壞死性凋亡及其相關(guān)疾病的研究進展

鮑春彤,張曉光,雷連成,2*

(1.吉林大學(xué)動物醫(yī)學(xué)學(xué)院,吉林 長春 130000;2.長江大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,湖北 荊州 434000)

壞死性凋亡(necroptosis),也被稱作“程序性壞死”,是一種類似于壞死的細胞死亡方式,依賴受體相互作用蛋白激酶1(receptor interacting serine/threonine protein kinase 1,RIPK1)、受體相互作用蛋白激酶3(receptor interacting serine/threonine protein kinase 3,RIPK3)和底物混合譜系激酶樣蛋白(mixed lineage kinase domain like pseudokinase,MLKL),不依賴半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(cysteine-aspartic proteases,Caspase)[1]。

凋亡(apoptosis)與壞死(necrosis)是兩類主要的細胞死亡方式,壞死曾經(jīng)被認為是被動和非程序性的。隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)細胞壞死是一種主動、且可被調(diào)控的過程[2]。缺失或抑制凋亡信號通路中關(guān)鍵蛋白Caspase-8或FAS相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域(Fas-associating protein with a novel death domain,FADD),細胞在腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)誘導(dǎo)下仍會死亡,且細胞死亡形態(tài)與壞死的細胞相似[3-4],逐漸揭示了一種類似于壞死的不依賴Caspase的細胞死亡方式。2003年,Chan等[5]發(fā)現(xiàn)RIP依賴性的“程序性壞死”。Degterev等[6]在2005年闡述了小分子Nec-1對細胞壞死的調(diào)控作用,首次將不受調(diào)控的壞死的概念更新為可以被Nec-1調(diào)控的細胞程序性壞死(necroptosis)。2008年Degterev等[7]證明RIPK1即為Nec-1的靶標,并用siRNA篩選的方法,證實基因組中很多基因?qū)毎绦蛐詨乃蓝加姓{(diào)控作用,找到了程序性壞死與細胞凋亡通路的交叉分子[8]。2018年細胞死亡命名委員會(Nomenclature Committee on Cell Death,NCCD)正式將壞死性凋亡定義為程序性壞死[1]。

發(fā)生壞死性凋亡的細胞胞膜破裂,釋放的胞內(nèi)物質(zhì)可以激發(fā)多種細胞(如巨噬細胞、成纖維細胞和內(nèi)皮細胞等)參與固有免疫反應(yīng),通過釋放炎性細胞因子加劇炎癥應(yīng)答,從而導(dǎo)致壞死性凋亡在不同生理或病理過程中扮演著雙重角色。

壞死性凋亡的研究最初主要集中在急性腦損傷、癌癥、神經(jīng)退行性疾病等[6,9-10]。自2013年以來,相關(guān)研究成果激增,發(fā)現(xiàn)壞死性凋亡不僅在多種器官和組織的非感染性病癥如肺臟[11]和腎臟[12]疾病中扮演著重要角色,同時在感染性疾病中也起到重要作用[13-14]。以信號通路中關(guān)鍵蛋白為靶點,已經(jīng)篩選出多種可用于治療壞死性凋亡相關(guān)疾病的潛在藥物及小分子化合物,因此筆者對細胞壞死性凋亡的發(fā)生機制、與炎性因子釋放的關(guān)系、相關(guān)常見病癥及其治療藥物等方面進行綜述。

1 細胞壞死性凋亡的發(fā)生機制

細胞壞死性凋亡的發(fā)生需要RIPK1、RIPK3及MLKL的參與,MLKL作為執(zhí)行分子導(dǎo)致胞膜裂解。腫瘤壞死因子受體1(tumor necrosis factor receptor 1,TNFR1)、干擾素受體(interferon receptor,IFNR)、Toll樣受體3/4/9(Toll-like receptor 3/4/9,TLR3/4/9)以及胞漿感受器IFN調(diào)節(jié)因子的DNA依賴激活劑(DNA-dependent activator of IFN regulatory factors,DAI)活化后,刺激信號激活胞內(nèi)的RIPK家族激酶,啟動壞死性凋亡[15-19]。

細胞壞死性凋亡的調(diào)控過程精密復(fù)雜,目前較為清晰的主要通路分為兩類:

