氣相色譜法測定電子煙煙液及氣溶膠中雙乙酰和乙酰丙酰

張霞，趙偉，張子龍，朱東來，吳俊，李壽波，李廷華，鞏效偉，孫志勇，洪鎏

(云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，昆明 650231)

近年來，電子煙等新型煙草制品在歐美市場迅速崛起，國際煙草行業(yè)巨頭如英美煙草、帝國煙草、菲莫美國等紛紛投入巨資開發(fā)新型煙草制品市場，形成龐大的產(chǎn)業(yè)鏈集群［1］。歐盟和美國均出臺了相應(yīng)的法律法規(guī)，將電子煙納入監(jiān)管［2-4］，并明確了對產(chǎn)品的監(jiān)管要求。英國、美國、法國、中國均出臺了相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)［5-8］，其中美國電子煙煙液制造標(biāo)準(zhǔn)協(xié)會(huì)(AEMSA)在電子液體制造標(biāo)準(zhǔn)（E-Liquid Manufacturing Standards Version 2.0）中將雙乙酰和乙酰丙酰歸為電子煙煙液的禁用物質(zhì)；英國電子煙行業(yè)協(xié)會(huì)（ECITA）在PAS 54115: 2015 標(biāo)準(zhǔn)中將雙乙酰和乙酰丙酰歸為電子煙煙液的受控物質(zhì)；法國電子煙標(biāo)準(zhǔn)XPD-90-300-2 以及中國煙草總公司標(biāo)準(zhǔn)YQ-EL／T 1.2-2017 中均明確了電子煙煙液雙乙酰的限量要求（22 μg／mL）。雙乙酰和乙酰丙酰的揮發(fā)性強(qiáng)，在煙液加熱霧化過程中，易從煙液轉(zhuǎn)移至氣溶膠中，因此準(zhǔn)確測定電子煙煙液和氣溶膠中雙乙酰和乙酰丙酰的含量十分必要。

雙乙酰能提供黃油和奶油特征香味，天然存在于食物中，也可作為合成調(diào)味劑用于黃油、焦糖、可可、咖啡、乳制品和含酒精的飲料等食品中。乙酰丙酰和雙乙酰有著相似的香味性質(zhì)和特征。根據(jù)文獻(xiàn)調(diào)研，雙乙酰和乙酰丙酰在一些甜味煙液中尤其常見［9-10］，有報(bào)道稱吸入這類物質(zhì)會(huì)對肺部產(chǎn)生潛在的毒性，可能引發(fā)閉塞性細(xì)支氣管炎，其中，可引起呼吸道疾病的相關(guān)數(shù)據(jù)促使許多監(jiān)管機(jī)構(gòu)提出了可接受的職業(yè)暴露限值［11-14］。

雙乙酰和乙酰丙酰作為食品添加劑，目前已有相應(yīng)的國家參考標(biāo)準(zhǔn)GB 23488-2009［15］和GB 28368-2012［16］，均規(guī)定了食品添加劑雙乙酰和乙酰丙酰的要求、試驗(yàn)方法等，所用方法均為氣相色譜法，但標(biāo)準(zhǔn)中針對的是添加劑本身，并不涉及前處理過程。電子煙煙液中的雙乙酰測定方法報(bào)道有高效液相色譜法［17］，有關(guān)乙酰丙酰的研究則鮮有報(bào)道。由于雙乙酰分子量較小且無發(fā)色團(tuán)，液相色譜檢測時(shí)一般需進(jìn)行化學(xué)衍生，操作較麻煩?；陔娮訜熧|(zhì)量安全需求，筆者以電子煙煙液和氣溶膠為檢測對象，重點(diǎn)考慮前處理因素的影響，擬開發(fā)一種適宜的氣相色譜分析方法（GC-FID）對電子煙煙液及氣溶膠樣品中的雙乙酰和乙酰丙酰進(jìn)行準(zhǔn)確的定量 分析。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

氣相色譜儀：Trace 1310 型，配備FID 檢測器，美國賽默飛世爾科技公司。

吸煙機(jī)：SM450 直線型，英國斯茹林公司。

多管式旋渦混合器：Talboys 數(shù)顯型，美國特朗納公司。

電子天平：CP2245 型，感量為0.000 1 g，德國賽多利斯公司。

無水乙醇：色譜純。

雙乙酰標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于98%，北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

