哈爾濱市老年人膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎血清金屬元素分析及生物標(biāo)志物篩選*

王聲雨，崔 宇，林 源

1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院，黑龍江 哈爾濱 150000；2.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)衛(wèi)生管理學(xué)院，黑龍江 哈爾濱 150086

骨性關(guān)節(jié)炎（Osteoarthritis, OA）是以滑膜關(guān)節(jié)軟骨退變?yōu)樘卣?，伴隨關(guān)節(jié)周圍骨質(zhì)增生，常累及關(guān)節(jié)滑膜、關(guān)節(jié)囊、軟骨下骨、韌帶等結(jié)構(gòu)，是一種全關(guān)節(jié)疾病［1］。隨著人口老齡化的逐年加劇，目前我國60 歲以上人口已超過1億，骨性關(guān)節(jié)炎患者已經(jīng)超過5000萬。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，我國60 歲以上和70 歲以上的老年人口中，骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)病率分別為55%和80%［2］。骨性關(guān)節(jié)炎對(duì)人們健康的危害早已引起了重視。對(duì)于晚期髖、膝、踝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的保守治療效果較差，只有行關(guān)節(jié)置換或關(guān)節(jié)融合手術(shù)，而對(duì)于其他關(guān)節(jié)并沒有有效的治療方法，帶來了嚴(yán)重的社會(huì)負(fù)擔(dān)。雖然世界范圍內(nèi)廣大學(xué)者經(jīng)過多年的研究，但其發(fā)病機(jī)制仍未完全闡明。目前國內(nèi)外對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病機(jī)制的研究只要集中在細(xì)胞因子學(xué)說、基質(zhì)金屬蛋白酶降解學(xué)說、自由基學(xué)說、骨內(nèi)壓增高學(xué)說等。本研究采用電感耦合等離子體質(zhì)譜（ICP-MS）分析技術(shù), 對(duì)重度膝骨性關(guān)節(jié)炎患者和對(duì)照組患者血清中21種元素進(jìn)行分析, 探討人體內(nèi)金屬元素的水平和疾病發(fā)生、發(fā)展的關(guān)系，為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制研究和診治提供相關(guān)的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

在研究對(duì)象選擇的過程中，排除選擇性偏倚，確定所有病例組及對(duì)照組研究對(duì)象均為哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科住院患者，按病例組與對(duì)照組數(shù)量接近1∶1選擇。

1.1.1 病例組及對(duì)照組的選擇：病例組納入標(biāo)準(zhǔn):（1）黑龍江省哈爾濱市原籍居民；（2）在黑龍江省哈爾濱市居住≥20年的外來居民；（3）年齡介于50 歲～75 歲之間；（4）符合膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；（5）排除繼發(fā)性骨性關(guān)節(jié)炎患者；（6）排除患有糖尿病等代謝性疾病、心臟病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤性疾病；（7）排除其他部位有臨床表現(xiàn)的退行性疾病。對(duì)照組納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）黑龍江省哈爾濱市原籍居民；（2）在黑龍江省哈爾濱市居住≥20年的外來居民；（3）年齡介于50 歲～75 歲之間；（4）非關(guān)節(jié)疾病患者；（5）排除患有糖尿病等代謝性疾病、心臟病、自身免疫性疾病、惡性腫瘤性疾??；（6）排除其他部位有臨床表現(xiàn)的退行性疾病。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)備與試劑：電感耦合等離子體質(zhì)譜儀Agilent 7700x（美國安捷倫科技有限公司）；-80°C 超低溫冰箱U410（美國新布朗什維克科學(xué)公司）；渦旋混合器XK96-A（姜堰市醫(yī)療器械廠）；自動(dòng)進(jìn)樣器Agilent IA-89（美國安捷倫科技有限公司）；純化水制備系統(tǒng)MILLI-Q（美國密理博公司）多元素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（美國安捷倫科技有限公司）；多元素內(nèi)標(biāo)混合液（美國安捷倫科技有限公司）；調(diào)諧液（美國安捷倫科技有限公司）；硝酸（優(yōu)級(jí)純）；雙氧水（優(yōu)級(jí)純）。

