響應(yīng)面法優(yōu)化雞腿菇菌絲體多糖的提取工藝

閆舒雅，董岳峰，任翔萍,李 娜

(山西省醫(yī)藥與生命科學(xué)研究院，山西 太原 030006)

雞腿菇(Coprinuscomatus)又名刺蘑菇，因其形如雞腿而得名，屬于真菌門、擔(dān)子菌亞門、層菌綱、傘菌目、鬼傘科、鬼傘屬，是一種營(yíng)養(yǎng)豐富的食用菌[1-3]。藥理研究表明，雞腿菇多糖是其重要的生物活性成分，在小鼠體內(nèi)具有降低血糖值、提高機(jī)體免疫功能、抑制腫瘤生長(zhǎng)、改善血液循環(huán)、抗疲勞等功效[4-7]，在體外具有抗氧化活性[8-11]。食用菌多糖目前主要是從食用菌子實(shí)體、發(fā)酵菌絲體中分離提取而得[12]。研究發(fā)現(xiàn)，液體發(fā)酵可以避免固體培養(yǎng)周期長(zhǎng)、產(chǎn)量低、易污染等缺點(diǎn)[13-14]，通過(guò)液體發(fā)酵生產(chǎn)的雞腿菇菌絲體在蛋白質(zhì)、糖量、脂肪等營(yíng)養(yǎng)成分上優(yōu)于雞腿菇子實(shí)體。鑒于此，作者通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法對(duì)雞腿菇菌絲體多糖的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，為雞腿菇菌絲體多糖的工業(yè)化生產(chǎn)和開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

雞腿菇菌絲體，山西省康欣藥業(yè)有限公司。

無(wú)水乙醇、葡萄糖、苯酚，分析純，天津凱通化學(xué)試劑有限公司。

TU-1901型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器廠；HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇榮華儀器制造有限公司；GZX-9076MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；SHZ-DⅢ型循環(huán)水式真空泵，鞏義予華儀器有限責(zé)任公司。

1.2 雞腿菇菌絲體多糖含量及提取率的測(cè)定

采用苯酚硫酸法[15-16]測(cè)定雞腿菇菌絲體多糖含量，按下式計(jì)算雞腿菇菌絲體多糖提取率：

1.3 雞腿菇菌絲體多糖提取工藝優(yōu)化

1.3.1 單因素實(shí)驗(yàn)

分別考察浸提時(shí)間(0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h)、浸提溫度(50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃)、料液比(1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，g∶mL，下同)、浸提次數(shù)(1次、2次、3次、4次)對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響。

1.3.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)

在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以雞腿菇菌絲體多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，以浸提時(shí)間、浸提溫度、料液比為考察因素，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，優(yōu)化雞腿菇菌絲體多糖的提取工藝。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)的因素與水平

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1.1 浸提時(shí)間對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響

精確稱取10 g雞腿菇菌絲體，固定料液比為1∶20、浸提溫度為90 ℃、浸提次數(shù)為2次，分別浸提0.5 h、1 h、2 h、3 h、4 h，考察浸提時(shí)間對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖1。

從圖1可以看出，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)，雞腿菇菌絲體多糖提取率先升高后降低；當(dāng)浸提時(shí)間為2 h時(shí)，提取率達(dá)到最高(6.4432%)?？赡苁怯捎?，浸提時(shí)間延長(zhǎng)，提取的多糖中雜質(zhì)含量過(guò)多，導(dǎo)致提取率降低。因此，浸提時(shí)間以2 h較為適宜。

圖1 浸提時(shí)間對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響Fig.1 Effect of extraction time on extraction rate of polysaccharides from Coprinus comatus mycelium

2.1.2 浸提溫度對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響

精確稱取10 g雞腿菇菌絲體，固定料液比為1∶20、浸提時(shí)間為2 h、浸提次數(shù)為2次，浸提溫度分別為50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃，考察浸提溫度對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 浸提溫度對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響Fig.2 Effect of extraction temperature on extraction rate of polysaccharides from Coprinus comatus mycelium

從圖2可以看出，隨著浸提溫度的升高，雞腿菇菌絲體多糖提取率先升高后降低；當(dāng)浸提溫度為80 ℃時(shí)，提取率達(dá)到最高?？赡苁怯捎?，浸提溫度太高導(dǎo)致多糖結(jié)構(gòu)被破壞，從而影響了提取率。因此，浸提溫度以80 ℃較為適宜。