乙酰丙酰標(biāo)準(zhǔn)品：純度不小于98%，北京國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

電子煙液樣品：20 種，編號為1#～20#，不同品牌，市售。

電子煙煙具：由可注油煙彈和電池桿組成，所含發(fā)熱元件為鎳鉻發(fā)熱絲，阻值為3.0 Ω(均采用萬用表進(jìn)行測試分選)，為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，以確保測試數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性，向每個(gè)煙彈中準(zhǔn)確注入0.70 g 煙液。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

雙乙酰、乙酰丙酰儲(chǔ)備溶液：準(zhǔn)確稱取雙乙酰、乙酰丙酰各0.1 g，置于100 mL 容量瓶中，用乙醇稀釋定容，得雙乙酰、乙酰丙酰質(zhì)量濃度均為1 000 μg／mL 的雙乙酰、乙酰丙酰儲(chǔ)備工作溶液。

雙乙酰、乙酰丙酰系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液：分別移取5、2、1、0.5、0.2、0.1、0.05 mL 雙乙酰、乙酰丙酰儲(chǔ)備工作溶液于7 只100 mL 容量瓶中，用乙醇稀釋定容至標(biāo)線，制備得到質(zhì)量濃度均分別為50、20、10、5、2、1、0.5 μg／mL 的雙乙酰、乙酰丙酰系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。

分別取標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL 放入棕色進(jìn)樣瓶。

1.3 樣品前處理

1.3.1 煙液樣品

準(zhǔn)確稱取1.0 g（精確至0.000 1 g）電子煙液樣品，置于50 mL 具塞離心管中，加入乙醇溶液并定容至20 mL，置于渦旋振蕩器中，轉(zhuǎn)速設(shè)置為1 500 r／min，振蕩萃取10 min。取萃取液，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相濾膜過濾后進(jìn)行分析。

1.3.2 氣溶膠樣品

采用煙草科學(xué)研究合作中心（CORESTA）推薦的電子煙抽吸模式［18］，即抽吸容量為55 mL，抽吸頻率為30 s／次，抽吸持續(xù)時(shí)間為3 s，抽吸曲線為方波。使用SM450 直線型吸煙機(jī)，分別抽吸一次性電子煙和可注油式電子煙，采用Ф44 mm 的劍橋?yàn)V片串聯(lián)1 個(gè)吸收瓶（加入10 mL 乙醇），并將吸收瓶置于冰、水混合物組成的冷阱捕集裝置中，捕集氣溶膠總粒相物，每50 口氣溶膠為一個(gè)樣品。抽吸結(jié)束后，將吸收瓶中吸收液轉(zhuǎn)移至50 mL 具塞離心管中，采用吸收液清洗吸收瓶管，清洗液一并合入離心管中，最后用萃取液定容至20 mL，然后將劍橋?yàn)V片剪碎置入其中，渦旋振蕩轉(zhuǎn)速設(shè)置為1 500 r／min，萃取10 min。取萃取液，經(jīng)0.22 μm 有機(jī)相濾膜過濾后進(jìn)行分析。

1.4 儀器工作條件

色譜柱：DB-ALC1 色譜柱[30 m×0.32 mm，1.8 μm，安捷倫科技（中國）有限公司]；程序升溫方式：初始溫度為60℃，保持2 min，以4℃／min速率升至100℃，以60℃／min 速率升至220℃，保持6 min，總運(yùn)行時(shí)間為20 min；載氣：氦氣，流量為1.8 mL／min；進(jìn)樣口溫度：240℃；進(jìn)樣體積：1 μL；進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比為20∶1；檢測器：FID；檢測器溫度：250℃。

