7-二氟甲氧基-5,4′-二甲氧基金雀異黃素對(duì)卵巢上皮性癌細(xì)胞增值與遷移侵襲作用機(jī)制

匡婷, 李樂(lè)賽, 陳亦樂(lè)*

(1. 南華大學(xué) 研究生院臨床系， 湖南衡陽(yáng) 421001； 2.湖南省腫瘤醫(yī)院 婦瘤科， 湖南長(zhǎng)沙 410013)

卵巢癌作為全球女性致死率第一的婦科腫瘤，2019年約有22 500名新發(fā)卵巢癌患者，且有超過(guò)14 000例患者死于該疾病[1]，上皮性卵巢癌是最常見(jiàn)的一種卵巢癌類(lèi)型，同時(shí)也是近年來(lái)婦科腫瘤的研究熱點(diǎn).由于上皮性卵巢癌發(fā)病隱匿，70%的患者發(fā)現(xiàn)癌癥時(shí)已處于晚期或伴有多部位轉(zhuǎn)移，經(jīng)臨床一線治療后緩解的患者中,有55%～75%在2年內(nèi)復(fù)發(fā)[2]，且復(fù)發(fā)患者的10年無(wú)病生存率低于15%[3].因此，闡明上皮性卵巢癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制并加以干預(yù)，對(duì)于進(jìn)一步提高上皮性卵巢癌的治療效果具有重要意義.近年來(lái)，因植物類(lèi)提取的天然化合物具有高功效、低毒性等優(yōu)勢(shì)，故將其作為預(yù)防和治療包括癌癥在內(nèi)的許多疾病變得越來(lái)越受歡迎[4].

7-二氟甲氧基-5,4′-二甲氧基金雀異黃素(7-difluoromethoxy-5,4′-dimethoxygenistein, DFMG)是以金雀異黃素(genistein，GEN)為先導(dǎo)化合物，設(shè)計(jì)、合成和篩選得到的一種較先導(dǎo)化合物活性更高的新化學(xué)實(shí)體.國(guó)內(nèi)外報(bào)道DFMG具有抗炎[5]、抗動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成[6]、抗細(xì)胞凋亡[7]、抗內(nèi)皮細(xì)胞遷移[8]、抑制腫瘤血管新生[9]等藥理作用, 但目前國(guó)內(nèi)外尚無(wú)DFMG對(duì)卵巢上皮性癌細(xì)胞(skov3)細(xì)胞增殖、遷移侵襲及抗上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)作用機(jī)制的研究, 因此本文選用卵巢癌skov3,研究DFMG對(duì)其生物學(xué)行為的影響及初步機(jī)制探索,以期為DFMG用于卵巢癌治療提供相關(guān)理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 細(xì)胞來(lái)源

卵巢癌細(xì)胞系skov3購(gòu)于中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心.

1.1.2 主要試劑

RPMI 1640、胎牛血清和胰蛋白酶(美國(guó)Gibco公司); DFMG由湖南師范大學(xué)醫(yī)學(xué)院病理生理系提供; CCK-8試劑(唯贊公司);Transwell小室(美國(guó)Corning公司);基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司);SDS-PAGE凝膠配制試劑盒、RIPA蛋白裂解液與苯甲基磺酰氟 (PMSF)(上海碧云天);BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒及蛋白上樣緩沖液、青霉素和鏈霉素溶液(北京索萊寶科技公司);兔抗人鈣粘附蛋白E(E-cadherin)多克隆抗體、兔抗人波形蛋白(vimentin)多克隆抗體、鼠抗人GAPDH多克隆抗體(武漢三鷹公司); E-cadherin、vimentin、GAPDH引物 (上海生工公司)；熒光二抗(北京中杉金橋生物公司).

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

skov3以RPMI 1640培養(yǎng)基加體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清及青霉素和鏈霉素,在體積分?jǐn)?shù)5%CO2、37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng), 每日更換新鮮細(xì)胞培養(yǎng)液,細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿(mǎn)80%瓶壁時(shí), 胰酶消化傳代.

1.2.2 藥物制備

DFMG(自主合成,純度>99%,分子式為C18H14O5F2,相對(duì)分子質(zhì)量348,性狀為淡黃色晶體粉末)溶解于二甲基亞砜 (DMSO),并控制DMSO質(zhì)量濃度為0.1%, 在4 ℃存放.

