萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP多孔復(fù)合材料修復(fù)羊感染性骨缺損

許剛 何純青 張飛 克里木 尹東峰 吾木爾 劉劍 賈勇

新疆軍區(qū)總醫(yī)院1全軍骨科中心創(chuàng)傷骨科（關(guān)節(jié)組），2藥劑科（烏魯木齊830000）

近年來(lái)，隨著工業(yè)的發(fā)展，越來(lái)越多的工傷、車禍傷以及術(shù)后繼發(fā)感染導(dǎo)致的感染性骨缺損愈發(fā)常見(jiàn)，尤其以合并慢性骨髓炎的感染性骨缺損的治療一直是骨科領(lǐng)域中的一大難題［1］。針對(duì)慢性骨髓炎的治療，目前臨床上在一期清創(chuàng)后會(huì)植入混合抗生素的骨水泥（polymethyl methacrylate，PMMA）珠鏈作為間置器，其在填充死腔及骨缺損的同時(shí)可通過(guò)釋放抗生素來(lái)控制感染。但因其無(wú)法降解，2～3月后如感染得到完全控制，則需行二期手術(shù)取出骨水泥珠鏈，安裝外固定架進(jìn)行骨搬運(yùn)治療骨缺損［2］。但該方案將導(dǎo)致患者面臨治療周期長(zhǎng)、手術(shù)次數(shù)多、醫(yī)藥花費(fèi)高等情況，這將對(duì)患者造成沉重的負(fù)擔(dān)。因此，是否能研制出一種既具有抗感染效果，又具有良好生物降解性的骨移植材料，在有效控制感染的同時(shí)又可不斷降解，為同時(shí)進(jìn)行的骨修復(fù)提供充足的空間，這已成為當(dāng)前骨科領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)之一。研究表明，利用聚乳酸?羥基乙酸［poly（lactic?co?glycolic acid），PLGA］與磷酸三鈣（tricalcium phosphate，TCP）構(gòu)建的復(fù)合多孔支架材料具有良好的生物相容性和降解性，并且還具有一定的生物力學(xué)支撐性［3-4］。但因傳統(tǒng)的增材制造打印法工作溫度高，無(wú)法將抗生素添加進(jìn)材料中，導(dǎo)致該類材料不具有抗感染效果，無(wú)法應(yīng)用于感染性骨缺損的治療中［5］。

然而，低溫3D 打印技術(shù)的出現(xiàn)，使得抗生素在打印墨水中的添加成為了可能。3D 打印技術(shù)是利用計(jì)算機(jī)輔助設(shè)計(jì)（computer aided design，CAD）和計(jì)算機(jī)輔助制造（computer aided manufacturing，CAM）技術(shù)，在低溫（零下30 至40 攝氏度）條件下將復(fù)合高分子材料層層堆積得到的個(gè)性化三維實(shí)體。本次研究結(jié)合臨床實(shí)際，利用低溫3D 打印技術(shù)首次將廣泛用于治療甲氧西林耐藥金葡菌引起的慢性骨髓炎的萬(wàn)古霉素［6-7］復(fù)合進(jìn)PLGA 與TCP的支架材料中，成功打印出復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP 的多孔支架，并在前期已通過(guò)體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)其具有良好的生物相容性及萬(wàn)古霉素緩釋效應(yīng)。所以，本次研究采用山羊股骨感染性骨缺損為模型，進(jìn)一步通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP 的多孔支架的抗感染效果和生物降解效應(yīng)，為其后期的臨床運(yùn)用提供可靠的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 資料與方法

