微小RNA628-5p/Tyrobp對(duì)阿爾茲海默病潛在的診斷和治療價(jià)值

張 瑜，呂周艷，李艷冰，王蕾蕾

(吉林大學(xué)第一醫(yī)院 干部病房，吉林 長(zhǎng)春130021)

阿爾茨海默病(AD) 是一種嚴(yán)重的神經(jīng)退行性疾病，并伴有進(jìn)行性認(rèn)知功能下降，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，已經(jīng)成為了一個(gè)全球性的公共健康問題[1]。目前淀粉樣蛋白假說是被廣泛接受的AD發(fā)病機(jī)制之一[2]，β-淀粉樣肽(Aβ)在人腦細(xì)胞中的持續(xù)積累是AD的核心病理改變。許多抑制Aβ的產(chǎn)生和促進(jìn)Aβ分解的藥物被相繼開發(fā)出來，然而隨著這些靶向藥物在三期臨床試驗(yàn)中的失敗[3]，尋找AD新的分子機(jī)制變得非常必要，這將有利于對(duì)AD的診斷以及新的靶點(diǎn)藥物的研發(fā)。

1 資料與方法

1.1 AD小鼠核心發(fā)病基因分析

搜集GEO數(shù)據(jù)庫(kù)獲取6例APP/PS1小鼠以及6例正常小鼠海馬組織進(jìn)行RNA測(cè)序(GSE113141)。將全部差異表達(dá)基因應(yīng)用DAVID軟件進(jìn)行基因名稱轉(zhuǎn)換。然后行蛋白互作網(wǎng)絡(luò)分析，cytoHubba在線分析，按照評(píng)分篩選出分值最高的基因行miRNA預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的miRNA和GSE138382進(jìn)行Venn分析，最終篩選出共同表達(dá)的miRNA，從而鎖定AD的核心發(fā)病基因。

1.2 核心基因表達(dá)量的驗(yàn)證

天恩澤試劑盒提取3例APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和3例正常小鼠海馬組織的RNA，應(yīng)用BaiTeke試劑盒進(jìn)行RNA的逆轉(zhuǎn)錄以及實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)(qRT-PCR)，驗(yàn)證核心基因在轉(zhuǎn)基因小鼠以及正常小鼠海馬組織中的表達(dá)量。其中逆轉(zhuǎn)錄過程RNA總量設(shè)定為1 000 ng。

1.3 核心基因蛋白電泳

對(duì)3例APP/PS1小鼠以及3例正常小鼠海馬組織應(yīng)用碧云天試劑盒提取蛋白質(zhì)，BCA濃度測(cè)定后，按照4∶1的比例加入上樣緩沖液，在100℃下煮沸4 min。隨后蛋白電泳，應(yīng)用索萊寶試劑盒配置濃縮膠和分離膠，80伏以及120 V的電壓下進(jìn)行20 min和60 min電泳。對(duì)目標(biāo)蛋白轉(zhuǎn)膜，轉(zhuǎn)膜條件為橫流300 A，50 min。5%脫脂牛奶孵育2 h后，一抗蛋白抗體孵育14 h，洗膜，二抗蛋白抗體孵育50 min，洗膜后蛋白顯影。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS20.0進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn)。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義?；虿町惐磉_(dá)倍數(shù)計(jì)算采用2-ΔΔCt算法。

2 結(jié)果

2.1 高通量生物信息分析

利用二代測(cè)序技術(shù)對(duì)全部62976個(gè)基因進(jìn)行檢測(cè)(圖1A)。其中存在大量的過高表達(dá)和過低表達(dá)的測(cè)序結(jié)果，均一性較差。通過limma數(shù)據(jù)包對(duì)全部數(shù)據(jù)進(jìn)行矯正后，數(shù)據(jù)均一性較好(圖1B)。對(duì)矯正后的數(shù)據(jù)進(jìn)一步篩選，在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組之間總共發(fā)現(xiàn)153個(gè)差異上調(diào)表達(dá)的基因和197個(gè)差異下調(diào)表達(dá)的基因。蛋白互作網(wǎng)絡(luò)及CytoHubba顯示Tyrobp可能是AD的核心發(fā)病基因。

2.2 miR628-5p/Tyrobp在AD小鼠表達(dá)量結(jié)果

生物信息網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)以及GSE138382共表達(dá)分析結(jié)果顯示miR628-5p可能通過直接調(diào)控Tyrobp的3’UTR影響AD小鼠的發(fā)病過程。小鼠海馬組織RNA提取結(jié)果顯示APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠海馬組織RNA濃度為266.1±11.3 ng/μl，287.4±9.6 ng/μl。qRT-PCR顯示miR628-5p在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中CT值為6.32±0.45，在正常小鼠海馬組織中CT值3.18±0.33，差異倍數(shù)為8.815(表1)，說明miR628-5p在AD小鼠中呈現(xiàn)差異性低表達(dá)，表達(dá)陽(yáng)性率為100%。Tyrobp在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中CT值為2.73±0.23，在正常小鼠海馬組織中CT值4.56±0.43，差異倍數(shù)為3.556倍,因此Tyrobp在AD小鼠中呈現(xiàn)差異性高表達(dá)。

