 肝爽浸膏對(duì)Nrf2、GCLC及NQO-1 mRNA水平的影響

本研究認(rèn)為肝爽顆粒浸膏可通過(guò)兩種途徑預(yù)防APAP誘導(dǎo)的肝細(xì)胞損傷，第一種途徑是肝爽顆粒浸膏下調(diào)CYP2E1/1A2的表達(dá)，從而降低了APAP產(chǎn)生的有毒物質(zhì)NAPQI濃度；第二種途徑是肝爽顆粒浸膏上調(diào)解毒通路的表達(dá),它能激活Nrf2增加抗氧化酶(SOD、GSH)和Ⅱ相酶的表達(dá)，從而加速APAP的無(wú)害代謝。綜上所述，肝爽顆粒浸膏作為一種天然藥物的復(fù)合物，對(duì)APAP的解毒有著有益的影響，并通過(guò)Nrf2的激活，與CYP2E1活性的抑制以及抗氧化酶和Ⅱ期酶的上調(diào)有關(guān)?？傊嗡w粒是一種有希望用于治療APAP引起的肝損傷藥物。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員、受試者監(jiān)護(hù)人以及與公開(kāi)研究成果有關(guān)的利益沖突，特此聲明。

作者貢獻(xiàn)聲明：吳橋負(fù)責(zé)課題設(shè)計(jì)，資料分析，撰寫(xiě)論文；余朋飛負(fù)責(zé)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)、指標(biāo)檢測(cè)；畢研貞負(fù)責(zé)高內(nèi)涵檢測(cè)及ROS數(shù)據(jù)的采集；王寶增、王子璇、李志杰參與收集數(shù)據(jù)，修改論文；陳煜、段鐘平負(fù)責(zé)擬定寫(xiě)作思路，指導(dǎo)撰寫(xiě)文章并最后定稿。