珠海地區(qū)地中海貧血基因檢測(cè)結(jié)果分析

李磊，羅桂香，李戀湘，肖奇志

珠海市婦幼保健院檢驗(yàn)科，廣東 珠海 519001

地中海貧血(thalassemia)簡(jiǎn)稱地貧，是由于珠蛋白基因缺失導(dǎo)致血紅蛋白合成障礙的一組遺傳性貧血，在我國(guó)以廣東、廣西及海南地區(qū)的發(fā)病率最高，具有明顯的種族差異和地域差異[1]。地貧根據(jù)臨床表型可分為輕型、中型、重型三種臨床表型[2]。α-地貧是16號(hào)染色體短臂末端α珠蛋白基因缺陷所致，實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)中α-地貧以缺失型為主；β-地貧為位于11p15.5 上的β珠蛋白基因發(fā)生核苷酸的插入、置換及缺失所致，β-地貧以突變?yōu)橹?，廣東省已檢出20多種。輕型地貧患者僅表現(xiàn)為小細(xì)胞低色素貧血或無(wú)明顯臨床表現(xiàn)，中型地貧患者臨床表現(xiàn)差異很大，重型α-地貧多在出生前或出生后不久死亡，重型β-地貧患兒則需終身輸血治療。我院實(shí)驗(yàn)室自2013 年3 月承擔(dān)全市地中海貧血篩查與診斷工作以來(lái)，目前已形成一套有效的篩查和確診手段。本文以2018 年1 月至2019 年6 月期間在我院進(jìn)行地中海貧血篩查的新婚夫婦為對(duì)象，對(duì)市行政中心香洲區(qū)及市西區(qū)(轄金灣區(qū)、斗門區(qū)、橫琴新區(qū)暫無(wú)數(shù)據(jù))婚檢人群的地貧基因檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行回顧性分析，為該病的遺傳咨詢提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取 2018 年 1 月至 2019 年 6 月在珠海市婦幼保健院參加孕前檢查的新婚夫婦25 320對(duì)，年齡18～45歲，平均(27.5±6.5)歲，所納入夫婦雙方中至少有一方為珠海戶籍人群，連續(xù)樣本。紅細(xì)胞平均指數(shù)異常指標(biāo)為紅細(xì)胞平均體積(MCV)＜82 fL，或紅細(xì)胞平均血紅蛋白量(MCH)＜27 pg。所有夫婦均簽署知情同意書(shū)。

1.2 主要儀器與試劑 貝克曼LH780 全自動(dòng)血液分析儀及配套試劑、黑馬9600 型PCR 擴(kuò)增儀、致善96S 實(shí)時(shí)熒光 PCR 擴(kuò)增儀、GSG-2000 核酸/蛋白凝膠圖像分析系統(tǒng)。α缺失型地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(深圳亞能生物技術(shù)有限公司)、β地中海貧血基因檢測(cè)試劑盒(深圳益生堂生物有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及保存 采集婚檢者外周靜脈血2 mL 于EDTA 抗凝管充分混勻，于2 h 內(nèi)進(jìn)行血常規(guī)檢測(cè)，一周內(nèi)進(jìn)行地貧基因檢測(cè)。檢測(cè)后樣本于-20℃冰箱保存以備復(fù)查。

1.3.2 全血DNA 提取 上述標(biāo)本均采用廈門致善生物科技有限公司生產(chǎn)的自動(dòng)核酸提取儀抽提人類白細(xì)胞基因組DNA，TE溶解，采用紫外分光儀測(cè)定其濃度，在使用時(shí)稀釋至20 μg/μL。

1.3.3 納入標(biāo)準(zhǔn) 血常規(guī)分析以MCV＜82fL 或MCH＜27 pg為篩查陽(yáng)性。Gap-PCR 技術(shù)檢測(cè)α地貧基因--SEA/、-α3.7/、-α4.2/、--THAI、αααHK5 種缺失。PCR 反向點(diǎn)雜交(reverse blot dot，RDB)技術(shù)檢測(cè)β地貧基因17種點(diǎn)常見(jiàn)突變。表型屬于β地貧但未檢出突變的，再用熒光PCR熔解曲線法檢測(cè)，可檢測(cè)中國(guó)人25種常見(jiàn)突變。實(shí)驗(yàn)設(shè)置陰陽(yáng)性及空白對(duì)照，試劑批間進(jìn)行性能比對(duì)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS20.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料以率(%)表示。采用描述性統(tǒng)計(jì)方法描述地貧篩查的攜帶率及基因型別分布情況。

