子午流注穴位電刺激對卵巢低反應患者輔助生殖結局的影響

劉娟 陸杉 王小云

廣州中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院1生殖醫(yī)學科，2婦科（廣州510006）

隨著女性生育年齡的推后，加上環(huán)境與疾病的各種影響，卵巢低反應（poor ovarian response，POR）的發(fā)病率逐年升高［1］。POR 對女性最嚴重的危害即為生育力下降或喪失。因此POR 患者如何在有限的卵巢功能基礎上盡快妊娠已成為目前大多數(shù)生殖中心面臨的一個難題。卵巢功能的下降幾乎是不可逆的，目前尚無確切有效的方法恢復卵巢功能，只能延緩卵巢衰老的時間，或恢復殘存卵泡的功能，爭取機會懷孕［2］。中醫(yī)針灸治療不孕癥歷史悠久，通過針刺具有“補腎健脾、疏肝理氣、活血化瘀”等穴位，起到助孕的作用。子午流注穴位電刺激儀是在傳統(tǒng)穴位電刺激儀的基礎上結合子午流注的理論，利用微電腦單片機技術，實現(xiàn)了子午流注與靈龜八法的精確時間計算。此方法具有安全、無創(chuàng)、患者依從性好、經(jīng)濟及時間穴刺激等優(yōu)點，目前主要應用于腦病科及患者術后恢復治療中，生殖領域尤其是卵巢低反應患者中使用未見報道。因此本研究從臨床中常見且較為棘手的問題著手，探索中醫(yī)穴位刺激的干預措施是否能有效提高POR 患者的卵巢功能，并分析此干預措施是否對后續(xù)的IVF 助孕治療結局產(chǎn)生差異性影響，以評估POR 不孕癥患者在IVF 助孕前行子午流注穴位電刺激預處理的安全性及有效性，現(xiàn)將研究結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 病例選擇選取2018年12月至2019年12月在我科行IVF 助孕治療的不孕癥患者，納入診斷為POR 的患者共70 例，采用隨機數(shù)字表法隨機分為子午流注穴位電刺激治療組（A 組）和空白對照組（B 組），每組納入患者35 例，納入前均向患者告知干預措施隨機分組方式，詳細介紹干預措施已知的研究報道，告知研究過程及干預可能的獲益等，本研究已獲患者及家屬知情同意，并獲廣東省中醫(yī)院倫理委員會批準，批號：ZF2018?212?01。

1.2 病例篩選標準納入標準：（1）年齡35～43 歲女性；（2）同時符合不孕癥（診斷標準參考《婦產(chǎn)科學》［3］）及POR 西醫(yī)診斷標準者（參考博洛尼亞共識（Bologna criteria，2011年）診斷標準。至少滿足以下3 條中的2 條：①年齡≥40 歲，或具備POR 的任何危險因素；②曾有卵巢刺激反應不良病史，采用常規(guī)刺激方案，獲卵數(shù)≤3 個；③一個異常卵巢儲備試驗結果，竇卵泡數(shù)（antral follicle count，AFC）計數(shù)<5 ～7 個，或抗苗勒管激素（anti?mulleri?an hormone，AMH）< 0.5～1.1 ng/mL 或2 次 基 礎FSH 水平≥12 IU/L 者。即便患者不是高齡或者卵巢儲備試驗異常，在最大刺激下兩次偶發(fā)的POR，也足夠診斷患者屬于卵巢低反應。常見人群為：a.高齡；b.前次超促排卵周期POR 者；c.具有影響卵巢儲備和卵巢刺激反應性的獲得性或遺傳性疾病者，如卵巢手術、盆腔感染、化療及盆腔放療、遺傳免疫性疾病和環(huán)境因素等；d. 高BMI 者［4］）；（3）符合中醫(yī)證候辨證標準者（由兩位副高級職稱以上的醫(yī)師共同認可：參考《中華中醫(yī)藥學會（ZYYXH/T203?246?2012）：中醫(yī)婦科常見病診療指南，2012年》中“不孕癥”證候標準。根據(jù)臨床中患者的常見辯證種類，共選取四種癥型：①腎陰虛；②腎虛肝郁；③腎虛血瘀；④脾腎兩虛）。排除標準：（1）女性基礎FSH 水平≥40 IU/L；（2）子宮內(nèi)膜異位癥Ⅲ?Ⅳ期；（3）染色體異常者；（4）男女任何一方患有嚴重的精神疾患、泌尿生殖系統(tǒng)急性感染、性傳播疾病；（5）女性子宮不具備妊娠功能或嚴重軀體疾病不能承受妊娠。

