顱腦損傷后彌漫性軸索損傷的CT表現(xiàn)與患者神經(jīng)元水通道蛋白表達(dá)的相關(guān)性

阮嬌妮，宋黎濤

(上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院 醫(yī)學(xué)影像科，上海200137)

彌漫性顱腦軸索損傷(DAI)是指頭部受到外傷引起的彌漫分布于腦白質(zhì)、以軸索損傷為主要改變的一種原發(fā)性腦實質(zhì)的損傷[1-3]。DAI作為神經(jīng)外科中一種多發(fā)的常見疾病，對患者健康及生命安全存在嚴(yán)重威脅[4-5]。計算機(jī)斷層掃描(CT)由于成像速度快，骨折信號顯示較好，長期以來一直是DAI診斷的首要檢查方式，其對于DAI的及早診斷及治療、提高患者治愈及預(yù)后效果起著積極的作用[6-7]。

水通道蛋白(AQP)廣泛分布在細(xì)胞膜上，對細(xì)胞水代謝起著重要的調(diào)節(jié)作用，是一組與水通透密切相關(guān)的細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白[8-10]。研究表明，腦組織中大量存在著AQP-1、AQP-4和AQP-9，在腦脊液的生成過程中發(fā)揮著重要作用[11]。近年來大量研究證實AQP-4與顱腦損傷高度相關(guān)[12]，但是關(guān)于DAI的CT表現(xiàn)與患者神經(jīng)元水通道蛋白表達(dá)的相關(guān)性研究卻鮮見報道?；诖耍疚难芯苛孙B腦損傷后DAI患者的CT表現(xiàn)和神經(jīng)元水通道蛋白的表達(dá)水平，并對兩者的相關(guān)性進(jìn)行了分析。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2019年1月至2019年12月就診于上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬第七人民醫(yī)院神經(jīng)外科的150例創(chuàng)傷性顱腦損傷患者為研究對象，經(jīng)CT檢查和臨床診斷后所有患者均為彌漫性軸索損傷。臨床表現(xiàn)為惡心、嘔吐、頭痛及不同程度昏迷等。

DAI患者根據(jù)顱腦CT和GCS(格拉斯哥昏迷)量表評分判定顱腦損傷程度，并將患者分為輕型、中型及重型三組。其中輕型組GCS評分在13-15之間，顱腦CT無明顯異常；中型組GCS評分在9-12之間，顱腦CT中顯示部分血腫及出血，中線結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)<3 mm的移位；重型組GCS評分在3-8之間，顱腦CT中顯示顱內(nèi)散布出血灶及蛛網(wǎng)膜下腔出血，腦池封閉或變窄梗死，中線結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)3 mm以上的移位。選擇同期入院的50名健康體檢者作為對照組。

1.1.1入選標(biāo)準(zhǔn) DAI患者納入標(biāo)準(zhǔn)： ① 經(jīng)頭部CT及臨床診斷確診；②入院時GCS量表評分>3分，表現(xiàn)出不同程度的語言和認(rèn)知障礙，腦顱損傷原因明確者；③行開顱手術(shù)治療；④伴有惡心、嘔吐、頭痛及不同程度昏迷等臨床癥狀者。

1.1.2排除標(biāo)準(zhǔn) DAI患者排除標(biāo)準(zhǔn)：①病情迅速惡化且在短時間內(nèi)死亡患者；②開放性顱腦損傷患者；③臨床信息缺失、不全者；④首次CT檢查需即刻手術(shù)患者；⑤抑郁、狂躁、精神分裂等精神系統(tǒng)疾病患者；⑥心臟病、糖尿病、肝腎功能不全者等；⑦惡性腫瘤患者；⑧自身免疫性疾病患者；⑨存在腦顱損傷既往史、癲癇等其它精神疾病史者。

1.1.3醫(yī)學(xué)倫理問題 受試者遵循自愿參加的原則，簽署研究同意書，并經(jīng)過我院倫理委員會批準(zhǔn)。依據(jù)臨床研究指南充分保障受試者的隱私及安全。

