控制性超促排卵高雌狀態(tài)對冷凍胚胎移植周期臨床結(jié)局的影響

魯 南，陳 華

(1 南京醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院生殖中心，南京 210029；2 上海市集愛遺傳與不育診療中心)

自1978 年世界上首例體外受精-胚胎移植(in vitro fertilization and embryo transfer,IVF-ET)的嬰兒誕生以來，人類輔助生殖技術(shù)(assisted reproductive technology,ART)不斷發(fā)展，為無數(shù)自然妊娠困難的夫婦帶來了生命的延續(xù)。目前全世界已積累了超過700 萬與ART 相關(guān)的女性及嬰兒[1]。但ART 技術(shù)可能帶來的健康風(fēng)險不容小覷。大量研究[2]顯示，ART技術(shù)將增高妊娠風(fēng)險。與自然妊娠相比，ART 技術(shù)孕婦的早產(chǎn)率、低出生體質(zhì)量兒(low birth weight,LBW)發(fā)生率、妊娠期并發(fā)癥的發(fā)生率顯著增高。

ART 對母嬰及子代健康的確切影響機(jī)制目前還在探討中。在IVF-ET 過程中，為了獲得更多的卵子從而獲得更多的胚胎，控制性超促排卵(controlled ovarian hyperstimulation,COH)周期中將應(yīng)用藥物對卵巢進(jìn)行刺激，從而導(dǎo)致患者血清高雌激素水平。高水平的血清雌激素造成的亞理想種植環(huán)境可能會影響妊娠結(jié)局，在新鮮移植周期中，人絨毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin,hCG)日雌二醇(estradiol,E2)＞2 500 pg/mL 是IVF 技術(shù)中LBW 發(fā)生的獨立預(yù)測因子[3]。

隨著玻璃化冷凍技術(shù)的不斷發(fā)展，越來越多的中心采取冷凍胚胎移植(frozen embryo transfer,FET)，不僅可保存患者多余的胚胎，而且可提供更好的子宮條件以供移植[4]，避免COH 可能導(dǎo)致的不良后果，降低卵巢過度刺激綜合征(ovarian hyperstimulationsyndrome,OHSS)發(fā)生率，并使母體環(huán)境在妊娠時脫離高雌環(huán)境。目前關(guān)于COH 導(dǎo)致的高雌環(huán)境中獲卵獲胚是否對FET 周期的妊娠結(jié)局鮮有研究。HCG 日血清雌激素水平可能預(yù)測FET 周期的臨床結(jié)局，與新鮮周期類似，當(dāng)COH 周期中hCG 日E2 水平＞3 000 pg/mL 時，F(xiàn)ET 周期中胎兒的出生體質(zhì)量亦會下降[5]。COH 周期高雌環(huán)境獲卵，F(xiàn)ET 周期正常激素環(huán)境移植，先前COH 周期時的高雌狀態(tài)是否仍對妊娠結(jié)局及子代產(chǎn)生影響尚有待研究。

1 資料與方法

1.1 納入及排除標(biāo)準(zhǔn) 所有于2014 年1 月—2017年12 月期間在上海市集愛遺傳與不育診療中心進(jìn)行的FET 周期作為可能的研究對象。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)女性患者年齡＜38 歲；(2)輔助生育受精方式為IVF或卵胞漿內(nèi)單精子注射技術(shù)(intracytoplasmic sperm injection,ICSI)；(3)FET 周期內(nèi)膜準(zhǔn)備方式為激素替代周期(hormone replacement therapy,HRT)；(4)COH周期的臨床結(jié)局為胚胎全凍。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)COH 周期為自然周期者；(2)胚胎移植前基因診斷(preimplantation genetic diagnosis,PGD)或胚胎移植前基因篩查(preimplantation genetic screening,PGS)周期；(3)診斷為多囊卵巢綜合征(polycystic ovarian syndrome,PCOS)的患者：PCOS 診斷按2003 年鹿特丹診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]；(4)反復(fù)種植失敗的患者(本中心FET 周期≥3 次者)；(5)供精I(xiàn)VF 及經(jīng)皮附睪穿刺取精(percutaneous epididymal sperm aspiration,PESAs)/睪丸穿刺取精(testicular sperm aspiration,TESA)周期。

