高通量高效液相色譜法快速檢測(cè)西紅花中15 種非法添加色素

曹雅靜，劉叢叢，賴宇紅

(廣東省藥品檢驗(yàn)所，廣州 510663)

西紅花是一種名貴的中藥材，為鳶尾科植物番紅花(Crocus Sativus L.)的干燥柱頭［1］。根據(jù)《中國(guó)藥典》2015 年版記載，該藥材具有活血化瘀、涼血解毒、解郁安神的功效。西紅花可用于經(jīng)閉癥癥瘕、產(chǎn)后淤阻腹痛等癥，為婦科和傷科重要用藥，但來(lái)源有限，產(chǎn)量較低，價(jià)格昂貴，因此受經(jīng)濟(jì)利益的驅(qū)使下，出現(xiàn)很多偽品和摻偽品，如蓮須、黃花菜，甚至紙漿等通過(guò)染料加工而成的偽制品［2-3］，僅僅依靠其形狀或者顯微檢測(cè)［4］，其專屬性不強(qiáng)，質(zhì)量控制難以把握。目前西紅花除了與其它物質(zhì)摻假以次充好外，非法染色也是很常見(jiàn)情況，盡管?chē)?guó)家2011 年曾頒布西紅花補(bǔ)充檢驗(yàn)方法［5］，針對(duì)金胺O、新品紅、檸檬黃、胭脂紅四種色素進(jìn)行檢驗(yàn)，但是色素種類(lèi)繁多，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)新染料，例如西紅花檢出酸性橙Ⅱ及808 猩紅［6］，紅花中檢出日落黃［7］，除此之外，很多中藥材也出現(xiàn)染色的現(xiàn)象［8-9］，因此本實(shí)驗(yàn)根據(jù)目前中藥材檢出的染料情況，建立同時(shí)檢測(cè)西紅花中多成分非法染色物質(zhì)的分析方法。

目前鑒別西紅花中非法添加色素的方法有薄層色譜法［10-11］、拉曼光譜法［12-14］、高效液相色譜 法［11，15］、超高效液相色譜法［16］、液質(zhì)聯(lián)用法［17］等。薄層色譜法和拉曼光譜法前處理簡(jiǎn)便，適合作為快速篩查方法，但薄層色譜法重現(xiàn)性與精密度容易受到干擾，檢驗(yàn)效率低，且定量分析不夠準(zhǔn)確；高效液相色譜法、超高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法定性定量分析準(zhǔn)確性高，能夠?qū)崿F(xiàn)絕大多數(shù)非揮發(fā)性非法添加物檢測(cè)，適用性廣泛，但是超高效液相色譜法、液質(zhì)聯(lián)用法費(fèi)用昂貴，不適合日?？焖俸Y查檢測(cè)，因此建立高通量快速檢測(cè)多成分方法是本實(shí)驗(yàn)研究 方向。

文獻(xiàn)方法一般采用色譜柱填料粒徑為5 μm的高效液相色譜法，所以在短時(shí)間內(nèi)無(wú)法同時(shí)實(shí)現(xiàn)對(duì)多種成分快速檢測(cè)，通過(guò)減小填料粒徑、改善填料類(lèi)型等方式可提高分析效率。筆者采用亞3 色譜技術(shù)開(kāi)展多成分通用的高通量快速檢測(cè)方法，以西紅花為研究對(duì)象，針對(duì)市場(chǎng)中藥材中已檢出的15 種色素，建立高通量的高效液相色譜方法和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用確證法，有效提高對(duì)中藥材染色摻偽的風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)，保護(hù)廣大消費(fèi)者的用藥安全。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1260 Infinity 型，配G1315D 型二極管陣列檢測(cè)器，美國(guó)安捷倫科技有限公司。