第1類為死亡受體參與且和細胞凋亡通路密不可分的信號通路。一方面,當(dāng)TNF-α刺激胞膜表面的TNFR1,TNFR1通過其C-端的死亡結(jié)構(gòu)域(death domain,DD)募集TNFR1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白(TNF receptor 1-associated death domain protein,TRADD)、RIPK1和腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2(Tumor necrosis factor receptor related factor 2,TRAF2)等接頭蛋白,隨后,TRAF2與胞內(nèi)凋亡抑制蛋白(cellular inhibitors of apoptosis 1 and 2,cIAP1/2)識別并結(jié)合,進一步募集線性泛素鏈組裝復(fù)合體(linear ubiquitin Chain assem-bly complex,LUBAC)。形成的蛋白復(fù)合物支架,與轉(zhuǎn)化生長因子激酶1/轉(zhuǎn)化生長因子結(jié)合蛋白(transforming growth factor kinase 1/transforming growth factor binding protein,TAK1/TAB)復(fù)合物和IκB 激酶γ(IκB kinase,IKKγ)結(jié)合形成TNFR1復(fù)合物Ⅰ[20]。該復(fù)合物激活c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、p38絲裂原激活蛋白激酶(p38 mitogen activated protein kinase,p38)、細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular regulated protein kinase,ERK)以及核因子κB(nuclear factor κB,NF-κB),促進炎性基因表達[21-22]。另一方面,TNFR1復(fù)合物Ⅰ經(jīng)腫瘤抑制因子頭帕腫瘤綜合征蛋白(cylindromatosis,CYLD)去泛素化,募集TRADD、FADD及 Caspase-8 蛋白并結(jié)合后形成TNFR1復(fù)合物Ⅱa,導(dǎo)致細胞凋亡,也稱為RIPK1非依賴凋亡(RIPK1 independent apoptosis,RIA)。當(dāng)RIPK3和MLKL表達充分時,TNFR1復(fù)合物Ⅱa則會與RIPK3結(jié)合形成由FADD、Caspase-8、RIPK1和RIPK3 蛋白分子組成的TNFR1復(fù)合物Ⅱb,同樣導(dǎo)致細胞凋亡,這種凋亡則稱為RIPK1依賴性凋亡(RIPK1 dependent apoptosis,RDA)。如果Caspase-8的催化活性被抑制(zVAD-FMK),解除Caspase-8對RIPK1的抑制作用,募集RIPK3并發(fā)生磷酸化,活化的RIPK3募集MLKL形成TNFR1復(fù)合物Ⅱ(或稱壞死小體,necrosome),代謝物磷酸肌醇(IP)激酶調(diào)控MLKL[23],使其發(fā)生磷酸化和寡聚化后,從胞質(zhì)部位轉(zhuǎn)移至胞膜部位,與相應(yīng)的膜蛋白識別結(jié)合,細胞發(fā)生壞死性凋亡[24]。

不同于TNF-α刺激下TNFR1介導(dǎo)的細胞壞死性凋亡信號通路,TNF家族死亡受體腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體受體1(TNF related apoptosis inducing ligand receptor 1,TRAILR1)和受體2(TRAILR2)、死亡受體3(death receptor 3,DR3)和受體6(DR6)以及 FAS(CD95)通過與細胞內(nèi)的DD domain和接頭蛋白FADD識別并結(jié)合,形成死亡誘導(dǎo)信號復(fù)合物(death inducing signaling complex,DISC),進而募集并活化Caspase-8,最終致細胞凋亡[25]。但在特定條件下,如Caspase-8 被抑制劑(zVAD-FMK)抑制等,則會形成壞死小體,發(fā)生細胞壞死性凋亡。