1.2.3 CCK-8法檢測(cè)DFMG對(duì)skov3細(xì)胞增殖的影響

將skov3按5 000/孔細(xì)胞接種于96孔板，培養(yǎng)24 h后, 加入不同濃度 (0、5、10、20、40、80、160 μmol/L)DFMG培養(yǎng)24 h后, 再加入CCK-8試劑, 37 ℃孵育1h后測(cè)得吸光度值并計(jì)算其增值抑制率；最后計(jì)算出DFMG對(duì)skov3的IC50，作為后續(xù)研究的藥物濃度.

1.2.4 劃痕實(shí)驗(yàn)測(cè)定skov3遷移能力

skov3按1×107/mL的密度接種于6孔板，每孔1 mL細(xì)胞懸液, 至細(xì)胞融合率達(dá)80%左右時(shí)，使用200 μL槍頭尖端在單層細(xì)胞的中間刮出一條劃痕.PBS洗滌3次后,將skov3分為空白組、溶劑組(質(zhì)量濃度0.1% DMSO)、DFMG組，并根據(jù)不同條件培養(yǎng)基培養(yǎng)3組細(xì)胞24 h后,顯微鏡(40×)下隨機(jī)選擇3個(gè)視野,計(jì)算劃痕面積遷移率,其公式為：遷移率=(ST0-ST24)/ST0×100%.

1.2.5 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)skov3的侵襲能力

使用24孔板及8 μm孔徑Transwell小室進(jìn)行skov3細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn).于冰上用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋基質(zhì)膠 (V基質(zhì)膠∶V稀釋液=1∶8),取50 μL均勻覆蓋在上室, 37℃孵育1h使膠凝固.先消化細(xì)胞，再用無(wú)血清RPMI1640培養(yǎng)基終止消化且制備成密度為1×108/L的細(xì)胞懸液,取100 μL 懸液接種于Transwell上室,按不同條件培養(yǎng)3組skov3，即空白組、溶劑組、DFMG組.下室加入500 μL含有體積分?jǐn)?shù)20%胎牛血清的生長(zhǎng)培養(yǎng)基.在37 ℃下孵育48 h.PBS清洗上下室3次,固定并染色后在顯微鏡下觀察、計(jì)數(shù).

1.2.6 Western blotting檢測(cè)skov3不同處理組EMT的表達(dá)水平

將skov3按5×106/mL的密度種于6孔板,每孔1 mL,根據(jù)不同處理?xiàng)l件將skov3細(xì)胞分為:空白組、溶劑組、DFMG組，分別處理24 h后,收集各組細(xì)胞總蛋白,加入蛋白上樣緩沖液(5×)變性, 配制SDS-PAGE凝膠, 每孔蛋白上樣量約為15 μg, 開(kāi)始電泳, 待溴酚藍(lán)到達(dá)膠的底端處附近即可停止電泳, 轉(zhuǎn)膜并封閉.隨后進(jìn)行一抗 (E-cadherin/vimentin稀釋比例V抗體∶V稀釋液=1∶1 000;GAPDH稀釋比例V抗體∶V稀釋液=1∶10 000)和二抗(V抗體∶V稀釋液=1∶10 000)的孵育.最后用ECL類(lèi)試劑和顯影儀來(lái)檢測(cè)蛋白.用Image J軟件測(cè)定光密度值分析E-cadherin和vimentin的蛋白相對(duì)表達(dá)量.