1.3 治療藥物及儀器（1）本研究中使用的相關藥物如下：①克羅米芬（Clomiphene，CC），塞浦路斯高特制藥有限公司，50 mg/片；②尿促性素（hu?man menopausal gonadotrophin，hMG），珠海麗珠制藥，75 IU/支；③絨促性素（human chorionic gonado?tropin，hCG），珠海麗珠制藥，2 000 IU/支；④重組人絨促性素（艾澤），德國默克雪蘭諾，250 μg/支。（2）本研究中使用的儀器：ZWLZ?V 子午流注低頻治療儀，京佳時正通科技有限責任公司。

1.4 治療方法

1.4.1 子午流注穴位電刺激治療組

1.4.1.1 子午流注穴位電刺激穴位處方及取穴依據(jù)（1）開穴：根據(jù)患者就診時間（年月日時）選取相應的2 個開穴（由子午流注低頻治療儀自動計算出靈龜八法穴位）。靈龜八法計算法：將日、時的干支數(shù)字，共同相加，得出四個數(shù)字的和數(shù)，按照陽日用九除，陰日用六除的公式，去除干支的和數(shù)，再將它的余數(shù)，求得八卦所分配的某穴的數(shù)字，為當時應開的腧穴，再根據(jù)此腧穴配對其對應的八脈交會穴，如：公孫配內(nèi)關，臨泣配外關，后溪配申脈，列缺配照海。（2）主穴：取中脘、氣海、中極、商曲（左側）、下風濕點（雙側）、子宮。中脘為胃募穴，有和胃健脾、通降腑氣之功；氣海屬任脈，主治臟氣虛憊，真氣不足，存調(diào)補下焦、補腎益氣、振陽固精之功；中極系膀胱之募穴，有補腎培元、清熱利濕之功；商曲系腎經(jīng)與沖脈之會穴，有調(diào)理腸胃之功；下風濕點與經(jīng)外奇穴護宮重合，與關元合用時統(tǒng)稱梅花三針，主治不孕癥、附件炎、卵巢囊腫及其他婦科?。蛔訉m：系經(jīng)外奇穴，有調(diào)經(jīng)理血，升提下陷之功。（3）配穴：根據(jù)不同證型選取相應的配穴：①腎陰虛——三陰交（雙側），系足太陰脾經(jīng)、足少陰腎經(jīng)、足厥陰肝經(jīng)交會穴，有健脾益氣、調(diào)補肝腎之功；②腎虛肝郁——太沖（雙側），足厥陰肝經(jīng)輸穴，原穴，為肝經(jīng)的通道所在，原氣所居之處，有疏肝理氣、通絡和血之功；③腎虛血瘀——大橫，系足太陰脾經(jīng)、陰維脈交會穴，能治腸腹氣之?。虎芷⒛I兩虛——足三里（雙側），足陽明胃合穴，胃下合穴，主治五癆、羸瘦、亡陽、虛乏、胸瘀血、乳癰等癥。所選擇的穴位均參照中華人民共和國國家標準《經(jīng)穴部位》的定位方法進行定位。

1.4.1.2 子午流注穴位電刺激治療流程囑患者排空膀胱，取平臥位，將ZWLZ?V 子午流注穴位電刺激儀（京佳時正通科技有限責任公司）的電極貼片按開穴—主穴—配穴的順序分別貼于上述穴位上。開機，選擇頻率為2 Hz，強度為20～25 mA，以患者感覺舒適為度。每次20 min，非經(jīng)期隔日1 次，一周3 次，1 個月經(jīng)周期為1 個療程，共治療2 個療程后結合IVF/ICSI 治療。