2.1.3 料液比對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響

精確稱取10 g雞腿菇菌絲體，固定浸提時(shí)間為2 h、浸提溫度為90 ℃、浸提次數(shù)為2次，料液比分別1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50，考察料液比對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。

從圖3可以看出，隨著料液比的減小，即提取溶劑用量的增加，雞腿菇菌絲體多糖提取率先升高后降低；當(dāng)料液比為1∶20時(shí)，提取率達(dá)到最高?？赡苁怯捎?，提取溶劑用量過(guò)多影響最后的醇沉效果，導(dǎo)致提取率降低。因此，料液比以1∶20較為適宜。

圖3 料液比對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響Fig.3 Effect of solid-liquid ratio on extraction rate of polysaccharides from Coprinus comatus mycelium

2.1.4 浸提次數(shù)對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響

精確稱取10 g雞腿菇菌絲體，固定料液比為1∶20、浸提時(shí)間為2 h、浸提溫度為90 ℃，分別提取1次、2次、3次、4次，考察浸提次數(shù)對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 浸提次數(shù)對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率的影響Fig.4 Effect of extraction times on extraction rate of polysaccharides from Coprinus comatus mycelium

從圖4可以看出，隨著浸提次數(shù)的增加，雞腿菇菌絲體多糖提取率先升高后降低；當(dāng)浸提次數(shù)為2次時(shí)，提取率達(dá)到最高，為4.2714%。因此，浸提次數(shù)以2次較為適宜。

2.2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

2.2.2 回歸模型方程與方差分析

根據(jù)響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)結(jié)果，對(duì)表2數(shù)據(jù)進(jìn)行二次回歸擬合分析，得到二次多項(xiàng)回歸模型方程：Y=7.93+0.23A-0.049B+0.15C+0.41AB-0.091AC-0.047BC-1.61A2-0.96B2-0.85C2。

回歸模型方差分析見(jiàn)表3。

表2 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 方差分析

2.2.3 響應(yīng)面交互作用分析

等高線的形狀反映兩因素交互作用的強(qiáng)弱，圓形代表不顯著，橢圓形代表顯著。浸提時(shí)間、浸提溫度及料液比兩兩交互作用對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖見(jiàn)圖5。

圖5 各因素交互作用對(duì)雞腿菇菌絲體多糖提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖Fig.5 Contour map and response surface map for effect of interaction between each factor on extraction rate of polysaccharides from Copriuus comatus mycelium

從圖5a可以看出，當(dāng)料液比不變時(shí)，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)和浸提溫度的升高，雞腿菇菌絲體多糖提取率逐漸升高而后趨于穩(wěn)定，浸提時(shí)間坡度增加的更加明顯一些，說(shuō)明浸提時(shí)間對(duì)提取率的影響更大，且等高線接近橢圓形，表明浸提時(shí)間和浸提溫度的交互作用顯著。從圖5 b可以看出，當(dāng)浸提溫度不變時(shí)，隨著浸提時(shí)間的延長(zhǎng)和料液比的減小，雞腿菇菌絲體多糖提取率先升高后降低，且等高線接近圓形，表明浸提時(shí)間和料液比的交互作用對(duì)提取率的影響不顯著。從圖5c可以看出，當(dāng)浸提時(shí)間一定時(shí)，隨著浸提溫度的升高和料液比的減小，雞腿菇菌絲體多糖提取率先升高后降低，且等高線呈橢圓形，表明浸提溫度和料液比的交互作用對(duì)提取率影響顯著。

2.2.4 最佳提取工藝的確定

由響應(yīng)面法優(yōu)化得到雞腿菇菌絲體多糖的最佳提取工藝為：浸提時(shí)間2.08 h、浸提溫度79.87 ℃、料液比1∶21?？紤]實(shí)際操作，將最佳提取工藝調(diào)整為：浸提時(shí)間2 h、浸提溫度80 ℃、料液比1∶20，在此條件下，雞腿菇菌絲體多糖提取率為7.7980%，與模擬預(yù)測(cè)值7.9630%接近。證明該模型合理，優(yōu)化的提取工藝切實(shí)可行，適用于雞腿菇菌絲體多糖的提取。

3 結(jié)論

以雞腿菇菌絲體多糖提取率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，采用單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化雞腿菇菌絲體多糖的提取工藝。確定最佳提取工藝為：浸提時(shí)間2 h、浸提溫度80 ℃、料液比1∶20(g∶mL)，在此條件下，雞腿菇菌絲體多糖提取率為7.7980%。