1.2 研究方法

1.2.1 樣本采集及處理：應(yīng)用無菌真空負(fù)壓采血管采集研究對(duì)象的晨空腹靜脈血，3 000 r/min 離心，取上層黃色半透明狀液體即血清樣本，分裝，-80℃保存，備用。

1.2.2 樣品測(cè)定:室溫下解凍血清樣本，渦旋振蕩器中振蕩混勻30 s，移取0.2血清樣本至消解管后分別加入0.3 ml硝酸、0.3 ml 雙氧水，置于130℃烘箱中消化2 h 至溶液澄清透明，取出冷卻后定容，待測(cè)。取待測(cè)液樣品置入電感耦合等離子體質(zhì)譜儀自動(dòng)進(jìn)樣瓶中，自動(dòng)檢測(cè)21種元素。電感耦合等離子體質(zhì)譜儀最佳工作條件，見表1。

表1 電感耦合等離子體質(zhì)譜儀最佳操作條件

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

本實(shí)驗(yàn)使用到的統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件包括：Epidata3.1、SIMCA-P12.0、SPSS 13.0，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）形式表示，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者組和對(duì)照組間元素含量的分析采用Mann-Whitney U檢驗(yàn)以及偏最小二乘法。

2 結(jié)果

2.1 檢出限、曲線相關(guān)系數(shù)、線性范圍

本研究在避開同質(zhì)異位素和氧化物等多原子離子干擾的前提下，選擇各元素最高豐度的同位素進(jìn)行測(cè)定，相關(guān)系數(shù)及檢出限見，見表2。

表2 血清樣品中21種元素檢出限和相關(guān)系數(shù)

2.2 加標(biāo)回收率和精密度實(shí)驗(yàn)

加標(biāo)回收率測(cè)定是實(shí)驗(yàn)室確定方法準(zhǔn)確性的質(zhì)量控制手段之一，結(jié)果見表3。

表3 血清樣本加標(biāo)回收率及精密度

2.3 血清樣本檢測(cè)結(jié)果分析

實(shí)驗(yàn)對(duì)膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者組和健康對(duì)照組人群血清中鋁（Al）、砷（As）、鋇（Ba）、鈣（Ca）、鎘（Cd）、鈷（Co）、鉻（Cr）、銅（Cu）、鐵（Fe）、鋰（Li）、鎂（Mg）、錳（Mn）、鉬（Mo）、鎳（Ni）、鉛（Pb）、硒(Se)、鍶（Sr）、鈦（Ti）、鉈（Tl）、釩（V）、鋅（Zn）等21種元素進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果，見表4。

由于低于方法的定量檢出限，實(shí)驗(yàn)中有6種元素（Ti、V、Ni、As、Mo、Tl）未能檢出。所以本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)出了血清樣品中15種元素，經(jīng)過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎組與對(duì)照組比較中， Li、Cr、Mn、Co、Cu、Se 的含量有顯著差異（P＜0.05），其中Cr、Mn、Se 含量明顯下降；而Li、Co、Cu含量明顯升高。

表4 21種元素含量測(cè)定結(jié)果（±s） (μg/L)

注：帶#元素為mg/L

元素Al Ba Ca#Cd Cr Co Cu#Fe#Li Mg#Mn Se Sr Pb Zn Control（n=71）32.05±19.22 33.25±13.50 106.75±23.12 1.00±0.25 48.00±23.50 0.50±0.25 1.12±0.30 1.81±0.68 4.75±2.25 24.11±3.91 10.00±5.25 90.50±29.00 70.25±27.00 21.00±9.50 710.25±313.75 OA（n=76）30.15±14.68 34.50±12.00 109.22±19.99 1.00±0.50 27.00±11.75 0.75±0.25 1.22±0.26 1.71±0.51 7.25±2.75 24.96±3.11 8.25±2.75 82.75±25.00 66.25±17.25 21.50±8.75 787.25±369.00 P 0.37 0.44 0.36 0.86＜0.001＜0.001＜0.001 0.19＜0.001 0.05＜0.001 0.02 0.15 0.62 0.07