第2類為無死亡受體參與的壞死性凋亡。受體相互作用蛋白(receptor-interacting protein,RIP)同型相互作用基序域(RIP homotypic interaction motifs,RHIM)在程序性壞死信號傳導(dǎo)中起核心作用[26]。目前發(fā)現(xiàn)有4種含RHIM的蛋白質(zhì):RIPK1、RIPK3、β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白(TIR-domain containing adaptor inducing interferon-β,TRIF)和DAI。TLR或病毒均需要包含RHIM的接頭分子才能激活壞死性凋亡。胞外的poly IC、dsRNA、病毒RNA和脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)分別激活胞膜表面的TLR3和TLR4 受體,募集含有RHIM域的接頭分子TRIF,并在泛Caspase-8抑制劑存在或Caspase-8(zVAD-FMK)被抑制的情況下,形成壞死小體,細胞發(fā)生壞死性凋亡[17-18,27-28]。

除此之外,干擾素家族也可誘導(dǎo)壞死性凋亡的發(fā)生。在巨噬細胞中,Ⅰ型干擾素(IFN-α和IFN-β)通過同源受體IFNARI,激活小鼠骨髓巨噬細胞JAK1,并在zVAD-FMK存在下,ISGF3復(fù)合物IRF9-STAT1-STAT2形成并持續(xù)激活最終導(dǎo)致壞死性凋亡發(fā)生[29]。Ⅱ型干擾素(IFN-γ)可協(xié)同Smac模擬物(birinapant,BV6)在干擾素調(diào)節(jié)因子1(interferon regulatory factor 1,IRF1)幫助下誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生壞死性凋亡[30]。

MLKL磷酸化并不是壞死信號通路的終點,MLKL磷酸化后,Ca2+內(nèi)流,磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine,PS)從細胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)到細胞膜的表面造成膜損傷可以激活內(nèi)涵體分選復(fù)合物Ⅲ(endosomal sorting complex required for transport-Ⅲ,ESCRT-Ⅲ),ESCRT-Ⅲ可控制質(zhì)膜完整性的持續(xù)時間,保證細胞的存活[31-32]。在感染、損傷或應(yīng)激條件下,多種模式識別受體(pattern recognition receptor,PRR)如TLR、NOD樣受體(NOD-like receptor,NLR)、RIG-Ⅰ樣受體(RIG-Ⅰ-like receptor,RLR)和RNA活化蛋白激酶(protein kinase R,PKR)等,也參與細胞壞死性凋亡[17,33-36]。細胞壞死性凋亡發(fā)生機制如圖1所示。

圖1 細胞壞死性凋亡發(fā)生機制示意圖Fig.1 Schematic diagram of the mechanism of necroptosisTNF-α:腫瘤壞死因子 Tumor necrosis factor α;TNFR1:腫瘤壞死因子受體1 Tumor necrosis factor receptor 1;TRADD:腫瘤壞死因子受體1相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域蛋白 Tumor necrosis factor receptor type 1-associated DEATH domain;TRAF2:腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2 TNF receptor-associated factor 2;RIPK1:受體相互作用蛋白激酶1 Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 1;cIAP1/2:細胞凋亡抑制蛋白1/2 Cellular inhibitor of apoptosis protein 1/2;LUBAC:線性泛素鏈組裝復(fù)合體Linear ubiquitin chain assembly complex;TAK1:轉(zhuǎn)化生長因子激酶1 TGF beta-activated kinase 1;IKK:IκB 激酶 IκB kinase;NF-κB:核因子活化B細胞κ輕鏈增強子Nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells;ERK:細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶Extracellular regulated protein kinases;p38:p38絲裂原激活蛋白激酶 p38 mitogen-activated protein kinases;JNK:c-Jun氨基末端激酶 c-Jun N-terminal kinase;CYLD:頭帕腫瘤綜合征蛋白Cylindromatosis;FADD:FAS相關(guān)死亡結(jié)構(gòu)域 Fas-associating protein with a novel death domain;Caspase-8:含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶8 Cysteinyl aspartate specific proteinase 8;RIPK3:受體相互作用蛋白激酶 3 Receptor-interacting serine/threonine-protein kinase 3;MLKL:混合譜系激酶結(jié)構(gòu)域樣假激酶 Mixed lineage kinase domain like pseudokinase;FASL:FAS配體Fas ligand;TRAIL:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體 TNF-related apoptosis-inducing ligand;TRAILR1/2:腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體受體1/2 TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor 1/2;LPS:脂多糖 Lipopolysaccharide;PolyIC:聚肌胞苷酸(聚肌苷酸-聚胞苷酸)Polyinosinic(polycytidylic acid);dsDNA:雙鏈DNA Double-stranded DNA;vRNA:病毒RNA Viral RNA;TLR3/4/9:Toll樣受體3/4/9 Toll-like receptor 3/4/9;TRIF:β干擾素TIR結(jié)構(gòu)域銜接蛋白 TIR-domain-containing adapter-inducing interferon-β;IFN-α/β:干擾素α/β Interferon α/β;IFNAR1:干擾素α/β受體1 Interferon alpha/beta receptor 1;JAK1:酪氨酸受體激酶1 Janus kinase 1;ISGF3 complex:干擾素刺激基因因子3復(fù)合物 IFN-stimulated gene factor 3 complex;STAT1/2:信號傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活蛋白1/2 Signal transducer and activator of transcription 1/2;IRF9:干擾素調(diào)節(jié)因子9 Interferon regulatory factor 9;DAI:IFN調(diào)節(jié)因子的DNA依賴激活劑 DNA-dependent activator of IFN-regulatory factors.

