腐生絲狀嗜熱真菌分泌的嗜熱纖維素水解酶研究進(jìn)展

張正盈，江賢章

（福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350117）

嗜熱真菌是一類(lèi)在45～50 ℃高溫環(huán)境下生長(zhǎng)良好的真菌。對(duì)嗜熱真菌分泌的酶進(jìn)行研究，主要是為了研究他們?cè)谏锛夹g(shù)過(guò)程中的適用性，并探索常溫真菌和嗜熱真菌的酶在理化性質(zhì)上的差異。腐生絲狀嗜熱真菌是嗜熱真菌的一個(gè)重要分支。腐生絲狀嗜熱真菌被認(rèn)為是嗜熱酶的良好來(lái)源。腐生絲狀嗜熱真菌的基因組在編碼區(qū)的GC含量高于中溫真菌的GC含量，這一變化集中反映在密碼子的第三位。由于這一變化，腐生絲狀嗜熱真菌產(chǎn)生的嗜熱酶具有高溫適應(yīng)性和熱穩(wěn)定性，高催化活性，可以更強(qiáng)地抵抗變性劑并降低污染的發(fā)生率，對(duì)富含油脂、重金屬、植酸和多糖等的工業(yè)廢物和廢水具有生物修復(fù)作用。腐生絲狀嗜熱真菌可以用來(lái)生產(chǎn)淀粉酶、磷酸酶（包括植酸酶）、纖維素水解酶、蛋白酶等酶類(lèi)。這些酶在食品、紡織和洗滌劑、乳品、制藥等工業(yè)中都有應(yīng)用。本文對(duì)腐生絲狀嗜熱真菌分泌的三種主要嗜熱纖維素水解酶的應(yīng)用以及分子領(lǐng)域的研究現(xiàn)狀的最新信息進(jìn)行了綜述，使腐生絲狀嗜熱真菌更好地應(yīng)用于生物技術(shù)的研究工作。

1 嗜熱纖維二糖脫氫酶

纖維二糖脫氫酶（CDH）又被稱為纖維二糖氧化酶，是一類(lèi)黃素血紅素蛋白；1974年由Eriksson等人最早從Sporotrichum pulverulentum中發(fā)現(xiàn)，其相對(duì)分子量約為90 kDa，是一種對(duì)于pH和溫度較穩(wěn)定的酶。在應(yīng)用上，CDH可以提高纖維素酶的降解效率。嗜熱CDH的克隆和測(cè)序顯示該酶有3個(gè)結(jié)構(gòu)域：一個(gè)含催化位點(diǎn)的N-terminal黃素結(jié)構(gòu)域、中間血紅素結(jié)構(gòu)域以及與里氏木霉的纖維素酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域同源的C-terminal結(jié)合結(jié)構(gòu)域[1]。基于CDH序列分析，定義了四個(gè)系統(tǒng)發(fā)育類(lèi)。這些類(lèi)中CDHs在纖維素結(jié)合、底物特異性以及催化反應(yīng)中結(jié)構(gòu)域之間的電子轉(zhuǎn)移方面表現(xiàn)出不同的結(jié)構(gòu)和催化性能。在之后的研究中對(duì)Ⅰ類(lèi)和Ⅱ類(lèi)CDH的結(jié)構(gòu)、反應(yīng)機(jī)理和動(dòng)力學(xué)進(jìn)行了詳細(xì)的表征。CDH的重組表達(dá)在生物傳感器、生物燃料電池、生物質(zhì)水解及合成過(guò)程等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。腐生絲狀嗜熱真菌產(chǎn)生的嗜熱性纖維二糖脫氫酶具有更好的酶活性以及熱穩(wěn)定性，嗜熱纖維二糖脫氫酶在纖維素聚合、減少纖維素產(chǎn)物抑制以及抑制纖維素重聚合等方面都起到一定作用，可以進(jìn)一步優(yōu)化纖維素酶對(duì)于纖維素的降解作用。挖掘腐生絲狀嗜熱真菌中優(yōu)質(zhì)嗜熱纖維二糖水解酶，將在工業(yè)生產(chǎn)中具有巨大的應(yīng)用前景。

2 嗜熱木聚糖酶

木聚糖酶（Xylanase）是一類(lèi)降解木聚糖中β-1,4木糖苷鍵的酶系，對(duì)大量存在于自然界中的半纖維素具有重要作用。木聚糖酶普遍存在于甲殼類(lèi)動(dòng)物、植物、微生物中?，F(xiàn)如今，已測(cè)定了許多木聚糖酶基因完整的序列，如枯草桿菌W23的木聚糖酶基因序列。腐生絲狀嗜熱真菌產(chǎn)生的嗜熱木聚糖酶在工業(yè)紙漿生物漂白中具有一定優(yōu)勢(shì)而受到關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，從木質(zhì)素-碳水化合物復(fù)合物中除去木聚糖從而促進(jìn)木質(zhì)素的浸出，消除了在紙漿漂白過(guò)程中對(duì)氯的需要[2]。另外，嗜熱木聚糖酶能使木質(zhì)纖維素緊密吸附，具有較強(qiáng)的纖維素降解能力。嗜熱厭氧菌（Caldicellulosiruptor bescii）產(chǎn)生的嗜熱木聚糖酶屬于GH10家族，其底物特異性廣泛，有利于木質(zhì)纖維素降解；嗜熱木聚糖酶也可用于動(dòng)物飼料的預(yù)處理，以提高其消化率。一些經(jīng)過(guò)純化的嗜熱木聚糖酶的結(jié)構(gòu)已經(jīng)被確定，并通過(guò)結(jié)晶進(jìn)行結(jié)構(gòu)分析。