1.4.1.3 IVF/ICSI促排卵治療方法采用溫和刺激方案：于月經(jīng)期第2～3 天開始使用CC 50 mg 口服，每日一次；同時給予hMG 150 IU 直至扳機日，監(jiān)測卵泡發(fā)育當1個主導卵泡徑線≥18 mm 或2個主導卵泡徑線≥17 mm 或3 個主導卵泡徑線≥16 mm時，注射hCG 10 000 IU 或艾澤250 μg 扳機。扳機后34～36 h 經(jīng)陰道B 超引導下穿刺取卵。取卵后由胚胎實驗室人員完成撿卵、授精、胚胎培養(yǎng)工作。溫和刺激方案由于使用了藥物CC，影響子宮內(nèi)膜容受性，需取消新鮮胚胎移植。形成的可利用胚胎則全部進行冷凍保存。凍融胚胎移植：根據(jù)患者的月經(jīng)是否規(guī)則使用自然周期或人工周期準備內(nèi)膜，在內(nèi)膜轉化3 d 后行凍融胚胎移植手術。常規(guī)復蘇后培養(yǎng)2 h 再次對胚胎評級。根據(jù)衛(wèi)生部要求，35 歲以下第1 次助孕周期移植胚胎數(shù)不得超過2 枚，每周期移植胚胎總數(shù)不得超過3 枚。

1.4.2 對照組只進行基礎治療，即促排卵與IVF/ICSI 助孕治療，促排卵治療方案及凍融胚胎移植策略同治療組。

1.5 觀察指標安全性指標：血常規(guī)、肝腎功能、心電圖以及觀察組患者不良反應發(fā)生的情況。效應性指標：（1）觀察組干預措施前后卵巢功能比較（觀察周期為子午流注穴位電刺激預處理后1 個月）：比較治療組干預措施前后卵巢功能各項指標包括血清基礎卵泡刺激素（follicle stimulating hormone，F(xiàn)SH）、基礎黃體生成素（luteinizing hor?mone，LH）、基礎雌二醇（estradiol，E2）、AMH 及AFC，以評估干預措施對POR 患者卵巢功能的影響。（2）IVF 助孕治療后2 組患者的臨床基本資料及卵子、胚胎質量情況比較（觀察周期為子午流注穴位電刺激預處理后1 個月）。比較兩組患者臨床基本資料、促排卵用藥情況、獲卵數(shù)、成熟卵子率（metaphaseII，MII 卵率）、受精率、卵裂胚胎數(shù)、可利用胚胎數(shù)、優(yōu)質胚胎數(shù)，以評估干預措施是否對IVF 助孕治療結局產(chǎn)生差異性影響。（3）IVF 助孕治療后2 組患者妊娠結局比較（觀察組的觀察周期為子午流注穴位電刺激預處理后3 個月）。比較兩組患者IVF 治療后的種植率（種植胚胎數(shù)/移植胚胎數(shù)）、解凍移植周期臨床妊娠率（臨床妊娠數(shù)/解凍移植周期數(shù)）及流產(chǎn)率（流產(chǎn)數(shù)/臨床妊娠數(shù)），異位妊娠率（異位妊娠數(shù)/臨床妊娠數(shù)），多胎率（多胎妊娠數(shù)/臨床妊娠數(shù)），活產(chǎn)率（抱嬰率）：有活產(chǎn)嬰兒出生的分娩次數(shù)/移植周期數(shù)，以評估干預措施是否能改善POR 不孕癥患者的妊娠結局。

1.6 統(tǒng)計學方法采用SPSS 22.0 軟件對相關數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析。計量資料符合正態(tài)分布者采用t檢驗，以均數(shù)±標準差表示；計數(shù)資料采用χ2檢驗，以頻數(shù)（百分數(shù)）［例（%）］表示。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 安全性評價在治療過程中觀察組患者未發(fā)生不良反應。