1.2 方法

1.2.1一般資料 記錄研究對象年齡、性別、第一次CT時間等一般指標(biāo)，比較并排除組間差異。

1.2.2CT檢查方法 所有患者均在顱腦損傷24 h內(nèi)采用美國GE Highspeed雙層螺旋CT機(jī)進(jìn)行CT掃描?；颊呷⊙雠P位，頸部置于伸屈中間位(眼耳平面垂直于地)，家屬協(xié)同患者盡量使其頭部保持靜止?fàn)顟B(tài)，減少運(yùn)動偽影的產(chǎn)生。采用橫軸位連續(xù)掃描，掃描參數(shù)為：電壓120 kV，電流150 mA，視野25 cm，矩陣512×512，層厚10 mm，層間距為10 mm，掃描基線與OML(外齜與同側(cè)外耳道口連線)平行，自顱底至顱頂持續(xù)性無間隔掃描，并在疑似病灶位置進(jìn)行層厚為5 mm的薄層掃描。

1.2.3顱腦水腫帶面積 根據(jù)患者顱腦CT圖片中水腫帶面積評估腦水腫情況，其中水腫帶面積以CT影像中最大水腫層面計。公式如下：顱腦水腫帶面積=(水腫帶外長徑×水腫帶外長徑)-(水腫帶內(nèi)長徑×水腫帶內(nèi)短徑)。

1.2.4Gless神經(jīng)纖維及軸索染色法 開顱手術(shù)過程中取三組患者水腫或挫傷灶周邊1-2 cm處腦組織標(biāo)本，并取遠(yuǎn)隔腦血腫及挫傷處相對正常的腦組織作為對照組。將各標(biāo)本用20%多聚甲醛固定24 h，梯度乙醇浸泡、石蠟包埋、平面腦組織切片后，60℃烘烤25 min。脫蠟水化、蒸餾水浸泡后，20%新鮮配置硝酸銀浸漬30 min，10%福爾馬林還原3次。隨后浸入新鮮配置的Gless胺銀溶液30 s，10%福爾馬林還原3次，蒸餾水反復(fù)清洗2次，硫代硫酸鈉(5%)固定2 min，水洗。梯度酒精浸泡脫水，二甲苯溶液將其透明化后，中性樹膠封片晾干。將封片置于顯微鏡下，觀察患者腦組織病理形態(tài)變化并記錄視野下軸索損傷數(shù)。

1.2.5RT-PCR法檢測患者血清中AQP-4基因表達(dá)的影響 抽取對照組及三組DAI患者組空腹靜脈血(顱腦損傷后24 h內(nèi)、3 d及7 d)，采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)方法檢測血清中AQP-4水平。PCR擴(kuò)增條件為：94℃預(yù)變性2.5 min，93℃變性30 s，60℃退火25 s，70℃延伸30 s，循環(huán)35次，最后71℃延伸60 s。取10 μl擴(kuò)增產(chǎn)物和6 μl的Maker同時上樣，于3.0%的瓊脂糖凝膠電泳分離(120V 40 min)，銀染色，紫外凝膠成像系統(tǒng)分析擴(kuò)增結(jié)果并拍照。

1.2.6Western blot分析AQP-4蛋白表達(dá)水平變化 配置一定濃度的SDSPAGE電泳凝膠并置于電泳槽上，將各組條件下細(xì)胞制備的蛋白(CREB、pCREB)上樣并電泳。電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，封閉并用TBST清洗后分別加入稀釋過的蛋白抗體(1抗)，4℃過夜，TBST清洗4次(每次5 min)；隨后加入HRP標(biāo)記的2抗，37℃孵育2 h，TBST洗4次*5 min。設(shè)立陰性對照組，以GAPDH單克隆體為一抗，HRP標(biāo)記的IgG為二抗。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS20.0統(tǒng)計分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理；統(tǒng)計結(jié)果均采用“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示；多樣本間均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間均數(shù)兩兩比較采用最小顯著差異LSD-t檢驗；P<0.05代表差異存在統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患者一般情況

對照組及三組DAI患者基本情況如表1所示。由表1可知，各組患者在年齡、男女比例及顱腦損傷后第一次CT時間均無明顯差異(P>0.05)，可排除上述因素對測試結(jié)果造成的干擾，數(shù)據(jù)具有可比性。見表1。