1.2.7 免疫熒光檢測(cè)skov3不同處理組EMT的表達(dá)水平

將處于對(duì)數(shù)增長(zhǎng)期的skov3,制備密度成1×105/L的細(xì)胞懸液，接種于放有無(wú)菌玻片的12孔板中接種至含有玻璃片的24孔板內(nèi)，且按空白組、溶劑組、DFMG組分組培養(yǎng)24 h后.采用細(xì)胞免疫熒光染色法檢測(cè)skov3中EMT標(biāo)志物E-cadherin、vimentin的表達(dá),簡(jiǎn)要步驟如下:細(xì)胞爬片后經(jīng)多聚甲醛溶液固定,即用Triton X-100室溫通透10 min,PBS沖洗5×3 min, BSA室溫下封閉30 min,兔抗人一抗E-cadherin (V抗體∶V稀釋液=1∶100)及vimentin (V抗體∶V稀釋液=1∶100) 4 ℃孵育過(guò)夜, PBS沖洗5×3 min, FITC標(biāo)記羊抗兔二抗避光常溫孵育1 h，PBS沖洗5×3 min，DAPI復(fù)染核，再用PBS沖洗5×3 min.用甘油封片,激光共聚焦顯微鏡觀察并拍照,對(duì)熒光染色結(jié)果進(jìn)行定量分析.

1.2.8 qRT-PCR法檢測(cè)skov3不同處理組EMT相關(guān)基因表達(dá)

將skov3按1×106/mL的密度種于6孔板,每孔1 mL,根據(jù)不同處理?xiàng)l件將skov3分為:空白組、溶劑組、DFMG組，培養(yǎng)24 h后，用Trizol試劑提取各組細(xì)胞總RNA,紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度及純度.應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA,實(shí)時(shí)熒光定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)在美國(guó)Bio-Rad C1000 PCR儀上進(jìn)行,每樣本設(shè)3個(gè)復(fù)孔,反應(yīng)條件:95 ℃ 30 s,95 ℃ 10 s,58 ℃ 5 s,擴(kuò)增40個(gè)循環(huán).基因表達(dá)情況采用2-ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量分析.

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，計(jì)量資料以(均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差)表示.兩組間比較采用t檢驗(yàn),多組間均數(shù)比較采用方差分析,2檢驗(yàn),P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，用Graphpad prism 5.0軟件作圖.

2 結(jié)果

2.1 DFMG對(duì)skov3增值活性的影響

分別用濃度0、5、10、20、40、80、160 μmol/L的DFMG處理細(xì)胞24 h后，觀察細(xì)胞增值活力(圖1)，從DFMG濃度為40 μmol/L開(kāi)始，細(xì)胞的增值活力明顯受抑制(P<0.05)，半數(shù)藥物抑制濃度(IC50)為(113.1±12.1)μmol/L,于是選取113 μmol/L DFMG濃度作為后續(xù)所有實(shí)驗(yàn)的研究濃度(與空白對(duì)照組相比，溶劑組對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)無(wú)抑制作用).

2.2 DFMG對(duì)skov3遷移與侵襲能力的影響

DFMG能降低skov3的遷移和侵襲的能力.在細(xì)胞傷口愈合實(shí)驗(yàn)中，DFMG組細(xì)胞的遷移率均為32% 明顯低于于空白組64.33%(圖2A).在Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)中，DFMG組的侵襲細(xì)胞數(shù)量(78個(gè)細(xì)胞)顯著減少(圖2B)；結(jié)果與空白組(225個(gè)細(xì)胞)相比，差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05).

與空白組比較，1)P<0.05，2)P<0.01Compared with the blank group，1)P<0.05，2)P<0.01

與空白組比較，1)P<0.05Compared with the blank group，1)P<0.05A：劃痕實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)細(xì)胞遷移能力；B：Transwell實(shí)驗(yàn)：檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力.A：Wound healing test: detecting the migration ability of cells B：Transwell test: detecting the invasion ability of cells.

2.3 DFMG對(duì)skov3 EMT的影響

Western blot、細(xì)胞免疫熒光及qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,DFMG處理后的skov3與空白組相比，E-cadherin蛋白及mRNA表達(dá)均增高而vimentin蛋白及mRNA表達(dá)均顯著降低(P<0.05,圖3A、3B).

與空白組比較，1)P<0.05Compared with the blank group，1)P<0.05A、D：蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞免疫熒光實(shí)驗(yàn)檢測(cè)EMT相關(guān)指標(biāo)蛋白變化；B、C：qRT-PCR檢測(cè)EMT相關(guān)指標(biāo)mRNA變化.A、D：Western blot and cellular immunofluorescence tests：detecting protein changes of EMT; B、C：qRT-PCR: detecting mRNA changes of EMT.