2.2 觀察組干預措施前后卵巢功能比較觀察組治療前后卵巢功能比較結果見表1。結果顯示，治療后基礎AFC 顯著高于治療前（P= 0.002），基礎FSH 顯著低于治療前（P= 0.011），AMH、基礎LH及基礎E2水平比較在治療前后差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

2.3 觀察組與對照組患者的臨床基本資料、促排卵用藥及胚胎情況比較兩組患者的臨床基本資料、促排卵用藥及胚胎情況比較結果見表2。結果顯示，女方年齡、體質量指數(shù)、AMH、AFC、基礎FSH、基礎LH 水平、促排卵天數(shù)及扳機日E2水平在兩組中差異無統(tǒng)計學意義（P> 0.05），觀察組患者基礎E2水平顯著低于B 組（P= 0.003），促性腺激素（gonadotropins，Gn）總量顯著高于對照組（P=0.014）；A組患者的獲卵數(shù)及可利用胚胎數(shù)均顯著高于B組（P= 0.021、0.042）；兩組患者的MII 卵數(shù)、受精率、卵裂胚胎數(shù)及優(yōu)質胚胎數(shù)比較差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。

表1 觀察組患者治療前后卵巢功能比較Tab.1 The changes of ovarian function in observation group ±s

表1 觀察組患者治療前后卵巢功能比較Tab.1 The changes of ovarian function in observation group ±s

注：與治療前相比較，aP<0.05

組別治療前治療后t 值P 值例數(shù)35 35 AMH（ng/mL）0.52±0.30 0.41±0.36 1.961 0.061基礎AFC（個）2.82±1.98a 4.06±3.16-3.268 0.002基礎FSH（IU/L）12.90±6.23a 10.19±4.10 2.676 0.011基礎LH（IU/L）5.12±2.21 4.80±2.70 0.638 0.528基礎E2（pmol/L）161.10±87.25 126.41±94.25 1.664 0.106

表2 觀察組與對照組患者的臨床基本資料、促排卵用藥及胚胎情況比較Tab.2 Clinical features of patients,exogenous administration and embryo information of patientsin two groups±s

表2 觀察組與對照組患者的臨床基本資料、促排卵用藥及胚胎情況比較Tab.2 Clinical features of patients,exogenous administration and embryo information of patientsin two groups±s

注：與B 組相比較，aP<0.05

指標女方年齡（歲）體質指數(shù)（kg/m2）AMH（ng/mL）基礎AFC（個）基礎FSH（IU/L）基礎LH（IU/L）基礎E2（pmol/L）t 促排（d）Gn 總量（IU）扳機日E2（pmol/L）獲卵數(shù)（個）MII 卵數(shù)（個）受精率（%）卵裂胚胎數(shù)（個）可利用胚胎數(shù)（個）優(yōu)質胚胎數(shù)（個）觀察組（35 例）37.06±5.01 21.96±3.26 0.57±0.91 4.06±3.16 10.19±4.09 4.80±2.70 126.41±94.25a 9.77±3.25 1 628.5±617.76a 3 351.2±3 101.03 2.37±2.07a 1.97±1.44 87.0（60/69）1.51±1.31 1.43±1.271）0.68±1.02對照組（35 例）36.43±5.05 23.05±3.67 0.50±0.45 3.11±1.41 10.34±8.04 5.07±3.14 251.63±211.70 8.54±2.78 1 285.7±515.43 3 213.4±1 764.04 1.46±0.98 1.43±0.95 92.2（47/51）1.34±0.97 0.91±0.74 0.49±0.61 t 值0.523-1.314 0.399 1.611-0.098-0.370-3.118 1.698 2.520 0.226 2.358 1.858 0.821 0.621 2.072 0.993 P 值0.603 0.193 0.691 0.112 0.922 0.713 0.003 0.094 0.014 0.822 0.021 0.067 0.365 0.537 0.042 0.324