2 結(jié)果

2.1 地貧表型篩查 通過(guò)血常規(guī)中紅細(xì)胞平均指數(shù)篩查，25 320對(duì)(50 640人)受檢者中共篩查出表型陽(yáng)性7 066例，經(jīng)基因診斷分析確定攜帶者為6 951例，小細(xì)胞低色素貧血14例、單純小細(xì)胞性貧血17例、缺鐵性貧血84 例。地貧基因的攜帶陽(yáng)性率為13.73%(6 951/50 640)，在本地區(qū)闡明人群中地貧發(fā)生率、地貧類型及基因頻率是一項(xiàng)基礎(chǔ)性工作，本地區(qū)α地貧基因攜帶者4 986例，攜帶率為9.85%(4 986/50 640)，β地貧基因攜帶者1 965 例，攜帶率為3.88%(1 965/50 640)。其中β地貧基因攜帶率略高于廣州地區(qū)大人群調(diào)查得出的3.36%，這與人群背景的不同密切相關(guān)。此外，本地區(qū)地貧仍以α地貧為主，β地貧次之。

2.2 α-缺失型地貧基因檢測(cè) 4 986 例α地貧基因攜帶者中共檢出9 種基因型，分別為--SEA/αα(3 830/4 986)、-α3.7/αα (706/4 986)、-α4.2/αα (225/4 986)、-α3.7/-α3.7(62/4 986)、-α3.7/--SEA(101/4 986)、-α4.2/--SEA(39/4 986)、-α4.2/-α4.2(11/4 986)、--THAI/αα 9 例、αααHK3 例。可見(jiàn)進(jìn)入基因篩查的攜帶者還是以缺失兩個(gè)α基因的標(biāo)準(zhǔn)型地貧為主，這也是當(dāng)前地貧防控的主要對(duì)象，必須予以重視。基因型構(gòu)成比分別為75.33%、16.34%、6.44%、1.27%、0.44%、0.14%、0.06%。其中--SEA、-α3.7、-α4.2的等位基因構(gòu)成比分別為76.36%、17.91%、5.50%，見(jiàn)表1。

2.3 β-地貧基因檢測(cè) 1 965 例β地貧基因攜帶者共檢出12種基因型，其中構(gòu)成比最高的前6種基因型分別為 CDs41-42、IVS-Ⅱnt654、TATA box-28、CD17、CD26、CDs71-72，此6 種突變型別占β-地貧突變檢出的90%以上，構(gòu)成比分別為40.81%、25.14%、16.03%、8.96%、3.41%、2.39%，此外本研究發(fā)現(xiàn)1例高度懷疑β地貧的患者(HbA為26.9%，HbF為10.8%)，試劑盒未檢出常見(jiàn)突變，疑為缺失型罕見(jiàn)β地貧，有待進(jìn)一步通過(guò)家系分析測(cè)序分型，見(jiàn)表2。

表1 α缺失型地貧基因攜帶率及等位基因構(gòu)成比

表2 β地貧基因攜帶率及等位基因構(gòu)成比

2.4 香洲區(qū)及西區(qū)地貧檢出情況 在25 320 對(duì)婚檢夫婦中，香洲區(qū)婚檢人群11 000 人，西區(qū)婚檢人群為39 640 人。其中α-地貧攜帶率分別為7.64%(840/11 000)、10.46 (4 146/39 640)。β-地貧檢出率分別為3.32%(365/11 000)、4.04%(1 600/39 640)。α-地貧復(fù)合β-地貧檢出率分別為1.51% (166/11 000)和1.42%(560/39 640)。