2 結(jié)果與討論

2.1 色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 色譜柱

毛細(xì)管柱最大的優(yōu)點(diǎn)是在較寬的溫度范圍內(nèi)操作，這樣既能保證待測組分良好分離，又能縮短分析時(shí)間。GB 23488-2009 對食品添加劑雙乙酰的測定，選用的是固定相為PEG 20 000 毛細(xì)管柱；GB 28368-2012 對食品添加劑乙酰丙酰的測定，選用的固定相為聚乙二醇毛細(xì)管柱，兩個(gè)毛細(xì)管柱均屬于極性柱。也有文獻(xiàn)報(bào)道采用HP-5MS、DB-1MS 等弱極性毛細(xì)管色譜柱對雙乙酰進(jìn)行分析檢測［19］。電子煙煙液和氣溶膠含有大量的甘油和丙二醇，充分考慮甘油和丙二醇的基質(zhì)影響，對比了低極性HP-5MS 色譜柱、中等極性DB-ALC1 色譜柱和極性HP-INNOWAX 色譜柱對雙乙酰、乙酰丙酰的分離效果。在電子煙煙液基質(zhì)下，DB-ALC1 色譜柱對雙乙酰和乙酰丙酰的分離效果較好，因此最終選擇DB-ALC1 色譜柱。

2.1.2 升溫程序

優(yōu)化升溫程序可實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物的良好分離。分別考察了3 種不同的升溫程序，分離效果見圖1。由圖1(a)中可以看出，當(dāng)初始溫度較高時(shí)，目標(biāo)物出峰時(shí)間快，但是雙乙酰與干擾峰無法達(dá)到基線分離；由圖1(b)中可以看出，當(dāng)升溫速率過高時(shí)，雙乙酰的分離效果欠佳；由圖1(c)中可以看出，雙乙酰和乙酰丙酰的分離效果較好，因此最終選擇的程序升溫程序：初始溫度為60℃，保持2 min，以4℃／min速率升至100℃，以60℃／min 速率升至220℃，保持6 min，總運(yùn)行時(shí)間為20 min。

圖1 樣品溶液在不同升溫程序下的氣相色譜圖

2.1.3 載氣流量

在選定升溫程序的基礎(chǔ)之上，進(jìn)一步考察了1.5、1.8、2.0 mL／min 3 個(gè)不同的載氣流量對樣品測定結(jié)果的影響，樣品溶液的氣相色譜圖見圖2。由圖2 可知，在1.5 mL／min 的載氣流量下，乙酰丙酰的色譜峰形較寬；與載氣流量為1.8 mL／min 條件下的樣品色譜譜圖相比，載氣流量為2.0 mL／min條件下的雙乙酰與之后的干擾峰保留時(shí)間較為接近，分離效果稍差，因此最終選定的載氣流量為1.8 mL／min。

圖2 樣品溶液在不同載氣流量下的氣相色譜圖

2.1.4 色譜圖

色譜條件優(yōu)化后，標(biāo)準(zhǔn)溶液及電子煙液樣品中雙乙酰、乙酰丙酰的分離效果見圖3、圖4。

圖3 標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖

圖4 樣品萃取液色譜圖

由圖3、圖4 可知，標(biāo)準(zhǔn)溶液及電子煙液樣品中雙乙酰、乙酰丙酰的分離效果較好，能達(dá)到基線分離，滿足分析檢測的需要，因此樣品分析最終選定的色譜條件見1.4。

2.2 樣品前處理的優(yōu)化

2.2.1 煙液萃取方式

雙乙酰易溶于水、乙醇、乙醚，乙酰丙酰微溶于水，易溶于乙醇，考慮到兩者的溶解性及化學(xué)試劑的安全性，優(yōu)選無水乙醇作為萃取溶劑。準(zhǔn)確稱取1.0 g 電子煙液樣品，準(zhǔn)確加入20 mL 無水乙醇，分別采取超聲萃取和渦旋振蕩萃取兩種方式進(jìn)行處理，萃取時(shí)間統(tǒng)一固定為10 min，結(jié)果見表1。由表1可知，渦旋振蕩萃取時(shí)，對目標(biāo)物的萃取效果較好，因此選擇渦旋振蕩萃取方式。2.2.2 煙液萃取時(shí)間

經(jīng)過前期的文獻(xiàn)閱讀，本人確定了自己的論文題目，再通過詳細(xì)閱讀和引用十篇有關(guān)于休閑體育、民間體育、課程開發(fā)的文獻(xiàn)，確定文章的主要思路。