2 壞死性凋亡促進炎性細胞因子釋放

細胞壞死性凋亡的特點是細胞膜破裂、細胞器腫脹和細胞內(nèi)成分外溢。當(dāng)細胞發(fā)生壞死性凋亡時,會因胞內(nèi)成分“損傷相關(guān)分子模式(damage associated molecular pattern,DAMP)”的釋放而促進炎癥應(yīng)答發(fā)生,形成過度炎癥。DAMP是在細胞遭受死亡、損傷、應(yīng)激時,釋放或暴露的分子和細胞成分,警告免疫系統(tǒng)機體處于危險狀態(tài)。DAMP主要包括死亡細胞釋放的細胞因子和警報蛋白,例如IL-1家族細胞因子 IL-1α、IL-1β、IL-18、IL-33、IL-36和IL-37,以及S100蛋白S100A8、S100A9和S100A12[37]。隨后DAMP由PRR識別,通過PRR誘導(dǎo)細胞因子和趨化因子的表達來激活免疫應(yīng)答。

細胞壞死性凋亡最初被認為是宿主為了抵抗具有抗凋亡作用的病毒而進化產(chǎn)生的一種防御方式,但是后期發(fā)現(xiàn)伴隨著壞死性凋亡的發(fā)生會導(dǎo)致炎性因子失衡,引起急性或慢性炎癥性疾病。例如,發(fā)生腸炎時,RIPK3誘導(dǎo)的壞死性凋亡促進了MLKL的激活,增加細胞因子IL-8、IL-1β、IL-33、HMGB1的表達,導(dǎo)致上皮通透性增加,加重腸道炎癥[38]。在急性胰腺炎的小鼠模型中,RIPK3和MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡可加劇組織損傷和炎癥[39-40],在Gaucher病的小鼠模型中,RIPK3缺乏癥具有保護作用[41]。此外,RIPK3缺乏癥可改善缺血再灌注引起的損傷和炎癥,延長了腎臟和心臟同種異體移植的存活時間[42-44],這表明細胞的壞死性凋亡可能在移植引發(fā)的炎癥中起到關(guān)鍵作用。

但是,也有研究發(fā)現(xiàn),壞死性凋亡的關(guān)鍵節(jié)點蛋白RIPK1、RIPK3及MLKL在多種疾病的炎癥應(yīng)答中發(fā)揮保護作用。RIPK1的Ser25磷酸化缺陷可導(dǎo)致多器官炎癥;RIPK1的Ser25磷酸化可以抑制RIPK1依賴的壞死性凋亡導(dǎo)致的小鼠血清中IL-6和MCP-1的高表達,顯示RIPK1的磷酸化對于抵抗慢性增生性皮炎有重要作用[45]。在損傷性結(jié)腸炎模型中,葡聚糖硫酸鈉(dextran sodium sulfate,DSS)誘導(dǎo)Ripk3-/-小鼠結(jié)腸炎,結(jié)腸損傷反而增加,不同于RIPK3依賴的壞死會促進病理損傷的觀點[38]。這是由于DSS主要以RIPK3非依賴的方式誘導(dǎo)Caspase非依賴的損傷,RIPK3在造血細胞的表達對于限制DSS誘導(dǎo)的結(jié)腸炎的損傷程度以及組織修復(fù)發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此,RIPK3以一種非依賴壞死性凋亡的方式,通過表達IL-23和IL-1β促進IL-22介導(dǎo)組織修復(fù)[46]。表明細胞壞死性凋亡及關(guān)鍵蛋白的作用存在組織、細胞差異,在維持炎性因子平衡和炎癥損傷方面發(fā)揮著雙重作用,是調(diào)控炎癥的重要靶點之一。