2.3 Tyrobp在AD小鼠蛋白表達(dá)量結(jié)果

Tyrobp蛋白在APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中較正常小鼠海馬組織中呈現(xiàn)高表達(dá)。同時(shí)Tyrobp蛋白升高的APP/PS1轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織中也高表達(dá)Aβ蛋白以及APP蛋白(圖2)，說明Tyrobp蛋白和AD小鼠海馬組織退化程度呈現(xiàn)正相關(guān)。

表1 海馬組織RNA相關(guān)參數(shù)

圖1 基因芯片原始數(shù)據(jù)矯正處理

3 討論

AD是一種進(jìn)行性認(rèn)知功能下降的神經(jīng)退行性疾病。主要的病理特征包括大量老年斑沉積、神經(jīng)纖維纏結(jié)和選擇性的特定腦區(qū)如大腦皮層和海馬神經(jīng)元及突觸的丟失。淀粉樣蛋白假說是被廣泛接受和認(rèn)可的發(fā)病機(jī)制。因此針對(duì)Aβ的干預(yù)從而治療AD被給予了巨大的希望[4-6]。但是Aβ的干預(yù)似乎未能達(dá)到人們預(yù)想的效果，故新的AD分子發(fā)病機(jī)制以及藥物靶點(diǎn)需要被重新的研究。微小RNA作為非編碼RNA中的一類特殊的基因，其不具備蛋白編碼功能，但是可以調(diào)控編碼基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯，進(jìn)而參與到疾病的發(fā)生和發(fā)展中。對(duì)RNA表達(dá)量的檢測(cè)以及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的干預(yù)有望成為未來血清學(xué)檢查標(biāo)志物以及藥物治療靶點(diǎn)。

圖2 Tyrobp在AD小鼠蛋白表達(dá)量

通過對(duì)AD的轉(zhuǎn)基因小鼠和正常小鼠海馬組織測(cè)序結(jié)果生物信息學(xué)分析，酪氨酸激酶結(jié)合蛋白(Tyrobp)可能是AD發(fā)病的核心基因。Tyrobp是一種小膠質(zhì)細(xì)胞跨膜標(biāo)志性多肽，與受體結(jié)合后在小膠質(zhì)細(xì)胞表面形成吞噬活性區(qū)(吞噬突觸)參與免疫反應(yīng)。Pottier[7]等人在2016年首次報(bào)道檢測(cè)AD患者體內(nèi)Tyrobp的含量很有可能對(duì)早期AD患者具有診斷性作用。隨后二代測(cè)序的發(fā)展以及Tyrobp在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的開展，不斷發(fā)現(xiàn)Tyrobp和AD的病理改變密切相關(guān)。Tyrobp參與的免疫反應(yīng)可以介導(dǎo)可溶性Aβ對(duì)突觸的毒性作用，而AD中免疫反應(yīng)的過度激活會(huì)導(dǎo)致突觸過度修剪和突觸丟失[8]。但是MA等人認(rèn)為Tyrobp增高同時(shí)能夠抑制機(jī)體的免疫反應(yīng)從而抑制小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞因子的產(chǎn)生和分泌[9]。雖然對(duì)于Tyrobp在AD患者發(fā)病機(jī)制的具體作用尚不清楚，但Tyrobp在AD患者體內(nèi)升高是大家公認(rèn)的。本文結(jié)果發(fā)現(xiàn)在AD小鼠海馬組織中Tyrobp較正常小鼠海馬組織內(nèi)高表達(dá)3.556倍，說明針對(duì)Tyrobp的檢測(cè)干預(yù)很可能成為AD的血清學(xué)診療標(biāo)志物。同時(shí)Aβ以及APP蛋白與Tyrobp表達(dá)趨勢(shì)一致，說明對(duì)Tyrobp 的干預(yù)可能成為延緩腦神經(jīng)元退行性病變的一種手段。而進(jìn)一步對(duì)與Tyrobp有結(jié)合位點(diǎn)的miRNA進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，miR628-5p能夠調(diào)控Tyrobp的表達(dá)參與到AD的發(fā)病過程，但目前miR628-5p的報(bào)道較少，針對(duì)miR628-5p在AD中的作用機(jī)制仍需要探索。

綜上，本文通過對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠海馬組織的qRT-PCR驗(yàn)證，證實(shí)miR628-5p/Tyrobp可以作為AD的早期診斷血清學(xué)標(biāo)志物。并且miR628-5p和Tyrobp均在小鼠海馬組織中呈現(xiàn)差異性表達(dá)，其診斷的陽(yáng)性率幾乎為100%。針對(duì)miR628-5p/Tyrobp進(jìn)行靶向治療及干預(yù)有望成為AD治療的新方法。