表1 患者一般資料

2.2 各組腦組織病理形態(tài)學(xué)變化

各組患者彌漫性軸索損傷病理形態(tài)學(xué)變化如表2所示。鏡下觀察顯示，對照組腦組織結(jié)構(gòu)完成，神經(jīng)細(xì)胞排列整齊，胞漿豐富，細(xì)胞間隙正常，無軸索損傷；DAI輕型組腦組織疏松，神經(jīng)元細(xì)胞周圍出現(xiàn)透明間隙，呈輕微水腫狀，軸索損傷數(shù)較對照組差異顯著(P<0.05)；DAI中型組神經(jīng)細(xì)胞水腫，細(xì)胞核濃縮，水腫和軸索損傷加劇(P<0.05)；DAI重型組病變更加明顯，血管和細(xì)胞周圍間隙進(jìn)一步擴(kuò)大，空泡樣明顯，水腫情況更加嚴(yán)重，軸索損傷數(shù)目最多。見表2。

表2 各組患者彌漫性軸索損傷的病理形態(tài)學(xué)變化

2.3 患者顱腦水腫情況比較

對照組及各組DAI患者顱腦水腫情況比較見表3。由表3可知，健康對照組顱腦CT顯示無水腫情況發(fā)生，顱腦損傷后，各DAI組均出現(xiàn)顱腦水腫情況。隨著彌漫性軸索損傷程度的增加， 水腫帶面積較輕型組明顯增大，組間差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)果表明隨著彌漫性軸索損傷程度的增加，患者顱腦水腫情況更加嚴(yán)重。

表3 患者顱腦水腫程度比較

2.4 顱腦損傷后彌漫性軸索損傷的CT表現(xiàn)

病灶形態(tài)呈結(jié)節(jié)狀、卵圓型或斑點狀，CT影像呈現(xiàn)較高密度，邊界清晰，未見明顯占位效應(yīng)；部分伴發(fā)顱內(nèi)損傷患者呈現(xiàn)腦裂變窄、腦池變小，蛛網(wǎng)膜下腔出血、硬膜下血腫等。

2.5 各組患者血清中AQP-4基因表達(dá)水平的變化

AQP-4及GAPDH引物設(shè)計見表4。

表4 PCR過程中引物序列設(shè)計

對照組及各組DAI患者血清中AQP-4水平見表5。由表5可知，對照組在各時間點AQP-4水平均較為穩(wěn)定，各DAI患者組血清中AQP-4水平在術(shù)后3天均達(dá)到高峰，術(shù)后7天水平有所降低，各組顱腦損傷患者在24 h內(nèi)、3天、7天血清中AQP-4水平差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與健康對照組相比，各時間點DAI患者組血清中AQP-4水平均顯著升高，差異顯著(P<0.05)；且隨著彌漫性軸索損傷程度的增加，AQP-4升高程度更加明顯。結(jié)果說明顱腦彌漫性軸索損傷具有促進(jìn)神經(jīng)元水通道蛋白AQP-4釋放的功能，AQP-4的釋放進(jìn)一步提高影響腦組織通透性，加劇腦組織的水腫及損傷程度。

表5 RT-PCR 檢測AQP-4基因表達(dá)情況

2.6 各組患者腦組織AQP-4蛋白表達(dá)水平的變化

對照組及各組DAI患者腦組織中AQP-4蛋白表達(dá)水平見表6。由表6可知，與對照組相比，各DAI患者組腦組織中AQP-4水平顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著彌漫性軸索損傷程度的增加，AQP-4蛋白表達(dá)水平進(jìn)一步提高，差異顯著(P<0.05)。

表6 AQP-4蛋白表達(dá)情況

2.7 各組患者CT表現(xiàn)與AQP-4蛋白表達(dá)的相關(guān)性

Spearman相關(guān)分析表明，各組患者CT表現(xiàn)與AQP-4蛋白表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)(r=0.78，P<0.05)。提示AQP-4蛋白可作為判斷彌漫性顱腦軸索損傷的分子標(biāo)記物。