1.1 主要儀器設(shè)備和材料主要儀器設(shè)備：（1）低溫沉積生物3D 打印機(jī)（型號(hào)SUNP BP11 上普博源生物科技有限公司，北京）；（2）真空冷凍干燥機(jī)（型號(hào)LGJ?12 松源華興，北京）；（3）X 射線機(jī)（Faxitron X?ray 公司，美國(guó)）；（4）HP1100 高效液相色譜儀（惠普，美國(guó)）。主要試劑：（1）聚乳酸?羥基乙酸，PLGA75/25（山東省藥學(xué)科學(xué)院中試廠，特性粘度：1.0 ± 0.1 dL/g）；（2）β?磷酸三鈣TCP（Sigma公司，美國(guó)）；（3）1，4?二氧六環(huán)（Sigma 公司，美國(guó)）；（4）蘇木素伊紅（HE）染色試劑盒（碧云天，中國(guó)上海）。

1.2 新型復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP支架的制備低溫快速成型3D 打印PLGA/TCP 基本支架可參考既往文獻(xiàn)［9-11］。本次實(shí)驗(yàn)用支架打印具體步驟及參數(shù)如下：（l）用Mimics 軟件MEDCAD 模塊創(chuàng)建CAD 模型，支架規(guī)格：長(zhǎng)×寬×高為20 mm × 20 mm× 15 mm；（2）材料配制比例：15%PLGA+1.5%TCP+1.5% 萬(wàn)古霉素；有機(jī)溶劑（1，4?二氧六環(huán)）占比80%；（3）打印機(jī)參數(shù)：噴頭溫度35 ℃，口部直徑0.6 mm，打印速度9 mm/s，平臺(tái)溫度-25 ℃，填充圖案為鋸齒狀，走線距離1.8 mm，孔隙率設(shè)置為80%；（4）固化方式：將低溫3D 打印材料于-40 ℃靜置24 min，轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)，設(shè)置真空度10 Pa 冷凍干燥48 h，以1 ℃/h 速度升溫至20 ℃，此過(guò)程有機(jī)溶劑（1，4?二氧六環(huán)）可被完全移除。

1.3 萬(wàn)古霉素骨水泥珠鏈制備將聚甲基丙烯酸甲酯粉體與萬(wàn)古霉素粉（重量比10∶1）混合后，加入聚甲基丙烯酸甲酯單體，混合后注入模具，用手術(shù)縫線串起，制備成萬(wàn)古霉素骨水泥珠鏈，骨水泥珠直徑5 mm，備用。

1.4 山羊股骨感染性骨缺損建模新疆軍區(qū)總醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)了此項(xiàng)研究計(jì)劃。蘇博美利奴羊12只，不分雌雄，體質(zhì)量（51.2±3.5）kg，建立股骨感染性骨缺損模型。具體方法如下：采用氯胺酮（2 mg/kg 體質(zhì)量）和鹽酸賽拉嗪（50 mg/kg 體質(zhì)量）（體積比為1∶1）進(jìn)行全身麻醉，以維持動(dòng)物在整個(gè)手術(shù)過(guò)程中的麻醉狀態(tài)；剔除右側(cè)髖部及右下肢羊毛，肥皂水和清水依次沖洗后將羊固定在手術(shù)臺(tái)，常規(guī)聚維酮碘溶液消毒右下肢，鋪無(wú)菌單，貼隔離膜。大腿表面縱向切開(kāi)并剝離皮下軟組織，暴露股骨，使用擺鋸（Synthes 公司，瑞士）截除股骨中段皮質(zhì)骨，長(zhǎng)15 mm，用生理鹽水充分沖洗切口。在骨缺損位置滴入1 mL 金黃色葡萄球菌液（1.0 ～1.25）×109CFU/mL，繼續(xù)圈養(yǎng)4周，觀察到手術(shù)傷口有膿性分泌物，確立以骨髓組織的細(xì)菌培養(yǎng)陽(yáng)性及有死骨、或竇道形成的臨床表現(xiàn)為標(biāo)準(zhǔn)，則為建模成功，可進(jìn)行材料移植實(shí)驗(yàn)。