3 壞死性凋亡與疾病

3.1 感染性疾病

感染是引發(fā)細胞壞死性凋亡的重要原因之一。某些病原體的感染誘導(dǎo)TNF-α和Ⅰ型干擾素大量表達,導(dǎo)致細胞發(fā)生壞死性凋亡。細胞壞死性凋亡既可以通過增強炎癥應(yīng)答幫助清除病原,可能造成過度炎癥損傷組織,或因?qū)е录毎劳龆黾影麅?nèi)病原的釋放,從而增強病原微生物的致病性。

利用斑馬魚模型研究發(fā)現(xiàn),TNF-α在控制結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis,Mtb)中發(fā)揮重要作用,但過量的TNF-α可導(dǎo)致組織損傷和器官功能障礙。斑馬魚感染Mtb后,TNF-α的過度釋放引起RIPK1/RIPK3/MLKL依賴性壞死信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活,一方面產(chǎn)生大量的ROS以消除和控制巨噬細胞內(nèi)細菌的生長和繁殖;另一方面,誘導(dǎo)細胞發(fā)生壞死性凋亡,導(dǎo)致細胞中未死亡細菌的釋放[47]。結(jié)核菌分泌的壞死毒素(tuberculosis necrotizing toxin,TNT)能夠水解煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide,NAD+),TNT對NAD+的消耗可激活RIPK3和MLKL,引起壞死性凋亡以殺死受感染的巨噬細胞,釋放胞內(nèi)細菌[48]。Ⅰ型干擾素在細菌誘導(dǎo)細胞壞死性凋亡中具有重要作用。2012年,Robinson等[49]發(fā)現(xiàn)在感染鼠傷寒沙門氏菌的過程中Ⅰ型干擾素誘導(dǎo)RIP激酶導(dǎo)致巨噬細胞發(fā)生壞死性凋亡。2017年,Hos等[50]進一步證明,Ⅰ型干擾素通過削弱Nrf2依賴的抗氧化應(yīng)激反應(yīng)而使感染了鼠傷寒沙門氏菌的巨噬細胞壞死性凋亡。

產(chǎn)生成孔毒素(pore-forming toxin,PFT)的多種細菌病原體感染也會造成多種細胞壞死性凋亡。例如肺炎鏈球菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、沙雷氏菌和單增李斯特菌都可以產(chǎn)生PFT,促進巨噬細胞壞死性凋亡,喪失免疫調(diào)節(jié)功能[51-52]。肺炎克雷伯菌(Klebsiellapneumoniae,KB)感染小鼠肺臟時,通過RIPK1/RIPK3/MLKL依賴的壞死性凋亡途徑促進中性粒細胞死亡,阻止巨噬細胞對肺中性粒細胞的 “胞吞作用”,影響機體對凋亡細胞的清除,破壞體內(nèi)炎性細胞因子的動態(tài)平衡[53]。黏質(zhì)沙雷氏菌產(chǎn)生的PFT通過引起離子失衡,以TNFR/TLR4受體非依賴的方式導(dǎo)致肺上皮細胞發(fā)生壞死性凋亡[54]。

在一些病理情況下,如皰疹病毒和人痘病毒可編碼一種結(jié)構(gòu)和功能均與cFLIP相似的vFLIP蛋白,可以抑制Caspase-8,這雖然阻止了細胞凋亡但是卻誘導(dǎo)細胞壞死性凋亡的發(fā)生[5,55-56]。