三重四級(jí)桿液相色譜- 質(zhì)譜聯(lián)用儀：TripleQuad5500 型，美國(guó)AB SCIEX 公司。

pH 計(jì)：PB-10 型，德國(guó)Sartorius 公司。

純水機(jī)：Millipore Milli Q 型，美國(guó)Millipore 公司。

電子天平：METTLER MS205DU／S204DU 型，美國(guó)Mettler Toledo 公司。

超聲波清洗器：KQ-300DE 型，昆山市超聲儀器有限公司。

高速離心機(jī)：GT5-2 型，北京京立有限公司。

甲醇、乙腈：色譜純，美國(guó)Honeywell 公司。

氨水、冰乙酸：分析純，廣州化學(xué)試劑廠。

乙酸銨：色譜純，美國(guó)ROE 公司。

乙酸銨溶液：0.02 mol／L，取0.54 g 乙酸銨用去離子水溶解并定容至1 L，即得。

檸檬黃：96%，批號(hào)為25743，北京曼哈格生物技術(shù)公司。

莧菜紅：94.4%，批號(hào)為20213，北京曼哈格生物技術(shù)公司。

胭脂紅：0.5 mg／mL，批號(hào)為6001，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

日落黃：0.5 mg／mL，批號(hào)為13001，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

橙黃G：96%，批號(hào)為O100205，阿拉丁試劑有限公司。

誘惑紅：0.5 mg／mL，批號(hào)為10001，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

偶氮玉紅：92%，批號(hào)為20521，Dr. Ehrenstorfer GmbH。

新品紅：100%，批號(hào)為201301，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

堿性嫩黃O：100%，批號(hào)為31203，德國(guó)Dr. Ehrenstorfer GmbH 公司。

酸性紅73：100%，批號(hào)為201602，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

酸性橙Ⅱ：98.3%，批號(hào)為170716，北京曼哈格生物技術(shù)公司。

赤蘚紅：0.5 mg／mL，批號(hào)為30423，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院。

蘇丹紅I：90.5%，批號(hào)為71220，Dr.Ehrenstorfer GmbH。

808 猩紅：99%，批號(hào)為160924，北京曼哈格生物技術(shù)公司。

蘇丹紅Ⅳ：100%，批號(hào)為201602，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

實(shí)驗(yàn)用水為經(jīng)Millipore Milli Q 純水機(jī)(0.22μm)凈化后的去離子水。

1.2 溶液配制

色素對(duì)照品儲(chǔ)備液：分別精密稱取檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃、橙黃G、誘惑紅、偶氮玉紅、新品紅、堿性嫩黃O、酸性紅73、酸性橙Ⅱ、赤蘚紅等12 種色素對(duì)照品10 mg，用甲醇溶解稀釋，配制成1 mg／mL 的儲(chǔ)備液。分別精密稱取蘇丹紅I、808 猩紅、蘇丹紅Ⅳ等3 種色素對(duì)照品10 mg，用乙腈配制成1 mg／mL 的儲(chǔ)備液。上述對(duì)照品儲(chǔ)備液保存于-20℃的避光環(huán)境中。

15 種色素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別精密吸取上述1 mg／mL 的色素對(duì)照品儲(chǔ)備液，用0.02 mol／L 乙酸銨溶液稀釋配制成濃度均分別為50、10、5、1、0.5、0.1、0.05 μg／mL 的系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，搖勻，進(jìn)液相小瓶后注入液相色譜儀測(cè)定。

樣品溶液：稱取樣品約1 g，置于50 mL 具塞聚丙烯離心管中，加入70%甲醇水溶液10 mL，稱量并記錄質(zhì)量，超聲提取20 min 后取出，放冷至室溫后再次稱量，并用70%甲醇水溶液補(bǔ)足質(zhì)量損失，取1 mL 上清液，加入0.5 mL 水溶液，搖勻，經(jīng)聚四氟乙烯濾膜(0.45 μm)過(guò)濾，待HPLC 檢測(cè)。檢出陽(yáng)性成分的樣品溶液，用LC-MS／MS 法初始比例流動(dòng)相稀釋至與對(duì)照品溶液相當(dāng)濃度。經(jīng)過(guò)聚四氟乙烯濾膜(0.22 μm)過(guò)濾，待LC-MS／MS 儀檢測(cè)。

1.3 儀器工作條件

1.3.1 高效液相色譜法

色譜柱：Poroshell 120 EC C18柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm，美國(guó)安捷倫科技有限公司)；流動(dòng)相流量：1.2 mL／min；柱溫：35 ℃；檢測(cè)波長(zhǎng)：450 nm，500 nm；進(jìn)樣體積：20 μL；流動(dòng)相：A 為甲醇，B 為0.02 mol／L 乙酸銨溶液(pH 5.9)，梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用確證方法