1.5 復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP 的多孔支架材料的植入手術(shù)麻醉及切開(kāi)同上一步驟。對(duì)感染股骨進(jìn)行截骨清創(chuàng)，擺鋸股骨截除殘端，去除炎性肉芽直至正常組織顯露，碘伏消毒創(chuàng)面后，用生理鹽水充分沖洗切口。選取合適長(zhǎng)度的支架，末端接觸殘留的骨斷端以壓配的方式放入缺損區(qū)，股骨骨缺損處植入修復(fù)材料，實(shí)驗(yàn)組1（3D 多孔支架組）植入復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP 的多孔支架材料，實(shí)驗(yàn)組2（骨水泥珠鏈組）植入萬(wàn)古霉素骨水泥珠鏈，空白對(duì)照組不植入任何材料，每組設(shè)立4 只實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，術(shù)后放置引流管，逐層縫合傷口。

1.6 術(shù)區(qū)萬(wàn)古霉素濃度測(cè)定及殺菌活性分析術(shù)后1、4、6 周在利多卡因局部麻醉下，采用骨活檢針鉆取植入?yún)^(qū)組織或組織液，組織粉碎后采用生理鹽水500 μL 洗提，采用高效液相色譜儀測(cè)量洗提液中萬(wàn)古霉素含量。將8 μL 組織洗提液滴加至直徑7 mm 的圓紙片上，風(fēng)干后在長(zhǎng)滿金黃色葡萄球菌標(biāo)準(zhǔn)株（ATCC25923）的血瓊脂平板上進(jìn)行抑菌環(huán)實(shí)驗(yàn)，35 ℃后培養(yǎng)18 h 后測(cè)量殺菌圈直徑。

1.7 不同時(shí)間點(diǎn)的血液分析術(shù)后1、4、8、12 周分別抽取血液行血常規(guī)、血沉、C?反應(yīng)蛋白的檢測(cè)。

1.8 術(shù)區(qū)X?Ray 及組織學(xué)檢測(cè)術(shù)后12 周行X?Ray 檢測(cè)，觀察骨缺損愈合及支架吸收情況。同時(shí)術(shù)后12 周過(guò)量麻醉處死實(shí)驗(yàn)動(dòng)物術(shù)區(qū)行手術(shù)取材，移植區(qū)樣品在4%多聚甲醛（pH 7.2）固定24 h，取出并用磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗后，在37 ℃恒溫?fù)u床里放入脫鈣液乙二胺四乙酸（EDTA）2月，大約每7 d 更換脫鈣液，脫鈣完全后，沿股骨冠狀平面方向切開(kāi)缺損部位，觀察面朝向底面放入一次性包埋盒，進(jìn)入制作組織切片程序。自動(dòng)組織脫水機(jī)（Leica?ASP200S，德國(guó)）按骨組織標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行脫水，然后將脫水處理后的組織用石蠟包埋機(jī)（BMJ?1，天津天力航空機(jī)電，中國(guó)）進(jìn)行包埋。下一步，用切片機(jī)（Leitz?1516，德國(guó)），制備了5 mm厚的組織切片，HE 染色。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析以及制圖運(yùn)用GraphPad Prism version 5（GraphPad software，San Diego，CA）軟件，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，不同組間比較采用方差分析（ANOVA），P< 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 總體情況所有實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均存活。對(duì)照組2只動(dòng)物跛行，創(chuàng)面破潰，表面肉芽組織形成。3D 多孔支架組和骨水泥珠鏈組傷口愈合良好，無(wú)跛行。

2.2 不同時(shí)間點(diǎn)各組血液中白細(xì)胞、血沉、C?反應(yīng)蛋白的變化術(shù)后1、4、8、12 周各組血液檢測(cè)結(jié)果提示空白對(duì)照組各時(shí)間段的白細(xì)胞、血沉及C?反應(yīng)蛋白均維持在較高水平，而3D 多孔支架組和骨水泥珠鏈組在第一周時(shí)三種指標(biāo)均顯著低于對(duì)照組，第4、8、12 周時(shí)數(shù)值均逐漸下降，相比空白對(duì)照組具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05，表1 ～3）。該結(jié)果證實(shí)骨水泥珠鏈組和3D 多孔支架組均有著良好的抗感染效果。