1.2 臨床資料的收集 (1)收集納入周期患者的基本信息，包括年齡、體質(zhì)量指數(shù)(body mass index,BMI)、不孕原因、不孕年限。(2)收集所移植胚胎來自的COH周期治療信息，包括：促性腺激素(gonadotropins,Gn)用量、Gn 天數(shù)、注射hCG 日血清E2 水平、受精方式(IVF/ICSI)、獲卵數(shù)、受精數(shù)、卵裂數(shù)、有效胚胎數(shù)，計算受精率、卵裂率及有效胚胎率。(3)收集FET 周期的臨床信息，包括移植胚胎數(shù)、移植日內(nèi)膜厚度。(4)隨訪FET 周期的臨床結(jié)局，包括臨床妊娠率、活產(chǎn)率、單胎妊娠率、單胎活產(chǎn)率、雙胎妊娠率、宮外孕率、異位妊娠率；隨訪單胎妊娠患者的妊娠結(jié)局，包括分娩孕周、早產(chǎn)率、分娩方式、胎兒出生體質(zhì)量、LBW 發(fā)生情況，并隨訪單胎妊娠的患者妊娠期高血壓病、妊娠期糖尿病的發(fā)病情況。

患者在進(jìn)入本中心COH 周期及FET 周期前按診療常規(guī)進(jìn)行治療，并簽署知情同意書。研究通過上海市集愛遺傳與不育診療中心倫理委員會審批。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料以表示，多樣本組間比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩組間比較采用Bonferroni 校正的組間對比；兩組對比采用兩獨立樣本t 檢驗；定性資料用百分率(%)表示，組間率的比較采用χ2檢驗，P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 分組情況 研究共納入FET 周期數(shù)11 823個，患者8 843 例。FET 周期所移植胚胎來自的COH 周期hCG 注射日E2 峰值水平分布呈偏態(tài)分布。將納入的FET 周期分為E2≤25%百分位數(shù)，25%百分位數(shù)＜E2≤50%百分位數(shù)，50%百分位數(shù)＜E2≤75%百分位數(shù)以及E2＞75%百分位數(shù)4 組。FET 周期按E2峰值分組：A 組，E2≤2 950 pg/mL；B 組，2 950＜E2≤4 240 pg/mL；C 組，4 240＜E2≤5 903 pg/mL；D 組，E2＞5 903 pg/mL。

表1 各組患者一般資料比較(,n)

表1 各組患者一般資料比較(,n)

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，#P＜0.05；與C 組比較，△P＜0.05。

2.2 一般資料 患者治療前不孕因素構(gòu)成差異無統(tǒng)計學(xué)意義，輸卵管性不孕是本中心患者接受IVF治療最主要的指征。更高雌激素四分區(qū)間中的患者年齡更小，BMI 更小(P＜0.05)，見表1。

2.3 COH 周期臨床信息 各組使用Gn 天數(shù)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。然而，hCG 日的E2 越高，使用的Gn總量反而越低，各組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，見表2。提示hCG 日的高雌狀態(tài)不一定由卵巢刺激藥物導(dǎo)致，可能與患者自身條件相關(guān)。各組間ICSI 比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

各組COH 周期hCG 日E2 水平與獲卵數(shù)呈正相關(guān)，符合每個成熟卵泡對應(yīng)E2 200～300 pg/mL 的臨床規(guī)律。COH 周期中MⅡ卵數(shù)(metaphase Ⅱ,成熟卵)、受精數(shù)及有效胚胎數(shù)均與E2 水平呈正相關(guān)。盡管獲得的卵子數(shù)隨著E2 水平提高而增多，4 組間受精率、卵裂率及有效胚胎率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)，見表2。

表2 移植胚胎來自的COH 周期治療信息(,n,%)

表2 移植胚胎來自的COH 周期治療信息(,n,%)