2.4 妊娠結局情況分析兩組患者妊娠結局情況比較見表3。觀察組35 例患者中6 例患者未獲得可利用胚胎，5 例患者胚胎仍未解凍移植，24 例患者共進行了27 個解凍移植周期，臨床妊娠12 例共12 個周期，其胚胎種植率為32.56%（14/43），解凍移植周期臨床妊娠率為44.4%（12/27），流產(chǎn)率為16.7%（2/12），異位妊娠率為8.3%（1/12），多胎率為25%（3/12），活產(chǎn)率（抱嬰率）為29.6%（8/27），仍有1 例現(xiàn)孕20+周，無異常。對照組35 例患者中7 例患者卵子未受精；3 例卵裂后胚胎質量差，無可利用胚胎；1 例患者胚胎未解凍移植；24 例患者共進行了24 個解凍移植周期，其中7 例患者獲得臨床妊娠，其胚胎種植率為27.3%（9/33），解凍移植周期臨床妊娠率為29.2%（7/24），流產(chǎn)率為57.1%（4/7）（其中3 例孕早期胚胎停育行清宮術，1 例孕中期發(fā)現(xiàn)胎兒染色體異常行引產(chǎn)術），異位妊娠率為0（0/7），多胎率為42.8%（3/7），活產(chǎn)率（抱嬰率）為12.5%（3/24）。

3 討論

POR 是卵巢對Gn 刺激反應不良的病理狀態(tài)，主要表現(xiàn)為卵巢刺激周期發(fā)育的卵泡少、血雌激素峰值低、Gn 用量多、周期取消率高、獲卵數(shù)少和臨床妊娠率低［5］。在輔助生殖促排卵過程中，POR發(fā)生率為9%～24%，臨床妊娠率為10%～20%［6］，POR 已成為輔助生殖技術中的一個難點熱點問題，目前尚無明確的干預措施可改善POR 患者的妊娠結局［7］。現(xiàn)代醫(yī)學為了改善IVF 治療效果，主要是通過加大Gn 用量，調(diào)整IVF 促排卵方案，促排卵前使用藥物進行預處理如生長激素類藥物［8］，脫氫表雄酮等，但尚無顯著臨床療效［9-10］，由于POR 患者對Gn 的反應性差，獲得優(yōu)質卵子及胚胎的數(shù)量少從而導致較差的治療結局，亦是目前輔助生育助孕中面臨的棘手問題［11］。

表3 兩組患者妊娠結局比較Tab.3 Pregnant outcome of patients in two groups %（例）

有研究顯示中醫(yī)治療對于改善POR 患者效果顯著［12］。尤昭玲等［13］針對卵巢低反應獨創(chuàng)“冰山理論”提出了“望眼視巢”診治法，針對使用拮抗劑方案的POR 患者給予分階段二期三法治療，有一定臨床療效?，F(xiàn)代醫(yī)學研究認為針刺信號可以通過穴位經(jīng)外周神經(jīng)傳入中樞，調(diào)整下丘腦?垂體?卵巢軸，促進卵泡發(fā)育成熟、提高卵母細胞質量、從而改善卵巢功能［14］。LEE 等［15］通過對POR 患者進行的Ⅳ期針灸臨床試驗發(fā)現(xiàn)，促排卵前進行兩個月經(jīng)周期共16 次針灸治療能顯著改善POR 不孕患者的生活質量，并提高獲卵數(shù)，認為此方案可能具有重要的臨床價值。最近的一項多中心隨機對照試驗亦顯示在促排卵前行針灸治療三個周期可望成為POR不孕患者一種新的診治方案［16］。XU等［17］通過對90 例POR 患者的隨機對照研究發(fā)現(xiàn)，進行3 個月的經(jīng)皮穴位電刺激組的基礎內(nèi)分泌、AMH水平、AFC、腎虛癥狀等方面得到明顯改善，但對于其生育需求等方面未見報道。