2.4 多變量統(tǒng)計(jì)分析

主成分分析得分圖能夠直觀的觀察到各組樣本分布情況，可以有效排除測(cè)定結(jié)果中的特異值見圖1。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果顯示，骨性關(guān)節(jié)炎組與對(duì)照組間相互交疊，并不能很好的對(duì)樣品進(jìn)行區(qū)分。

偏最小二乘判別分析為用于判別分析的多變量統(tǒng)計(jì)分析方法。通過得分圖（圖2），膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎組與對(duì)照組完全分開。并且可見此模型的具有較好的區(qū)分度和預(yù)測(cè)度。

圖1 骨性關(guān)節(jié)炎病例組和對(duì)照組患者血清金屬元素譜的主成分分析得分散點(diǎn)圖

圖2 骨性關(guān)節(jié)炎病例組和對(duì)照組血清金屬元素譜區(qū)分的偏最小二乘法判別分析模型圖

圖3 PLS-DA模型的載荷圖

2.5 金屬元素生物標(biāo)志物鑒定

研究中通過多變量統(tǒng)計(jì)分析中變量載荷的方法是探尋合適生物標(biāo)記物的常用手段。表現(xiàn)形式主要有載荷圖（Loading plot）和變量重要性投影（VIP），每種元素在模型中的貢獻(xiàn)情況可以很直觀的在圖中體現(xiàn)。圖3 中的每一個(gè)圓點(diǎn)代表一種元素，離原點(diǎn)越近說明這種元素對(duì)區(qū)分兩組的貢獻(xiàn)越小，反之越是遠(yuǎn)離原點(diǎn)，越提示此種元素可以有效區(qū)分兩個(gè)實(shí)驗(yàn)組，而作為相應(yīng)的生物標(biāo)志物。

變量投影重要性分析（Variable Importance in Projection, VIP）是較多采取的用來評(píng)價(jià)變量貢獻(xiàn)的方法。表5 為運(yùn)用VIP 值來篩選的本研究中的差異元素，我們可以發(fā)現(xiàn)與前面用載荷圖分析篩選的元素是一致的。所以綜上所述，Cr、Co、Li、Mn四種元素可以認(rèn)為是膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎病例組與對(duì)照組間明顯的具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的差異元素。

表5 病例組和對(duì)照組的差異元素

2.6 金屬標(biāo)志物的ROC分析

接收者操作特性曲線（receiver operating characteristic curve, ROC），簡(jiǎn)稱ROC 曲線，可以直觀反映待測(cè)指標(biāo)診斷價(jià)值，AUC 的值介于0 到1 之間。AUC 越大，預(yù)測(cè)的診斷價(jià)值越大。結(jié)果見（圖4），Li、Cr、Mn、Co 的曲線下面積分別為0.786，0.922，0.717 和0.858，均大于0.7，所以我們認(rèn)為這些元素可作為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的敏感可靠的血清生物標(biāo)志物。

圖4 OA病例組與對(duì)照組金屬元素的ROC分析

3 討論

在本世紀(jì)初，Haraguchi提出了一個(gè)新的研究方向，系統(tǒng)的研究機(jī)體內(nèi)的細(xì)胞、器官或組織中金屬或類金屬元素即“金屬組學(xué)”［3-4］。它是對(duì)機(jī)體細(xì)胞和組織內(nèi)，那些關(guān)系到金屬元素的相關(guān)生理、病理過程進(jìn)行研究的學(xué)科［5］。近年有研究表明在骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展中一些金屬元素亦有一定作用［6-7］。但研究大多集中在少數(shù)幾個(gè)元素上，例如銅，硒，鋅和鐵等元素。