2.3 不同時(shí)間點(diǎn)術(shù)區(qū)萬(wàn)古霉素濃度測(cè)定術(shù)后第1 周骨水泥珠鏈組和3D 多孔支架組感染性骨缺損區(qū)的組織液中均能檢測(cè)到萬(wàn)古霉素，其濃度都在20 mg/L 之上，但骨水泥珠鏈組顯著高于3D 多孔支架組（P<0.05），而術(shù)后4、6 周時(shí)3D 多孔支架組的萬(wàn)古霉素濃度顯著高于骨水泥珠鏈組（P< 0.05），證明骨水泥珠鏈組和3D 多孔支架組均能有效釋放萬(wàn)古霉素，3D 多孔支架組的長(zhǎng)期釋放效果更好（圖1）。

表1 各組實(shí)驗(yàn)羊血液中白細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化Tab.1 The dynamic changes of white blood cells counts in the three groups ±s，×109/L

表1 各組實(shí)驗(yàn)羊血液中白細(xì)胞的動(dòng)態(tài)變化Tab.1 The dynamic changes of white blood cells counts in the three groups ±s，×109/L

注：3D 多孔支架組與對(duì)照組相比，*P<0.05

指標(biāo)對(duì)照組骨水泥珠鏈組3D 多孔支架組1 周24.04±3.6 14.45±2.3*13.58±3.1*4 周20.24±1.6 9.04±2.8*8.71±3.2*8 周16.34±1.7 8.04±2.3*8.53±1.3*12 周15.32±4.7 7.64±1.3*7.13±1.1*

表2 各組實(shí)驗(yàn)羊血液中CRP 的動(dòng)態(tài)變化Tab.2 The dynamic changes of C?reactive protein in the three groups ±s，mg/L

表2 各組實(shí)驗(yàn)羊血液中CRP 的動(dòng)態(tài)變化Tab.2 The dynamic changes of C?reactive protein in the three groups ±s，mg/L

注：3D 多孔支架組與對(duì)照組相比，*P<0.05

指標(biāo)對(duì)照組骨水泥珠鏈組3D多孔支架組1周286.40±23.1 167.50±25.3*147.580±21.1*4周207.40±17.6 46.40±12.8*43.10±14.2*8周180.30±16.7 18.40±3.3*15.53±3.9*12周150.30±14.7 8.64±3.3*7.13±2.1*

表3 各組實(shí)驗(yàn)羊血液中血沉的動(dòng)態(tài)變化Tab.3 The dynamic changes of erythrocyte sedimentation rate in the three groups ±s，mm/h

表3 各組實(shí)驗(yàn)羊血液中血沉的動(dòng)態(tài)變化Tab.3 The dynamic changes of erythrocyte sedimentation rate in the three groups ±s，mm/h

注：3D 多孔支架組與對(duì)照組相比，*P<0.05

指標(biāo)對(duì)照組骨水泥珠鏈組3D 多孔支架組1 周68±7 54±6*56±4*4 周57±6 33±5*36±7*8 周47±6 18±4*16±7*12 周38±5 10±2*9±3*

圖1 不同時(shí)間段萬(wàn)古霉素濃度測(cè)定Fig.1 The concentration of Vancomycin in different time periods

2.4 不同時(shí)間點(diǎn)術(shù)區(qū)萬(wàn)古霉素活性測(cè)定術(shù)后第1 周骨水泥珠鏈組和3D 多孔支架組感染性骨缺損區(qū)的組織液均有抗菌活性，兩者抗菌效果相當(dāng)，但術(shù)后4、6 周時(shí)3D 多孔支架組的抗菌效果顯著優(yōu)于骨水泥珠鏈組（P< 0.05），證明3D 多孔支架組的長(zhǎng)期抗菌效果更優(yōu)（圖2）。