3 嗜熱纖維素酶

木質(zhì)纖維素是自然界中含量豐富的可再生資源，具有重要的經(jīng)濟(jì)意義。纖維素酶是一類(lèi)將纖維素降解為寡糖或葡萄糖的蛋白質(zhì)，由多種水解酶構(gòu)成，由內(nèi)切葡聚糖酶（endo-1,4-β-D-glucosidase，EG）、外切葡聚糖酶（exo-1,4-β-D-glucosidase，CBH）、β-葡萄糖苷酶（β-1,4-glucosidase，BG）的協(xié)作來(lái)實(shí)現(xiàn)從纖維素到單糖的轉(zhuǎn)化。利用纖維素酶將木質(zhì)纖維素轉(zhuǎn)化為增值產(chǎn)品是一種重要的策略[3]。在較高的溫度下，纖維素會(huì)膨脹，更容易斷裂。嗜熱纖維素酶目前成為高效降解生物質(zhì)的關(guān)鍵酶。

腐生絲狀嗜熱真菌中含有種類(lèi)豐富的纖維素酶。李多川等[4]克隆了嗜熱毀絲菌和嗜熱毛殼菌的cbh1基因和eg2基因，在畢赤酵母中進(jìn)行異源表達(dá)，構(gòu)建了pPIC9K-cbh1和pPIC9K-eg2表達(dá)載體，并通過(guò)不斷篩選獲得具有更高活性的嗜熱纖維素酶[5]。Jiang等人[6]評(píng)估了嗜熱毛殼菌（C.thermophilum）的木質(zhì)纖維素降解能力，并將其與里氏木霉（Trichoderma reesei）的木質(zhì)纖維素降解能力進(jìn)行了比較。結(jié)果顯示，嗜熱毛殼菌顯示出更高的纖維素利用效率，而纖維素酶的產(chǎn)量相對(duì)較低，表示嗜熱毛殼菌中可能存在更好的纖維素酶。對(duì)兩種菌的主要纖維素酶纖維二糖水解酶Ⅰ（CBH1）進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)嗜熱毛殼菌的比活性比里氏木霉CBH1高約4.5倍。為了探討提高里氏木霉的CBH1活性是否有助于提高里氏木霉整體纖維素的利用效率，用嗜熱毛殼菌cbh1基因替代了里氏木霉cbh1基因。數(shù)據(jù)表明，該基因置換不僅使纖維二糖水解酶Ⅰ（CBH1）的活性增加了約4.1倍，還導(dǎo)致了其他纖維素酶基因的更強(qiáng)誘導(dǎo)作用。

4 展望

腐生絲狀嗜熱真菌在熱休克、氧化應(yīng)激、膜生物合成、染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和修飾以及真菌細(xì)胞壁代謝等嗜熱酶生產(chǎn)過(guò)程中存在差異，其主要原因尚不清楚。近年來(lái)，隨著生物能源市場(chǎng)需求的增加，對(duì)新型和改造后的工業(yè)酶以及高效酶的生產(chǎn)系統(tǒng)的探索逐漸深入。遺傳系統(tǒng)建立方面的研究成為目前研究的一個(gè)重要方向。許多細(xì)菌和真菌本身的產(chǎn)酶效果不理想，但是可以通過(guò)構(gòu)建遺傳系統(tǒng)平臺(tái)，作為活性酶的遺傳庫(kù)。腐生絲狀嗜熱真菌在作為遺傳宿主上具有應(yīng)用以及開(kāi)發(fā)潛力。開(kāi)發(fā)腐生絲狀嗜熱真菌遺傳操作系統(tǒng)將極大地提高嗜熱酶的產(chǎn)量以及嗜熱酶的利用效率。

5 結(jié)語(yǔ)

利用腐生絲狀嗜熱真菌開(kāi)發(fā)基因遺傳表達(dá)工具，使腐生絲狀嗜熱真菌在生理?xiàng)l件下直接組裝并產(chǎn)生耐熱大分子復(fù)合物成為可能。該方法具有從腐生絲狀嗜熱真菌中獲得復(fù)雜嗜熱酶的巨大潛力，包括天然蛋白和RNA修飾。此外，這些嗜熱酶復(fù)合物具有的熱穩(wěn)定性將有助于蛋白質(zhì)之間的相互作用。因此，該方法不僅可以為腐生絲狀嗜熱真菌進(jìn)一步發(fā)展成為生化模式生物提供基礎(chǔ)；并對(duì)復(fù)合嗜熱酶的結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析提供可能。在腐生絲狀嗜熱真菌中開(kāi)發(fā)基因遺傳表達(dá)工具將在生物技術(shù)方面成為一條嶄新的道路。