3 討論

彌漫性軸索損傷(DAI)是在頭部受到外力作用后，以軸索斷裂為主要特征的原發(fā)性彌漫性腦損傷[13-14]。目前對DAI病情及預(yù)后的評估主要依賴于醫(yī)學(xué)影像、臨床癥狀和生命體征等。CT可清晰的顯示DAI腦水腫及出血灶情況，但對非出血性直徑小于2 cm的微小病灶不敏感，不能準(zhǔn)確的反應(yīng)病變程度[15,16]。神經(jīng)元水通道蛋白AQP-4主要分布在血腦屏障血管周圍，對中樞神經(jīng)系統(tǒng)中液體的轉(zhuǎn)運(yùn)起著重要的調(diào)節(jié)作用，同時也參與血漿膠體滲透壓的調(diào)控[17-19]。研究表明，正常生理狀態(tài)下腦細(xì)胞中AQP-4水平較低，當(dāng)神經(jīng)細(xì)胞受損后，AQP-4可通過血腦屏障進(jìn)入腦脊液，在彌漫性軸索顱腦損傷的發(fā)生、發(fā)展進(jìn)程中發(fā)揮著重要的作用[20]。

目前，關(guān)于DAI的CT表現(xiàn)與患者神經(jīng)元水通道蛋白表達(dá)的相關(guān)性研究鮮見報道。基于此，本文選取經(jīng)CT檢查和臨床診斷為彌漫性軸索損傷的150例患者為研究對象，根據(jù)顱腦CT和GCS量表評分將患者分為DAI輕型、中型及重型三組，并以同期入院體檢的50名健康體檢者作為對照組。各組患者在年齡、性別及顱腦損傷后第一次CT時間均無明顯差異，數(shù)據(jù)具有可比性。彌漫性軸索損傷病理形態(tài)學(xué)及顱腦水腫結(jié)果表明，DAI各組腦組織結(jié)構(gòu)疏松、呈水腫狀，軸索有一定程度的損傷，且隨著損傷程度的增加，水腫程度及軸索損傷數(shù)量急劇增加，差異顯著(P<0.05)。顱腦CT影像結(jié)果表明，典型的DAI病灶呈結(jié)節(jié)狀、卵圓型或斑點狀，密度較高，無明顯占位效應(yīng)；部分伴發(fā)顱內(nèi)損傷患者呈現(xiàn)腦裂變窄、腦池變小，硬膜下血腫等，與患者臨床診斷一致，可作為DAI快速高效診斷的有效依據(jù)。為了進(jìn)一步探究彌漫性軸索損傷的CT表現(xiàn)與患者神經(jīng)元水通道蛋白表達(dá)的相關(guān)性，我們采用RT-PCR和Western blot法檢測了患者血清及腦組織中AQP-4水平的變化。RT-PCR及Western blot檢測分析表明，與健康對照組相比，各DAI患者組血清及腦組織中AQP-4水平顯著提高，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。隨著彌漫性軸索損傷程度的增加，AQP-4表達(dá)水平進(jìn)一步提高，差異顯著(P<0.05)。結(jié)果說明顱腦彌漫性軸索損傷具有促進(jìn)神經(jīng)元水通道蛋白AQP-4釋放的功能，AQP-4的釋放進(jìn)一步提高影響腦組織通透性，加劇腦組織的水腫及損傷程度。Spearman相關(guān)性分析表明，各組患者CT表現(xiàn)與AQP-4蛋白表達(dá)水平呈明顯正相關(guān)，提示AQP-4蛋白可作為判斷彌漫性顱腦軸索損傷的分子標(biāo)記物。

綜上所述，顱腦CT影像可作為DAI快速高效診斷的有效依據(jù)，患者神經(jīng)元水通道蛋白AQP-4表達(dá)水平與顱腦損傷DAI的CT表現(xiàn)正相關(guān)，提示AQP-4可作為判斷DAI病情及預(yù)后的一個重要指標(biāo)，這就為臨床診斷及治療DAI提供了一種新的無創(chuàng)檢測手段，具有較高的臨床應(yīng)用價值。