有少數(shù)病毒,例如單純皰疹病毒(Herpes simplex virus,HSV)和巨細胞病毒(Cytomegalovirus,CMV),能夠抑制壞死,從而逃避宿主抗病毒防御。小鼠巨細胞病毒(Mouse cytomegalovirus,MCMV)的M45基因編碼的RIP激活病毒抑制劑(viral inhibitor of RIP activation,vIRA)是一種RHIM信號抑制因子[57-58],它可以阻止RIPK3的激活和隨后MLKL的激活[59]。人皰疹病毒基因HSV1和HSV2編碼R1蛋白ICP6和ICP10,抑制Caspase-8激活和RIPK1與RIPK3之間的RHIM信號傳導(dǎo)[60-61]。已知的所有依賴RIP3激酶的壞死性死亡途徑都需要RHIM介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo),使MLKL磷酸化[62-63],但均可被vIRA阻斷[64]。然而,愛潑斯坦-巴爾病毒(Epstein-Barr virus,EBV)抑制細胞壞死的機制不同于MCMV和HSV。EBV編碼的潛伏膜蛋白1(latent membrane protein 1,LMP1)缺少RHIM域,LMP1通過其C端激活區(qū)直接與RIPK1和RIPK3相互作用,調(diào)節(jié)蛋白的翻譯后修飾。LMP1促進K63多聚泛素化RIPK1,抑制RIPK1蛋白表達和抑制K63多聚泛素化RIPK3,使細胞從壞死性凋亡轉(zhuǎn)為存活[65]。

寄生蟲感染也會引起細胞壞死性凋亡,廣州管圓線蟲感染引起宿主腦組織實質(zhì)和海馬區(qū)小膠質(zhì)細胞和星形膠質(zhì)細胞的凋亡和壞死,感染后Caspase-3、Caspase-4、Caspase-6和RIP3的mRNA水平升高,Caspase-4、裂解的Caspase-3、裂解的Caspase-6、RIP3和pRIP3蛋白水平明顯升高。但是,FADD、Beclin-1或LC3B的mRNA或蛋白質(zhì)水平都沒有明顯變化,表明在感染廣州管圓線蟲的小鼠腦組織同時發(fā)生了凋亡和壞死性凋亡[66]。

3.2 非感染性疾病

壞死性凋亡在非感染性疾病中也發(fā)揮著重要作用。如在神經(jīng)系統(tǒng)疾病中,如缺血性腦損傷[67]、阿爾茨海默癥(Alzheimer’s disease,AD)[68]、帕金森病(Parkinson’s disease,PD)[69]。在腦缺血/再灌注(cerebral ischemia/reperfusion,I/R)損傷后,血管周圍M1型小膠質(zhì)細胞產(chǎn)生的TNF-α介導(dǎo)內(nèi)皮細胞發(fā)生壞死性凋亡,加重缺血性卒中后對血腦屏障的破壞[67]。阿爾茨海默癥的發(fā)病特征為嚴重的神經(jīng)元缺失,Caccamo等[68]發(fā)現(xiàn)減弱細胞壞死性凋亡的激活可減少AD小鼠模型中小鼠神經(jīng)元的缺失;RIPK1/RIPK3/MLKL介導(dǎo)的壞死性凋亡導(dǎo)致的軸突細胞變性嚴重危害帕金森病患者的神經(jīng)系統(tǒng)[69]。在不同的肝臟疾病中,細胞壞死性凋亡途徑的關(guān)鍵蛋白RIPK1和RIPK3分別起到不同的作用。RIPK1參與的炎癥反應(yīng)影響慢性炎癥和肝癌的發(fā)病過程[70]。非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver,NAFLD)和非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)的慢性肝細胞死亡相關(guān)疾病與壞死性凋亡也有關(guān)系。肝細胞損傷、死亡、炎癥和氧化應(yīng)激是NAFLD的主要病理特征。NAFLD和NASH患者外周血TNF-α以及肝臟中RIPK3、MLKL表達增加,且RIPK3缺失可減輕肝臟的損傷、脂肪變性、炎癥、壞死和氧化應(yīng)激的影響,因此,RIPK3被認為是NAFLD的治療靶點[71]。此外,酒精性肝硬化晚期患者不良預(yù)后與RIPK3的表達量相關(guān)[72]。