（1）液相色譜條件。色譜柱Agilent Poroshell 120 EC C18(100 mm×2.1 mm，1.9μm，Agilent公司)，進(jìn)樣體積：5 μL，柱溫：40 ℃；流量：0.3 mL／min；流動(dòng)相：A 為5 mmol／L 乙酸銨溶液(pH 5.9)，B 為甲醇，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫程序

（2）質(zhì)譜條件。電噴霧離子源正負(fù)離子模式(ESI)；檢測(cè)方式：MS2 全掃描；碰撞氣：62 kPa；氣簾氣：276 kPa；離子噴射電壓：正離子模式為5 500 V、負(fù)離子模式為-4 500 V；離子源溫度：550 ℃；離子氣1：379 kPa；離子氣2：379 kPa。15 種色素的質(zhì)譜分析參數(shù)見(jiàn)表3。

表3 15 種色素質(zhì)譜分析參數(shù)

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜柱的選擇

分別考察了5 種不同鍵合相的色譜柱：Agilent Poroshell 120 Phenyl Hexyl 柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)、Agilent Poroshell 120 SB-C18柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)、Thermo Accucore C18柱(100 mm×4.6 mm，2.6 μm)、Thermo Accucore PFP 柱(150 mm×2.1 mm，2.6 μm)、Agilent Poroshell 120 EC-C18柱(100 mm×4.6 mm，2.7 μm)對(duì)15 種色素的分離效果。發(fā)現(xiàn)Phenyl Hexyl、SB-C18、Accucore C18、PFP 色譜柱均不能分離日落黃與橙黃G 色譜峰，且Phenyl Hexyl、SB-C18、Accucore C18色譜柱對(duì)新品紅、堿性嫩黃O 與酸性紅73 色譜峰分離度較差，均無(wú)法滿足15 種色素的同時(shí)分離。Agilent Poroshell 120 EC-C18柱對(duì)15 種色素均分離效果較好，色譜峰形尖銳，因此選擇Agilent Poroshell 120 EC-C18色譜柱。

2.2 流動(dòng)相選擇與優(yōu)化

選擇低毒的甲醇和配制方便的乙酸銨作為流動(dòng)相系統(tǒng)，采用冰乙酸和氨水調(diào)節(jié)流動(dòng)相pH 值?？疾靝H 值在4.9～6.6 之間時(shí)，色素的色譜峰形及分離情況。當(dāng)流動(dòng)相pH 值小于5.9 時(shí)，堿性嫩黃O與酸性紅73 分離度較差，不能實(shí)現(xiàn)二者完全分離。當(dāng)pH 值為5.9 時(shí)，色譜峰形尖銳對(duì)稱，能實(shí)現(xiàn)15 種色素的完全分離。因?yàn)榱鲃?dòng)相pH 5.9～6.6 均能滿足色譜分離的需求，但流動(dòng)相pH 越近中性色譜柱越容易被細(xì)菌污染，對(duì)色譜柱產(chǎn)生不良影響，故選擇流動(dòng)相pH 值為5.9。

2.3 流動(dòng)相流量的選擇與優(yōu)化

對(duì)色譜柱中流動(dòng)相流量為1.0、1.2、1.5 mL／min進(jìn)行考察。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)當(dāng)設(shè)為常規(guī)流量1.0 mL／min時(shí)，色素的相近峰分離度較差，隨著流量升高，色素色譜峰分離度增大，而系統(tǒng)壓力也增大，當(dāng)流量達(dá)到1.5 mL／min 時(shí)，則系統(tǒng)壓力達(dá)到最大耐受壓，影響色譜柱柱效。綜合考慮色譜柱分離度和柱效等因素，選擇色譜柱中流動(dòng)相流量為1.2 mL／min。

2.4 柱溫的選擇與優(yōu)化

對(duì)柱溫25、30、35、40 ℃進(jìn)行考察。發(fā)現(xiàn)柱溫越高，堿性嫩黃O 與酸性紅73 分離度增大，但是當(dāng)柱溫升高到40 ℃時(shí)，新品紅與堿性嫩黃O 分離度減小。當(dāng)柱溫為35 ℃時(shí)，15 種色素均分離，色譜峰型良好，因此選擇色譜柱溫度為35 ℃。