圖2 不同時(shí)間段萬(wàn)古霉素活性測(cè)定Fig.2 The determination of Vancomycin activity in different time periods

2.5 術(shù)后12 周時(shí)X?Ray 評(píng)估對(duì)照組無(wú)支架植入的缺損區(qū)，新生骨組織結(jié)構(gòu)分散，大約在4 周截骨末端逐漸閉合。3D 多孔支架組植入缺損部位之后，觀察到新生骨沿股骨長(zhǎng)軸生長(zhǎng)，并在缺損區(qū)內(nèi)向中間部分延伸，最后與缺損遠(yuǎn)端骨組織橋接（圖2 ～5）。術(shù)后12 周時(shí)3D 多孔支架組X?Ray 影像顯示骨缺損處支架信號(hào)模糊，可見(jiàn)明顯吸收跡象。骨水泥珠鏈組也可以見(jiàn)到不同程度的骨生長(zhǎng)，受珠鏈占位影響，其新生骨的面積顯著低于3D 多孔支架組和對(duì)照組。缺損區(qū)骨量分析結(jié)果顯示，3D 多孔支架組的缺損區(qū)骨量明顯高于骨水泥珠鏈組和對(duì)照組，新生骨占缺損區(qū)面積的93%、42%和64%（P<0.05）。

2.6 組織學(xué)結(jié)果分析HE 染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)：沒(méi)有植入支架的空白組的缺損區(qū)見(jiàn)大量結(jié)締組織填充，骨缺損近端和遠(yuǎn)端可見(jiàn)新生骨質(zhì)向缺損中心延伸，但沒(méi)有形成骨橋連接。3D 多孔支架組可見(jiàn)板層骨位于兩端，中間是骨髓組織，斷端與正常板層骨連接在一起。3D 打印支架表面可見(jiàn)新生骨組織直接沉積在支架小梁表面。成骨細(xì)胞樣細(xì)胞排列在新形成的骨組織表面，在支架小梁表面類骨質(zhì)覆蓋，可見(jiàn)新生骨橋連接骨缺損的兩個(gè)斷端。骨水泥珠鏈組亦可見(jiàn)到新生骨組織，但受到骨水泥珠影響，缺損區(qū)新生骨面積小于3D 多孔組和空白對(duì)照組。

圖3 術(shù)后12 周3D 多孔支架組X?Ray 及術(shù)后4、8、12 周HE 染色評(píng)估支架降解情況Fig.3 The X?Ray and HE stain of 3D scaffold group at the different time points after the operation

圖4 術(shù)后4、8、12 周3D 多孔支架降解情況Fig.4 The degradation of 3D scaffold at the different time points after the operation

3 討論

慢性骨髓炎伴骨缺損的治療一直是骨科臨床工作中面臨的一大難題，其具有骨質(zhì)破壞、死骨形成、竇道反復(fù)流膿的病理特點(diǎn)，而一期病灶清除配合骨水泥珠鏈植入控制感染，二期外固定支架行骨搬運(yùn)術(shù)已成為治療該類疾病的常規(guī)手段［8-9］。對(duì)于治療慢性骨髓炎而言，徹底的清創(chuàng)和抗生素的有效運(yùn)用是治愈的關(guān)鍵［10-11］。作為局部抗生素代入的介質(zhì)，骨水泥珠鏈的使用已有30年歷史，其治療效果在臨床中也已得到驗(yàn)證［12］?；旌峡股氐墓撬嘀殒湶粌H可以填補(bǔ)局部死腔和骨缺損，提供一定的力學(xué)支撐，還可以在局部逐漸釋放高濃度抗生素，避免全身用藥時(shí)血液中的抗生素濃度過(guò)高而產(chǎn)生毒副作用［13-15］。