3.3 癌癥

誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生壞死性凋亡是治療癌癥的一種方法,但是壞死性凋亡也參與腫瘤細胞的致病過程。細胞壞死性凋亡可以促進腫瘤細胞的外滲和遷移,例如腫瘤細胞以表達的淀粉樣蛋白前體為介質(zhì),通過其在內(nèi)皮細胞上的DR6,誘導(dǎo)內(nèi)皮細胞發(fā)生壞死性凋亡而導(dǎo)致腫瘤細胞外滲和轉(zhuǎn)移[73]。當(dāng)RIPK1/RIPK3介導(dǎo)發(fā)生胰腺腫瘤(pancreatic tumor,PDA)壞死性凋亡時,釋放的可溶性因子CXCL1,通過抑制性巨噬細胞誘導(dǎo)的免疫抑制性腫瘤微環(huán)境,促進PDA的生長和侵襲[74]。RIPK3或TNFR1的基因失活可減輕結(jié)腸炎和癌癥的臨床癥狀,提示RIPK3介導(dǎo)的壞死性凋亡可促進慢性炎癥和結(jié)腸直腸癌的發(fā)生[75-76]。

4 抑制壞死性凋亡的藥物研究

4.1 抑制壞死性凋亡的中藥小分子化合物

中藥是中國文化的瑰寶,很多中藥小分子在抑制細胞壞死性凋亡中起重要作用。它們主要靶向細胞壞死性凋亡信號通路中關(guān)鍵效應(yīng)蛋白RIPK1、RIPK3及MLKL。在神經(jīng)系統(tǒng)疾病、實質(zhì)性臟器疾病及炎癥性疾病,藥物主要通過抑制細胞壞死性凋亡發(fā)揮治療作用。在癌癥治療中,大多數(shù)癌細胞由于細胞凋亡機制失調(diào)而具有耐藥性,通過誘導(dǎo)癌細胞發(fā)生細胞壞死性凋亡起抗癌作用。試驗證實具有抗壞死性凋亡作用的藥物如下。

神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物:姜黃素通過減弱壞死作用,保護原皮層神經(jīng)元免受鐵引起的神經(jīng)毒性[77]。槲皮素通過抑制大鼠脊髓損傷后巨噬細胞/小膠質(zhì)細胞向M1表型的極化來防止少突膠質(zhì)細胞壞死[78]。川芎素通過靶向RIPK1/RIPK3/MLKL途徑減少缺血性腦卒中后大鼠腦壞死[79]。在腦缺血模型中,茴香霉素通過上調(diào)與Hsc70相互作用的蛋白羧基末端從而導(dǎo)致RIPK1和RIPK3蛋白的水平降低,減輕細胞壞死性凋亡,從而起到治療作用[80]。近期研究證實,銀杏葉提取物761(Gingkobilobaextract 761,EGB761)通過減輕RIP1介導(dǎo)的線粒體功能障礙和產(chǎn)生ROS來改善細胞壞死性凋亡[81]。

肝臟疾病藥物:酒精性肝病(alcoholic liver disease,ALD)是以肝細胞過度死亡和炎癥為特征的一種常見疾病,肝細胞壞死是引起肝臟炎癥的主要原因。沒食子酸(gallic acid,GA)通過Nrf2依賴機制使壞死信號蛋白RIPK1和RIPK3的表達減少,限制了乙醇刺激下的肝細胞壞死[82]。

癌癥相關(guān)疾病藥物:紫草素通過RIPK1/RIPK3/MLKL信號通路誘導(dǎo)“壞死性凋亡”殺傷鼻咽癌[83]。黃連素聯(lián)合順鉑可誘導(dǎo)卵巢癌細胞的壞死和凋亡,顯著增加卵巢癌細胞的死亡,即黃連素可提高化療藥物的抗癌作用[84]。

炎癥性疾病藥物:沒食子酸可減輕脂多糖誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥——蛋白聚集和壞死[85]。GA是一種酚酸,幾乎存在于植物的所有部位。GA阻止了LPS誘導(dǎo)的Caspase-3激活(程序性細胞死亡的生物標志物)和LPS誘導(dǎo)的RIPK1和RIPK3水平的升高(壞死的生物標志物),表明GA抑制了LPS誘導(dǎo)的大鼠腦部黑質(zhì)紋狀體多巴胺能系統(tǒng)的凋亡和壞死。