注：與A 組比較，*P＜0.05；與B 組比較，#P＜0.05；與C 組比較，△P＜0.05。

2.4 FET 周期結(jié)局 4 組在FET 周期中平均移植胚胎數(shù)和移植日的內(nèi)膜厚度差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)，見表3。隨著hCG 日雌激素水平的升高，B、C、D 組妊娠率差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但顯著高于A 組。妊娠率呈先增高后降低的趨勢，妊娠率在C 組最高達(dá)55.25%，此后又稍下降。當(dāng)E2≤2 950 pg/mL時，妊娠率明顯低于E2＞2 950 pg/mL 者。

同樣活產(chǎn)率C 組最高，E2＞2 950/mL 者活產(chǎn)率顯著高于E2≤2 950 pg/mL 者，提示COH 周期中，一定水平的高雌狀態(tài)能獲得較好的臨床妊娠率及活產(chǎn)率。各組中宮外孕率、流產(chǎn)率、雙胎妊娠率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)(表3)，提示流產(chǎn)、宮外孕及雙胎妊娠的發(fā)生與COH 的高雌狀態(tài)無關(guān)。

為排除雙胎妊娠和其他可能因素對早產(chǎn)、分娩方式、妊娠期并發(fā)癥、胎兒出生體質(zhì)量及分娩孕周的影響，對FET 周期獲得單胎妊娠者的妊娠結(jié)局進(jìn)行隨訪統(tǒng)計(表4)。各組FET 周期單胎妊娠者剖宮產(chǎn)率、早產(chǎn)率、分娩孕周、妊娠期高血壓病發(fā)病率、妊娠期糖尿病發(fā)病率差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(均P＞0.05)，提示hCG 日E2 水平不影響冷凍周期單胎妊娠的分娩方式、早產(chǎn)及妊娠期并發(fā)癥的發(fā)生。

在A、B、C 組中，即在COH 周期中E2 水平≤5 903 pg/mL 時，新生兒出生體質(zhì)量未見明顯差異(P＞0.05)，但當(dāng)E2 水平上升＞5 903 pg/mL 時，新生兒出生體質(zhì)量明顯降低，與低雌狀態(tài)相比，新生兒出生體質(zhì)量減少約100 g(P＜0.05)。

與E2＜5 903 pg/mL 者相比，E2＞5 903 pg/mL時，LBW 發(fā)生率明顯上升幾乎是其2 倍(P＜0.05)。

表3 FET 周期結(jié)局(,n,%)

表3 FET 周期結(jié)局(,n,%)

注：與A 組比較，*P＜0.05。

表4 FET 周期單胎妊娠臨床結(jié)局(n,%,)

表4 FET 周期單胎妊娠臨床結(jié)局(n,%,)

注：與D 組比較，*P＜0.05。

3 討 論

近年來，IVF 技術(shù)將造成孕婦妊娠風(fēng)險的增高，并影響圍生期胎兒的出生體質(zhì)量及健康狀況。在IVF 技術(shù)的COH 過程中，因藥物干預(yù)可能出現(xiàn)多卵泡發(fā)育及高于自然周期的性激素水平[7]。COH 造成的機(jī)體高雌激素水平不僅對新鮮周期的OHSS 發(fā)生風(fēng)險帶來影響，更對新鮮周期的臨床結(jié)局帶來了不良后果。

本研究是一項基于大樣本量的回顧性隊列研究，共納入了11 823 個周期，8 000 余例患者。結(jié)果顯示，COH 周期hCG 日的E2 水平與患者年齡及BMI 相關(guān)。在COH 周期中促排卵藥物應(yīng)用方面，發(fā)現(xiàn)Gn 總量使用和E2 水平呈負(fù)相關(guān)。提示應(yīng)用多少促性腺激素可能不是hCG 日E2 水平的決定性因素，更可能與患者自身條件相關(guān)，提示對預(yù)期卵巢反應(yīng)較好、較年輕的患者，Gn 啟動及維持劑量無需過高，更要預(yù)防OHSS 的發(fā)生。