2.5 檢測(cè)波長(zhǎng)選擇

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，15 種色素在波長(zhǎng)250 nm 左右均有響應(yīng)，但檢測(cè)的靈敏度易受基質(zhì)成分的干擾，且檸檬黃在此波段不易與基質(zhì)成分區(qū)分，同時(shí)極性相似色素之間的分離度也受到影響。當(dāng)檢測(cè)波長(zhǎng)大于400 nm 時(shí)，各成分吸收信號(hào)較強(qiáng)且不易受雜質(zhì)成分的干擾，因此選擇450、500 nm 檢測(cè)波長(zhǎng)進(jìn)行檢測(cè)。發(fā)現(xiàn)檸檬黃在500 nm 處未有響應(yīng)，但一般紅色色素在波長(zhǎng)為500 nm 時(shí)吸收較強(qiáng)，黃色色素在450 nm 時(shí)吸收較強(qiáng)，因此選擇450 nm，500 nm 雙波長(zhǎng)作為檢測(cè)波長(zhǎng)，兩個(gè)波長(zhǎng)下均基線平穩(wěn)，各對(duì)照試劑均有響應(yīng)，均能滿足各成分完全分離。依據(jù)能達(dá)到較低檢測(cè)限的原則，酸性紅73、酸性橙Ⅱ、赤蘚紅、808 猩紅4 種色素選取450 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)，其余11 種色素選取500 nm 作為檢測(cè)波長(zhǎng)。15 種色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液液相色譜圖見(jiàn)1。

圖1 15 種色素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液的色譜圖

2.6 線性關(guān)系與檢出限

按1.3.1 色譜條件測(cè)定1.2 中配制的15 種色素系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，以各色素的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)色素的色譜峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸處理，得15 種色素的線性方程及相關(guān)系數(shù)見(jiàn)表4。結(jié)果表明，15 種合成色素在0.05～50.0 μg／mL的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)均大于0.998，線性關(guān)系良好。分別以3 倍和10 倍信噪比計(jì)算檢出限及定量限，相關(guān)結(jié)果列于表4。15 種色素的檢出限為0.01～0.05 mg／kg，定量限為0.03～0.15 mg／kg。

表4 15 種色素的線性方程及相關(guān)系數(shù)

2.7 回收試驗(yàn)與精密度試驗(yàn)

取未檢出15 種色素的陰性樣品約1 g，分別制成高中低三個(gè)質(zhì)量濃度水平，加入一定量的15 種色素對(duì)照品溶液各6 份，按“1.3.1”項(xiàng)方法進(jìn)行檢測(cè)，記錄各成分峰面積，外標(biāo)法計(jì)算，各色素的回收率結(jié)果見(jiàn)表5。由表5 可見(jiàn)，15 種色素成分的回收率為70.1%～93.1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.2%～6.6%，表明所建立的分析方法能保證15 種成分均具有較好的精密度與準(zhǔn)確度。

2.8 樣品分析

2.8.1 高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果

利用互聯(lián)網(wǎng)收集20 批樣品，取各批次樣品按照“1.2 溶液的配制”樣品溶液處理方法處理，采用“1.3.1”高效液相色譜法進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)一批樣品存在非法添加現(xiàn)象，檢出胭脂紅色素。

2.8.2 液質(zhì)聯(lián)用法確證結(jié)果

對(duì)高效液相色譜法檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性的樣品，采用“1.3.2”液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行進(jìn)一步定性確證。樣品二級(jí)質(zhì)譜圖中的選擇分子離子峰m／z268.1 及特征碎片離子峰m／z205.9、m／z302 與胭脂紅對(duì)照品均一致，表明LC-MS／MS 法確證結(jié)果與HPLC 法檢測(cè)結(jié)果一致，該非法添加合成色素為胭脂紅。

表5 方法回收率與精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)所選取的15 種色素專門(mén)針對(duì)西紅花中易被染色的染料品種，建立的高通量高效液相色譜法可實(shí)現(xiàn)15 種色素同時(shí)快速篩查，彌補(bǔ)了現(xiàn)有方法的局限性。該方法有針對(duì)性的對(duì)西紅花易被非法染色的染料建立的快速篩查方法，操作簡(jiǎn)單，效率高，實(shí)用性強(qiáng)，為快速打擊中藥材中非法添加色素行為提供技術(shù)參考。