3 討論

GEN，一種植物類(lèi)天然異黃酮化合物，具有抗炎、抗過(guò)敏、抗腫瘤等功效. DFMG是其化學(xué)合成衍生物，且化學(xué)活性高于GEN.近年來(lái)有研究顯示：DFMG能通過(guò)抑制TLR4表達(dá)減少內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力[8]；DFMG能通過(guò)線粒體凋亡途徑促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞(hela)凋亡[10]；DFMG還可通過(guò)TLR4/NF-κB途徑顯著抑制白血病細(xì)胞血管新生[9]等.盡管DFMG目前抗腫瘤的分子機(jī)制研究不多，但把DFMG作為研發(fā)新的抗腫瘤藥仍具有廣泛的前景.

上皮性卵巢癌的死亡率已占據(jù)女性生殖器官惡性腫瘤首位，具有發(fā)病隱匿、高轉(zhuǎn)移性和易耐藥的特點(diǎn)，臨床治療常為：手術(shù)聯(lián)合化療的標(biāo)準(zhǔn)治療方案并輔以靶向及免疫治療，但其治療效果仍差，5年生存率低于30%[11].因此，發(fā)現(xiàn)新的靶分子或藥物可為提高卵巢癌治療及預(yù)后提供更好的研究方向.EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中具有重要作用，是腫瘤發(fā)生轉(zhuǎn)移的第一步[12].近年來(lái)越來(lái)越多的研究將逆轉(zhuǎn)EMT作為抗卵巢癌轉(zhuǎn)移的重要研究方向[13-15].

EMT是指在某些生理和病理狀態(tài)下出現(xiàn)的上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)化的現(xiàn)象，細(xì)胞間的粘附力降低，而癌細(xì)胞的遷移、侵襲能力增加[16]；在這個(gè)過(guò)程中，上皮細(xì)胞發(fā)生去上皮化、喪失極性，上皮細(xì)胞的標(biāo)志分子(E-cadherin、ZO-1等)表達(dá)逐步下降，而細(xì)胞骨架重構(gòu)、細(xì)胞形態(tài)改變，表達(dá)間質(zhì)性細(xì)胞的標(biāo)志分子(如：vimetin、N-cadherin等)增加[17-19].隨著正常細(xì)胞、組織形態(tài)及構(gòu)架被打破，為癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)提供了合適的環(huán)境，因此，開(kāi)發(fā)有效抑制上皮性卵巢癌EMT過(guò)程的藥物具有重要意義.

目前，植物提取物的抗腫瘤EMT作用逐步受到關(guān)注[20].植物提取物具有原料容易獲得、價(jià)格較為便宜、非人工合成的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)，一直是治療藥物的來(lái)源和藥物加工的基礎(chǔ).本實(shí)驗(yàn)通過(guò)CCK-8法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)濃度為40 μmol/L的DFMG開(kāi)始顯著抑制卵巢癌skov3的增殖能力,并存在濃度依賴(lài)性，IC50為(113.1±12.1)μmol/L.細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)卵巢癌skov3細(xì)胞的遷移率受DFMG抑制,且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.進(jìn)一步行Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),經(jīng)113 μmol/L DFMG處理后的細(xì)胞穿過(guò)小室的細(xì)胞明顯少于對(duì)照組,DFMG顯著抑制卵巢癌skov3的遷移、侵襲能力.為探討DFMG抑制卵巢癌skov3的體外增殖和遷移、侵襲能力的機(jī)制,本研究進(jìn)一步進(jìn)行Western Blot、細(xì)胞免疫熒光和qRT-PCR實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)E-cadherin、vimentin蛋白和mRNA的表達(dá),結(jié)果顯示,DFMG處理后的skov3 E-cadhein的蛋白和mRNA增高，而vimentin的蛋白和mRNA減少.這一結(jié)果提示DFMG抑制卵巢癌skov3的體外增殖和遷移、侵襲能力,可能與其逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞EMT有關(guān).

綜上所述,本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DFMG能抑制skov3增殖、遷移和侵襲能力，可能與其逆轉(zhuǎn)癌細(xì)胞EMT有關(guān).這可為下一步尋找卵巢癌的新療法提供一定的理論基礎(chǔ)及實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但其更為詳細(xì)的調(diào)節(jié)機(jī)制有待進(jìn)一步探討.