表1 不同萃取方式下雙乙酰和乙酰丙酰的萃取效率μg／g

為了保證萃取完全，對萃取時(shí)間進(jìn)行了考察。準(zhǔn)確稱取1.0 g 煙液樣品，加入20 mL 乙醇萃取液，比較5、10、15、20、25 min 5 個(gè)不同萃取時(shí)間對樣品中雙乙酰和乙酰丙酰的萃取效率，結(jié)果見圖5。由圖5 可知，在10 min 內(nèi)，隨著萃取時(shí)間的增加，雙乙酰和乙酰丙酰的含量逐漸增加。當(dāng)萃取時(shí)間超過10 min，含量基本不變，表明萃取完全，因此選擇萃取時(shí)間為10 min。

圖5 不同萃取時(shí)間下雙乙酰和乙酰丙酰的萃取效率

2.2.3 煙液萃取溶劑體積

為了保證萃取完全，對萃取溶劑體積進(jìn)行了考察。準(zhǔn)確稱取1.0 g 煙液樣品，渦旋振蕩萃取時(shí)間為10 min，分別比較10、15、20、25、30 mL 萃取溶劑對樣品中雙乙酰和乙酰丙酰的萃取效率，結(jié)果見圖6。由圖6 可知，當(dāng)萃取溶劑小于20 mL 時(shí)，隨著萃取溶劑體積的增加，目標(biāo)物含量逐漸增加。當(dāng)萃取溶劑體積超過20 mL 時(shí)，目標(biāo)物的含量基本不變，因此選擇萃取溶劑體積為20 mL。

圖6 不同萃取溶劑體積時(shí)雙乙酰和乙酰丙酰的萃取效率

2.2.4 氣溶膠樣品捕集方式

考慮到雙乙酰和乙酰丙酰的沸點(diǎn)及揮發(fā)性，選擇市售煙液中雙乙酰和乙酰丙酰濃度較高的2#煙液樣品，加入煙具中，選用CORESTA 推薦的電子煙抽吸模式，分別采用劍橋?yàn)V片、劍橋?yàn)V片+1 個(gè)濾收瓶、劍橋?yàn)V片+2 個(gè)吸收瓶3 種捕集方式捕集50 口氣溶膠樣品。每個(gè)吸收瓶中加入10 mL 乙醇(萃取溶劑乙醇具有揮發(fā)性，在抽吸過程中采用冰水冷阱裝置)。抽吸結(jié)束后，將吸收瓶中吸收液轉(zhuǎn)移至50 mL 具塞離心管中，用吸收液清洗吸收瓶管，清洗液一并合入離心管，用乙醇定容至20 mL，然后將劍橋?yàn)V片剪碎置入其中，渦旋振蕩萃取10 min，取濾液進(jìn)行分析，測定結(jié)果見表2。

表2 不同捕集方式的雙乙酰和乙酰丙酰測定結(jié)果 μg／50 口

由表2 可知，經(jīng)過對3 種捕集方式得到的雙乙酰和乙酰丙酰數(shù)據(jù)進(jìn)行對比分析，表明僅采用劍橋?yàn)V片測得的目標(biāo)物含量偏低，而劍橋?yàn)V片串聯(lián)1 個(gè)吸收瓶即可完全捕集目標(biāo)物，因此在抽吸試驗(yàn)時(shí)，選擇劍橋?yàn)V片串聯(lián)1 個(gè)吸收瓶的捕集法。

2.3 線性方程與檢出限

按照1.4 儀器工作條件對系列標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測定，縱坐標(biāo)(y)為雙乙酰和乙酰丙酰的色譜峰面積，橫坐標(biāo)(x)為雙乙酰和乙酰丙酰的質(zhì)量濃度，分別建立雙乙酰和乙酰丙酰的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線。采用最低濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)進(jìn)樣10 次，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)偏差，以3 倍的標(biāo)準(zhǔn)偏差作為檢出限，以10 倍標(biāo)準(zhǔn)偏差作為定量限，雙乙酰和乙酰丙酰的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限見表3。

表3 線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限

2.4 回收率與精密度

取不同濃度的3 個(gè)煙液樣品(編號分別為R-1，R-2，R-3)和不同濃度的3 個(gè)氣溶膠樣品(編號分別為A-1，A-2，A-3)，按照實(shí)驗(yàn)方法加入低、中、高3 種濃度的雙乙酰和乙酰丙酰標(biāo)準(zhǔn)溶液，平行測定6次，試驗(yàn)結(jié)果見表4。