3 討論

地中海貧血，是一組嚴(yán)重威脅人類健康的單基因遺傳病。因其具有致死性和致殘性，可導(dǎo)致出生死亡或缺陷而引起人們廣泛關(guān)注[3]。其中以α-和β-地中海貧血最為常見(jiàn)。全世界地中海貧血基因攜帶率為2.62%，多見(jiàn)于東南亞國(guó)家和印度次大陸地區(qū)。我國(guó)的廣東、廣西、海南等省為高發(fā)地區(qū)[4]。

珠海市是一座典型的“移民”城市，香洲區(qū)為主城區(qū)，戶籍地多為外省，西區(qū)多為本地戶籍。從回顧性分析的孕檢夫婦戶籍來(lái)看，包括雙親之一為外省籍的家庭在內(nèi)，珠海市大約有40%的新一代為有外省市背景的人群[5]。本研究顯示：珠海市戶籍人群中β-地貧基因攜帶率為3.88%，高于廣州市大群調(diào)查得出的3.36%[6]。其主要原因與兩地人群背景的不同密切相關(guān)。珠海市戶籍人群中缺失型α-地貧占據(jù)絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，除--SEA型別為主(76.36%)外，-α3.7/型別也高達(dá)17.91%。因此該區(qū)域人群中由于婚配產(chǎn)生的可預(yù)測(cè)的高風(fēng)險(xiǎn)胎兒類型中，除首位為重型Hb Bart"s水腫胎外，Hb H病(--SEA/-α3.7或--SEA/-α4.2)也要引起足夠的重視，在香洲區(qū)婚檢的夫婦中，夫妻雙方中一方為北方戶籍的人群占有相當(dāng)部分比例。而西區(qū)婚檢的夫婦中多為本地戶籍，這是地貧檢出率要高于香洲區(qū)的主要原因。因此，粵籍居民是本市預(yù)防α地貧的重點(diǎn)人群，其次為其他南方省籍移居本市的居民。此外，香洲區(qū)及西區(qū)檢測(cè)人群中α-地貧復(fù)合β-地貧檢出率分別為1.51%和1.42%，總檢出率為2.93%。在該回顧性分析中，血液表型與基因分析檢測(cè)結(jié)果不符的樣本中(已排除缺鐵性貧血)，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，其原因包括其他異常血紅蛋白的干擾或存在特定修飾作用等[7]。

由于中間型和重型的α-地貧或β-地貧均為致死性或致殘性血液病，目前仍無(wú)理想的治愈方法，因此，可以通過(guò)大規(guī)模人群地貧篩查、基因分型檢測(cè)、遺傳咨詢服務(wù)，避免受累胎兒的出生是最佳選擇[8-10]。地中海貧血基因同型攜帶者婚配的下一代有1/4 的機(jī)會(huì)患重癥地中海貧血[11]。本研究中檢出9 例--THAI型地貧，盡管是罕見(jiàn)地貧的一種，但是復(fù)合--SEA后形成的非免疫性水腫也是形成水腫胎兒的重要原因。檢出3例αααHK，為在同一條染色體上含有-α3.7和anti4.2不平衡交叉鏈接的片段，明確其基因型別后便于及時(shí)進(jìn)行遺傳咨詢。因此，監(jiān)測(cè)本地區(qū)人群中地中海貧血患者的基因類型和頻率，對(duì)減少地中海貧血的危害、提高本地區(qū)的人口素質(zhì)有著重要意義。

總之，對(duì)珠海市育齡人群進(jìn)行地貧篩查，可有效檢出高風(fēng)險(xiǎn)夫婦；由于本地區(qū)篩查人群多為已婚待孕，因此，有必要加強(qiáng)高風(fēng)險(xiǎn)夫婦的產(chǎn)前追蹤，及時(shí)實(shí)施產(chǎn)前診斷嚴(yán)控重型地貧患兒的出生。以基因診斷為金標(biāo)準(zhǔn)[12]，通過(guò)系統(tǒng)的分子篩查手段調(diào)查珠海地區(qū)婚檢夫婦人群地貧基因攜帶率，為大規(guī)?？刂浦兄匦偷刎毣純撼錾峁╊A(yù)防計(jì)劃及有益的借鑒[13]。