本研究提示COH 高雌狀態(tài)并不對胚胎早期的質(zhì)量及發(fā)育(受精率、卵裂率、有效胚胎率)造成明顯影響。在離開COH 導(dǎo)致的高雌環(huán)境后的FET 周期中，患者妊娠率及活產(chǎn)率隨著E2 水平的升高均呈上升后少許下降的趨勢，故一定范圍內(nèi)的高雌激素可能會有更好的臨床結(jié)局，有待于擴(kuò)大樣本進(jìn)一步的對照性前瞻研究驗證。

本研究發(fā)現(xiàn)hCG 日E2 水平不對移植周期的雙胎率、宮外孕、流產(chǎn)率產(chǎn)生影響；亦不影響單胎妊娠患者早產(chǎn)率、剖宮產(chǎn)率、分娩孕周及妊娠期高血壓、妊娠期糖尿病的發(fā)病率。因此，在FET 周期正常E2水平中行胚胎移植，可能可以避免一部分新鮮移植周期中COH 高雌狀態(tài)對子宮內(nèi)膜容受性或其他方面的影響，一定雌激素水平反而有利于提高臨床妊娠率及活產(chǎn)率。

LBW 的出生將為孕產(chǎn)婦及社會帶來巨大影響，不僅提高了近期住院率及新生兒死亡率[8]，更會帶來遠(yuǎn)期的健康風(fēng)險，包括一系列生理及行為發(fā)育問題，如肥胖、糖尿病、消化系統(tǒng)疾病、自閉癥、抑郁癥、焦慮癥等[9]。隨著COH 周期E2 水平的升高，當(dāng)E2 水平＞5 903 pg/mL 時，F(xiàn)ET 周期中低體質(zhì)量兒出生率明顯上升，幾乎是E2 水平＜5 903 pg/mL 時的兩倍。提示盡管通過FET，已經(jīng)避免了高雌狀態(tài)對子宮內(nèi)膜容受性等一些因素的影響，但高雌狀態(tài)似乎仍通過某種方式，影響了胚胎質(zhì)量或其他方面，最終導(dǎo)致了低體質(zhì)量兒出生率的升高。高雌狀態(tài)對FET 周期造成影響的具體機(jī)制還有待進(jìn)一步探索。

目前有基礎(chǔ)研究提示過高的雌激素將對卵子質(zhì)量及發(fā)育造成影響。對ART 技術(shù)孕婦胎盤DNA 甲基化影響的研究[10]發(fā)現(xiàn)ART 技術(shù)將導(dǎo)致胎盤中CDKNIC(KvDMR1)基因中差異性甲基化區(qū)域(differentially methylated region,DMR)甲基化下調(diào)及胰島素樣生長因子2(H19 DMR)的上調(diào)。更多研究[11]提示，父源性表達(dá)基因包括PLAGL1、PEG1/MEST、PEG3 及母源性表達(dá)基因如GRAB10、H19、TSSC3、MASH2 和MEG3 等均受到COH 中雌激素水平的影響，過高或過低的雌激素水平將下調(diào)或上調(diào)基因的表達(dá)，并影響胎盤發(fā)育、胎兒宮內(nèi)生長及胎兒出生體質(zhì)量。由此可見，盡管在FET 周期中，患者已經(jīng)離開COH 周期的高雌狀態(tài)，避免了過高雌激素水平對子宮內(nèi)膜容受性及胎盤植入的不良影響，減少對妊娠率、活產(chǎn)率、妊娠期并發(fā)癥發(fā)生率等的不良影響，但高雌狀態(tài)對卵子及胚胎造成的影響無法避免。

綜上所述，F(xiàn)ET 周期的臨床結(jié)局已較大程度地擺脫了COH 周期高雌狀態(tài)的影響，但FET 周期單胎妊娠中，胎兒的出生體質(zhì)量及LBW 發(fā)生率受到COH 高雌狀態(tài)的不良影響。因此在COH 過程中，為了獲得FET 周期更高的妊娠率及活產(chǎn)率，且不對妊娠及圍生期臨床結(jié)局造成不良后果，應(yīng)將hCG 日雌激素水平控制在一定范圍內(nèi)。