雖然臨床中已有將中藥與傳統(tǒng)針灸療法應用于POR 患者，但結果仍有待進一步證實［18］。子午流注，是由中醫(yī)針灸以“人與天地相應”的觀點而來。子午流注穴位電刺激儀是在傳統(tǒng)穴位電刺激儀的基礎上結合子午流注的理論，將中醫(yī)時間醫(yī)學和現(xiàn)代物理治療學有機結合開發(fā)而成的儀器，利用微電腦單片機技術，實現(xiàn)了子午流注與靈龜八法的精確時間計算，治療時以電極片為介導作用于穴位，采用模擬針刺手法，具備多種刺激波形，可控制脈沖輸出的強度和頻率［19］。與傳統(tǒng)針刺相比，子午流注穴位電刺激除了具有安全、無創(chuàng)、患者依從性好、經(jīng)濟有效等優(yōu)點，還實現(xiàn)了子午流注與靈龜八法的精確時間計算，根據(jù)《黃帝內(nèi)經(jīng)》中人體穴位開合規(guī)律而定，利用穴位電極貼片代替毫針，利用電脈沖刺激代替?zhèn)鹘y(tǒng)針刺，調(diào)理人體內(nèi)環(huán)境，平衡陰陽，打通經(jīng)絡治病。由于其采用擇時選穴，定時取穴，同時可結合本研究中POR 患者的特點，時間與穴位相結合，按陰陽五行運用五腧穴，故在臨床能取得較好的效果。文獻研究發(fā)現(xiàn)，將子午流注穴位電刺激儀應用在POR 不孕癥患者方面的研究尚缺乏，本研究首次將子午流注穴位電刺激儀結合輔助生育技術應用于POR 不孕癥患者中，根據(jù)患者就診時間選取相應的開穴進行治療，以望為有生育需求的POR 患者尋求一條新的道路。

本研究結果表明，觀察組治療后AFC顯著高于治療前，且基礎FSH 顯著低于治療前，差異有統(tǒng)計學意義。AFC 及基礎FSH 是反應卵巢儲備功能的兩個重要指標，AFC 越高，基礎FSH 越低則說明卵巢儲備功能越好。因此本研究結果提示經(jīng)子午流注穴位電刺激預處理后POR 患者的卵巢儲備功能得到顯著改善，此結果與焦嬌等研究結果相符［17］。同時本研究發(fā)現(xiàn)，觀察組促排卵中使用的Gn 總量顯著高于對照組（P= 0.014），考慮與觀察組患者的年齡偏高、卵巢儲備功能低下有關。年齡是預測卵巢儲備功能、評估卵子質量的重要指標之一。年齡越大，儲備功能越差，所需要的Gn 藥物則越多［20-21］。輔助生育治療結局方面，本研究發(fā)現(xiàn)使用子午流注穴位電刺激后患者的獲卵數(shù)及可利用胚胎數(shù)均顯著高于對照組（P值分別為0.021 及0.042），觀察組患者臨床妊娠率（44.4%）及活產(chǎn)率（29.6%）均高于對照組（分別為29.2%，12.5%），但差異無統(tǒng)計學意義，考慮可能與子午流注穴位電刺激通過穴位刺激，改善了患者卵巢血供，進而增加獲卵數(shù)及可利用胚胎數(shù)，改善了治療結局。子午流注繼承了傳統(tǒng)針灸的優(yōu)點，并在此基礎上利用“人與天地相應”的觀點，注重時間條件，以自然界周期現(xiàn)象，與人體氣血周流的情況相配合。既避免了針刺疼痛，操作亦方便易于患者接受，又達到溫通經(jīng)絡、活血化瘀、促進子宮及卵巢局部血液循環(huán)提高臨床療效的效果［22］。

綜上所述，子午流注穴位電刺激能提高POR患者的卵巢儲備功能，同時通過提高獲卵數(shù)及可利用胚胎數(shù)獲得較好的IVF 治療結局，具有重要的臨床研究價值。因本研究中樣本例數(shù)偏少，臨床妊娠率及活產(chǎn)率方面沒有差異性提高，同時其具體作用機制亦有待于進一步大樣本的臨床研究，且可以嘗試從基因表達、信號轉導通路等方面進行更加深入的研究。