表4 方法精密度和加標(biāo)回收試驗(yàn)結(jié)果

由表4 可知，電子煙煙液樣品中雙乙酰和乙酰丙酰的平均回收率分別為97.0%～102.5%、95.0%～101.6%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為2.5%～2.7%、4.0%～4.3%；氣溶膠樣品中雙乙酰和乙酰丙酰平均回收率分別為93.4%～102.3%、92.7%～101.5%，測定結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為3.1%～3.7%、4.1%～4.6%，表明該方法有較好的準(zhǔn)確度和精密度。

2.5 樣品分析結(jié)果

2.5.1 煙液樣品

按照實(shí)驗(yàn)方法，對20 種市售電子煙液樣品進(jìn)行測定，測定結(jié)果見表5。由表5 可知，8 個(gè)樣品未檢出雙乙酰和乙酰丙酰，7 個(gè)樣品檢出其中1 種，剩余5 個(gè)樣品均檢測出雙乙酰和乙酰丙酰。雙乙酰測定結(jié)果的含量范圍為26.3～196.2 μg／g，乙酰丙酰的測定結(jié)果含量范圍為24.6～367.8 μg／g。表明在某些口味的煙液中使用了雙乙酰和乙酰丙酰作為香精進(jìn)行煙液調(diào)配。

表5 電子煙煙液樣品測定結(jié)果 μg／g

2.5.2 氣溶膠樣品

選擇2.5.1 中被檢出雙乙酰和乙酰丙酰的5 個(gè)煙液樣品(樣品編號分別為1#、2#、5#、7#、12#)，分別準(zhǔn)確稱取0.70 g 加至電子煙煙具中，抽吸前將電子煙具充滿電，稱量并記錄抽吸前后電子煙具質(zhì)量。采用CORESTA 推薦的電子煙抽吸模式，按2.2.4 處理方式捕集50 口氣溶膠樣品，采用建立的氣相色譜法進(jìn)行分析。每個(gè)樣品平行測試2 次，取平均值。試驗(yàn)數(shù)據(jù)見表6 中的實(shí)測濃度。為進(jìn)一步研究氣溶膠中雙乙酰和乙酰丙酰釋放量與煙液的關(guān)系，在測定氣溶膠樣品中雙乙酰和乙酰丙酰的同時(shí)，考察了雙乙酰和乙酰丙酰理論濃度與實(shí)測濃度之間的相關(guān)性。其中理論濃度是指根據(jù)抽吸前后煙液消耗量及煙液中雙乙酰和乙酰丙酰的質(zhì)量濃度計(jì)算出氣溶膠中目標(biāo)物的濃度，具體數(shù)據(jù)見表6 中的理論濃度。

表6 實(shí)測濃度與理論濃度 μg／50 口

對表6 中雙乙酰和乙酰丙酰的理論濃度與實(shí)測濃度的相關(guān)性進(jìn)行考察，分析結(jié)果見表7。

表7 理論濃度和實(shí)測濃度之間的相關(guān)性

由表7 可知，雙乙酰的理論濃度(基于煙液消耗計(jì)算得出)和實(shí)測濃度之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性(對于雙乙酰r2=0.990 1，對于乙酰丙酰r2=0.994 7)，表明了雙乙酰和乙酰丙酰揮發(fā)性較高，二者主要通過煙液霧化直接轉(zhuǎn)移至氣溶膠中。因此限定電子煙液中雙乙酰和乙酰丙酰的含量，可以有效減少由它們帶來的風(fēng)險(xiǎn)。

3 結(jié)語

建立了氣相色譜法測定電子煙液和氣溶膠中的雙乙酰、乙酰丙酰的含量。氣溶膠中雙乙酰的理論濃度(基于煙液消耗計(jì)算得出)和實(shí)測濃度之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性(對于雙乙酰r2=0.990 1，對于乙酰丙酰r2=0.994 7)，表明雙乙酰、乙酰丙酰通過煙液霧化直接轉(zhuǎn)移至氣溶膠中，因此限定電子煙液中雙乙酰和乙酰丙酰的含量，可以減少由它們帶來的風(fēng)險(xiǎn)。該方法準(zhǔn)確度高，重現(xiàn)性好、檢出限低，能滿足現(xiàn)行電子煙樣品的檢測需求。