但是，骨水泥珠鏈的缺點(diǎn)是不能進(jìn)行有效的生物降解，植入后存在占位效應(yīng)，無(wú)法在初期為骨缺損的愈合提供有效的空間，這勢(shì)必將使患者面臨多次手術(shù)帶來(lái)的創(chuàng)傷及經(jīng)濟(jì)壓力，而同時(shí)具備抗感染效果和生物降解性的骨移植材料的成功研發(fā)將有可能解決這一難題。如何在抗感染治療的同時(shí)，實(shí)現(xiàn)骨的長(zhǎng)入成為骨科醫(yī)生的夢(mèng)想。所以，要想制備的植入物具備多種特性，靠單一的材料構(gòu)成無(wú)法滿足，而復(fù)合材料的出現(xiàn)和進(jìn)一步應(yīng)用為上述研究目標(biāo)的達(dá)成提供了一條捷徑［16］。

因此，本次研究利用3D 低溫打印技術(shù)，創(chuàng)新性的將PLGA、TCP 及萬(wàn)古霉素融合在一起，打印出復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP 的多孔支架材料，具備多種優(yōu)點(diǎn)。首先，3D 打印技術(shù)具有優(yōu)異的個(gè)體化制定特點(diǎn)，可以利用CT/MRI 等影像學(xué)數(shù)據(jù)，根據(jù)患者自身特征性的骨缺損來(lái)打印與之匹配的植入材料，保證了尺寸及空間的完美匹配，為支架提供更好的力學(xué)支撐提供了保障［17-18］。其次，3D 打印技術(shù)可以參考前期的體外實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)，個(gè)性化的定制材料的孔隙率和結(jié)構(gòu)，使材料的生物力學(xué)及緩釋效應(yīng)達(dá)到最優(yōu)化［19-20］。

筆者前期的實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)3D 打印的復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP 的多孔支架在孔隙率為80%時(shí)，其具有最優(yōu)的抗生素緩釋效應(yīng)。不僅如此，在本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，3D 多孔支架組的抗感染效果與骨水泥珠鏈組相當(dāng)，充分證實(shí)了該種材料的抗感染效果已達(dá)到臨床應(yīng)用標(biāo)準(zhǔn)，能夠有效控制慢性骨髓炎的局部感染病灶。最后，該材料的生物降解效應(yīng)是本研究關(guān)注的重點(diǎn)。在山羊股骨感染性骨缺損模型中，通過(guò)植入3D 多孔支架材料，在術(shù)后12 周時(shí)發(fā)現(xiàn)其本身相對(duì)于4 周時(shí)發(fā)生了顯著的降解，這證明復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP 的多孔支架在具備抗感染效應(yīng)的同時(shí)，還具有良好的生物降解性。

由此可見(jiàn)，將復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP 的多孔支架運(yùn)用于臨床治療慢性骨髓炎伴骨缺損患者時(shí)，可在一期清創(chuàng)植入該種材料后即刻安裝骨搬運(yùn)支架，隨著感染的完全控制和材料的逐漸吸收，骨搬運(yùn)的治療可以同步進(jìn)行，免除了二次手術(shù)取出植入物才可進(jìn)行骨搬運(yùn)這一步驟，避免多次手術(shù)所造成的創(chuàng)傷，同時(shí)將顯著縮短患者的治療周期和費(fèi)用，這無(wú)疑將產(chǎn)生良好的社會(huì)效應(yīng)。

應(yīng)用低溫3D 打印技術(shù)設(shè)計(jì)研發(fā)的新型復(fù)合萬(wàn)古霉素/PLGA/TCP 多孔支架材料不僅具有良好的抗感染效應(yīng)，而且還具有穩(wěn)定的生物降解性，其應(yīng)用于臨床后將極大的縮短慢性骨髓炎伴骨缺損患者的治療周期及費(fèi)用。同時(shí)該材料構(gòu)成合理、價(jià)格低廉、較易獲得，具有極大的臨床應(yīng)用潛力，將有望成為一種治療慢性骨髓炎伴骨缺損的理想骨移植材料。