本研究結(jié)果顯示，膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者體內(nèi)的含量與對(duì)照組相比，金屬鋰含量更高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。鋰元素對(duì)骨細(xì)胞及軟骨細(xì)胞代謝的影響具有雙向性。有體外試驗(yàn)研究表明鋰元素可以促使成軟骨細(xì)胞進(jìn)行分化，在機(jī)體內(nèi)可以促進(jìn)軟骨的再生［8］。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示骨性關(guān)節(jié)炎患者血清中鋰元素的濃度高于對(duì)照組，這與Krachler的研究相一致［9］。近期有研究表明［10］在試驗(yàn)中給小鼠口服適當(dāng)劑量的鋰鹽會(huì)引起小鼠的成骨反應(yīng)、提高骨密度；我們都知道骨性關(guān)節(jié)炎的局部病理變化之一，是病變關(guān)節(jié)周緣的骨質(zhì)增生及軟骨下骨的骨硬化，所以推測(cè)人體血液中鋰元素含量的升高可能與骨性關(guān)節(jié)炎某些特征性變化有關(guān)。有研究表明，氯化鋰抑制了IL-1處理的人和小鼠軟骨組織培養(yǎng)中蛋白多糖的降解；可以減輕軟骨退化的嚴(yán)重程度。鋰元素對(duì)骨及軟骨的代謝是有確切影響的，但在何種環(huán)境下、會(huì)引起何種影響還有待我們進(jìn)一步研究。

本研究中膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者血清中硒的含量明顯低于對(duì)照組，推測(cè)人體內(nèi)硒元素的缺乏可能是骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)病誘因之一。硒元素是人體必需的一種微量元素，屬于類金屬元素，對(duì)維持人體身體健康起著至關(guān)重要的作用。硒與骨關(guān)節(jié)疾病的相關(guān)性有很多研究。有報(bào)道，通過膳食補(bǔ)充硒可以有效預(yù)防以關(guān)節(jié)破壞為主要癥狀的大骨節(jié)病［11］，研究者認(rèn)為有機(jī)物腐蝕和糧食霉菌可以對(duì)人類的軟骨產(chǎn)生腐蝕作用，但硒元素加速軟骨細(xì)胞再生，促進(jìn)修復(fù)軟骨［12］。大骨節(jié)病與骨性關(guān)節(jié)炎在關(guān)節(jié)透明軟骨的病理學(xué)改變上有相似之處，最終都是引起關(guān)節(jié)軟骨的損毀；大量的研究已經(jīng)證實(shí)硒缺乏是導(dǎo)致大骨節(jié)病發(fā)生的重要誘因，因此推測(cè)硒缺乏可能也與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)［12，13］。

錳元素也是人體必需微量營養(yǎng)元素，它在人體中以活化劑的身份參與到多種酶系統(tǒng)的工作中。它在催化造血、參與機(jī)體蛋白質(zhì)及維生素的合成及維持軟骨結(jié)構(gòu)功能中起到重要作用。已有相關(guān)研究顯示人體血液系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、腫瘤等的發(fā)生與體內(nèi)錳元素含量異常有關(guān)［13，14］。本研究中膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者血清中錳元素的含量較對(duì)照組明顯減低，說明錳元素在血清中的變化與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生是有相關(guān)性的。Ruiz Romero 等［14］對(duì)人體退變的軟骨進(jìn)行一系列的實(shí)驗(yàn)研究，包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）、蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）和免疫組織熒光技術(shù)等，發(fā)現(xiàn)作為線粒體的抗氧化蛋白，錳超氧化物歧化酶在骨性關(guān)節(jié)炎的表層軟骨中明顯減少，所以推測(cè)軟骨細(xì)胞中線粒體的抗氧化蛋白錳-超氧化物歧化酶的缺乏導(dǎo)致軟骨的抗氧化能力下降，導(dǎo)致軟骨損傷及骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生。但目前還未發(fā)現(xiàn)有相關(guān)研究表明單獨(dú)補(bǔ)充錳元素對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎有治療作用［15］。