4.2 小分子抑制劑類藥物

壞死性凋亡是在一系列因子激活和高表達的精準調(diào)控下進行的細胞程序性死亡?，F(xiàn)有的針對壞死性凋亡途徑中關(guān)鍵蛋白的小分子抑制劑也體現(xiàn)出了較好的治療作用,可以考慮作為潛在的治療藥物。

4.2.1 RIPK1 抑制劑RIP1(RIPK也稱RIP)抑制劑Necrostatin-1(Nec-1),最早是通過篩選壞死病抑制劑而被發(fā)現(xiàn)的,并已在各種與細胞壞死性凋亡相關(guān)的動物模型中得到了廣泛驗證[86-88]。另一種有效的Nec-1衍生物Nec-1s(7-Cl-O-Nec-1)對RIP1具有更高的特異性[89]。RIP1抑制劑還有GSK’963、GSK’481、RIPA-56等[90]。

4.2.2 RIPK3抑制劑與RIP1不同,RIP3對細胞凋亡沒有作用,而靶向抑制RIP3似乎在控制壞死病方面更具特異性。有趣的是,沉默RIP3可以保護細胞和組織免于壞死性壞死[91],諸如GSK’840、GSK’843和GSK’872的小分子可抑制RIP3依賴性壞死性腎病[92-94]。

4.2.3 MLKL抑制劑MLKL作為壞死性凋亡的執(zhí)行者,也是重要的藥物靶標,已有研究發(fā)現(xiàn)了豐富的抑制劑。通過在MLKL中對半胱氨酸進行共價修飾,MLKL抑制劑保護細胞免受TNF誘導(dǎo)的壞死[95]。化合物TC13172通過誘導(dǎo)MLKL的Cys-86處的共價結(jié)合對其進行抑制[96]。此外,GW806742X靶向抑制活化的MLKL的假激酶結(jié)構(gòu)域,保護其免于壞死性凋亡[51]。此外,索拉非尼是一種多靶點激酶抑制劑,該藥主要用于治療腎癌、肝癌、甲狀腺癌以及部分白血病患者。索拉非尼除了靶向Braf/Mek/Erk和VEGFR途徑外,還靶向壞死性途徑,并且緩解急性炎癥中RIPK1/3介導(dǎo)的病理作用[97]。

5 問題與展望

壞死性凋亡是一種重要的、自主調(diào)控的宿主細胞防御機制,甚至是一種可以抑制病原體的宿主防御機制?，F(xiàn)有研究揭示了壞死性凋亡對機體生理作用的影響、壞死性凋亡通路與節(jié)點蛋白、壞死性炎癥啟動的炎癥應(yīng)答機制等。細胞壞死性凋亡是免疫系統(tǒng)不同參與者相互協(xié)調(diào)的結(jié)果,細胞壞死性凋亡在時間和空間上多角度影響免疫系統(tǒng)的不同細胞群,因此有必要揭示細胞壞死過程調(diào)控免疫細胞表型的分子機制,闡明細胞壞死性凋亡與炎癥應(yīng)答的內(nèi)在關(guān)系。細胞壞死性凋亡和凋亡之間的交叉調(diào)節(jié)增加了相關(guān)通路的復(fù)雜性,如Caspase-8、FADD蛋白與RIPK1在細胞凋亡和壞死性凋亡通路中復(fù)雜的關(guān)系。其他的凋亡檢查點如Caspase-9、Bal2、Bax是否對程序性壞死起調(diào)節(jié)作用仍有待深入研究。另外,壞死性凋亡存在組織差異性,與多種病癥的發(fā)生密切相關(guān),這可能對精準治療有一定指導(dǎo)作用。研究壞死性凋亡的誘因?qū)Φ蛲黾毎愋?、機制以及凋亡在疾病中的作用十分必要。針對細胞壞死性凋亡通路蛋白作為某些疾病的治療靶點,幾種壞死途徑抑制劑已被開發(fā)用于試驗治療,中藥提純物及化學(xué)小分子壞死激活劑或抑制劑可能在某些疾病特異性治療中發(fā)揮作用,但其作用靶點及機制有待進一步研究。