鉻元素作為必需的微量元素，在人體金屬代謝中發(fā)揮了重要的作用，是人體能量代謝過程中必不可少的的微量金屬元素之一；鉻元素除了參與糖類、脂質(zhì)、膽固醇等代謝，還具有防止血管硬化的功能［13］。鉻元素在骨組織的新陳代謝過程中發(fā)揮著重要作用，其中以離子狀態(tài)的鉻會(huì)影響成骨細(xì)胞的增殖，并對(duì)成骨細(xì)胞大小和形狀產(chǎn)生影響［16］。除此之外，有研究表明鉻元素也可以通過降低機(jī)體堿性磷酸酶的水平和增加鈣的含量來影響成骨細(xì)胞的活性［17］。有國外研究表明，如果機(jī)體內(nèi)金屬鉻的慢性聚集超過生理需求量的1.5倍，便可以引起骨量大量丟失，導(dǎo)致成骨細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的損傷，從而影響骨代謝過程。造成動(dòng)物骨關(guān)節(jié)疾病的發(fā)生［18］。Scimeca M 等人在對(duì)25例骨質(zhì)疏松癥和25 例骨性關(guān)節(jié)炎患者的骨進(jìn)行研究時(shí)發(fā)現(xiàn)，在這些患者體內(nèi)鉛，鎘和鉻的含量要明顯高于正常人［19］。

鈷元素是人體必需的微量元素。有研究表明，鈷可通過調(diào)節(jié)骨細(xì)胞代謝，從而影響骨吸收和骨形成的過程［17］。此外，F(xiàn)leury 等人證明通過鈷在體內(nèi)的累積，骨組織中的氧化應(yīng)激水平會(huì)得到進(jìn)一步增加。這些效應(yīng)可能是通過成骨樣細(xì)胞中的氧化還原狀態(tài)介導(dǎo)的，但其作用機(jī)制尚不清楚［20］。銅元素在人體的新陳代謝中發(fā)揮著重要的作用，在機(jī)體的大多數(shù)免疫細(xì)胞正常工作的過程中起著重要的作用，對(duì)維持機(jī)體防御系統(tǒng)的穩(wěn)定幫助很大。有研究者認(rèn)為銅可以降低骨轉(zhuǎn)換的速率，這是由于它可以對(duì)人體的成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞產(chǎn)生抑制作用來實(shí)現(xiàn)的。與此同時(shí)，作為賴氨酰氧化酶（LOX）的重要輔助因子，銅在膠原蛋白交聯(lián)彈性蛋白時(shí)起到至關(guān)重要的作用。機(jī)體內(nèi)銅的含量長(zhǎng)時(shí)間處于低水平狀態(tài)將使這些功能處于抑制狀態(tài)，嚴(yán)重的話將會(huì)引起軟骨的病變和破壞。但一項(xiàng)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究顯示：在比較吲哚美辛相關(guān)制劑對(duì)骨性關(guān)節(jié)炎的影響中發(fā)現(xiàn)，添加銅元素的吲哚美辛制劑組的大鼠，在骨性關(guān)節(jié)炎癥緩解程度上較對(duì)照組有一定優(yōu)勢(shì)，并且無論是在制劑的安全性方面還是在治療效果方面，銅-吲哚美辛合成劑即使是應(yīng)用最低的劑量也有非常好的表現(xiàn)［21］。

本研究希望通過金屬組學(xué)研究平臺(tái)發(fā)現(xiàn)哈爾濱市膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎患者血清中金屬元素變化情況及規(guī)律，篩選敏感、可靠的生物標(biāo)志物，為膝關(guān)節(jié)骨性關(guān)節(jié)炎的早期預(yù)防，早期診斷和早期治療提供科學(xué)的依據(jù)。