褐藻降血糖活性物質(zhì)的研究進(jìn)展

袁鑫，閆培生

（哈爾濱工業(yè)大學(xué)（威海）海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，山東 威海 264209）

高血糖（hyperglycemia）是一種慢性疾病，發(fā)生在胰腺不再能夠制造胰島素或人體無法充分利用其產(chǎn)生的胰島素時(shí)，會(huì)導(dǎo)致血液中葡萄糖水平升高。在中國已有1.14億的患病人數(shù)，6 130萬的未診斷人數(shù)以及4 680萬的前期患者[1]。糖尿病患者糖基化產(chǎn)物的積累和伴隨的結(jié)構(gòu)性細(xì)胞外基質(zhì)修飾導(dǎo)致了糖尿病功能性并發(fā)癥的發(fā)展，包括心血管疾病、腎病、眼部疾病等，大大增加了其死亡率[2]。目前，有效的降血糖藥物包括二甲雙胍、格列美脲、阿卡波糖、諾和靈30R、優(yōu)泌林70/30等，這些藥物雖然有效，但長(zhǎng)期使用依然會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的繼發(fā)癥，如庫欣綜合征、肢端肥大癥等[3]。因此開發(fā)天然、無副作用的新型藥物迫在眉睫。隨著我國海洋強(qiáng)國的提出，現(xiàn)在進(jìn)入了大規(guī)模開發(fā)利用海洋時(shí)期，期望從海洋中找到新的降血糖藥物，對(duì)海藻降血糖活性物質(zhì)的研究由來已久，尤其是褐藻，由于其種類豐富、結(jié)構(gòu)新穎已成為開發(fā)降血糖藥物的重要來源。

1 褐藻降血糖活性物質(zhì)的種類

褐藻是海洋藻類中較高級(jí)的多細(xì)胞生物，主要指海帶、裙帶菜、馬尾藻、鹿角菜等，近年來，隨著對(duì)褐藻有效成分的分離與鑒定，證明了其降血糖活性物質(zhì)的多樣性。

1.1 多糖類

褐藻多糖是一類分子量大、結(jié)構(gòu)復(fù)雜、具有其它多糖不具有的藥理活性的天然化合物，目前主要是從海帶、墨角藻等中提取，以褐藻膠和褐藻糖膠形式存在[4]。徐宏亮通過對(duì)鏈脲佐菌素導(dǎo)致的糖尿病小鼠模型發(fā)現(xiàn)，每天喂食來自墨角藻的褐藻多糖500 mg/kg，發(fā)現(xiàn)其對(duì)糖尿病小鼠的血糖有顯著抑制作用，在喂食第21天后，血糖含量降低了11.3%，在第32天，下降了21.1%，并發(fā)現(xiàn)其可能通過調(diào)節(jié)血糖代謝或抗氧化等方面，顯著降低血糖含量，但其并未對(duì)褐藻多糖進(jìn)行純化鑒定，沒有明確其有效成分[5]。王晶等通過對(duì)四氧嘧啶糖尿病模型小鼠發(fā)現(xiàn)，褐藻多糖硫酸酯對(duì)糖尿病小鼠的體重和糖耐量沒有顯著影響，卻可提高血清胰島素水平，并通過摘除右腎后注射鏈脲佐菌素致患糖尿病小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠的白內(nèi)障患病幾率低于空白組，且尿蛋白含量減少，在給藥第8周、10周血糖明顯下降，推測(cè)其可能是通過提高血清胰島素水平，降低血糖含量[6]。徐穎婕通過對(duì)鏈脲佐菌素導(dǎo)致的糖尿病小鼠模型發(fā)現(xiàn)，低分子量褐藻多糖硫酸酯（8 177 Da），以低劑量 100 mg/kg、高劑量 200 mg/kg給模型小鼠灌胃，高劑量效果好于低劑量組，都可以減輕蛋白尿的發(fā)生，其糖化血清蛋白高劑量組第69天時(shí)的含量為（219.9±58.1）mmol/L，低于模型組小鼠的（279.2±41.6）mmol/L，可通過抑制乙酰肝素酶及相關(guān)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，來減輕腎病并降低血糖含量緩解糖尿病[7]。Heeba等通過喂食高脂飲食12周的小鼠模型，在第4周開始口服巖藻依聚糖（100 mg/kg），結(jié)果顯示，其可減緩非酒精性脂肪肝的發(fā)展，降低空腹血糖含量及對(duì)胰島素的抵抗，有效降低了血脂含量[8]。Kim等通過對(duì)巖藻依聚糖的結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，較低的硫酸鹽含量（15.5%）和中等分子量（2 351 kDa）的巖藻依聚糖可以通過與α-淀粉酶靜電結(jié)合而抑制其活性，從而發(fā)揮對(duì)2型糖尿病的治療[9]。海藻酸鈉主要是從馬尾藻、海帶等褐藻中提取到的，由β-D-甘露糖醛酸（M糖），和α-L-古洛糖醛酸（G糖）連接而成的鈉鹽，其具有降血糖、抗氧化等功能。Sim Sung-Yi等從裙帶菜中提取褐藻多糖，將3T3-L1細(xì)胞（小鼠成纖維細(xì)胞）分別用10、50、100、200 μg/mL 處理，通過 AdipoRed分析脂肪細(xì)胞分化過程中的脂質(zhì)積累，發(fā)現(xiàn)其活性呈劑量關(guān)系抑制3-磷酸甘油脫氫酶（glycerol 3-phosphate dehydrogenase，GDPH）的活性，改善胰島素刺激的葡萄糖攝取和抑制脂肪細(xì)胞中的基礎(chǔ)脂解，以達(dá)到抗糖尿病的功效[10]。

1.2 寡糖類

衍生自海藻細(xì)胞壁的寡糖具有多種生物活性，也已成為降血糖藥物的重要來源。祝君梅等通過四氧嘧啶糖尿病模型小鼠的研究，利用從高等褐藻細(xì)胞壁中提取到的殼聚糖的降解產(chǎn)物殼寡糖以600、300、150 mg/kg喂食模型組小鼠21 d，發(fā)現(xiàn)其給藥后的胰島素水平均升高，分別為（39.41±17.2）、（31.14±7.91）、（30.46±11.03）mmol/L， 高于模型組的胰島素水平（27.95±1.79）mmol/L，對(duì)正常小鼠的血糖含量無影響，可有效降低糖尿病小鼠的血糖水平，其作用機(jī)理為增強(qiáng)胰島素受體的敏感性，以達(dá)到降血糖的作用[11]。張敖珍等通過四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的研究，喂食硒化卡拉膠寡糖（硒含量1.125%）高、中、低3個(gè)劑量組的模型小鼠，其中中、小劑量組的血糖含量與正常小鼠的無顯著變化，均在（5.78±1.85）mmol/L，而高劑量組的血糖含量明顯降低，其值為（4.59±0.89）mmol/L，但其作用機(jī)理目前尚不明確[12]。

1.3 生物肽

多種氨基酸以不同排列方式組成肽，而肽又是組成大分子蛋白質(zhì)的前提。蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展為解決糖尿病等健康問題提供了有前途的解決方案。功能肽通常是在體內(nèi)或體外條件下存在，使用不同種類的蛋白水解酶通過酶促水解從蛋白質(zhì)中產(chǎn)生的，具有多種活性，包括抗糖尿病和免疫調(diào)節(jié)[13-14]。孟然研究發(fā)現(xiàn)海帶酶解物（蛋白質(zhì)含量為30.56%）對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶均具有抑制作用，其IC50值分別為8.24 mg/mL、16.76 mg/mL，且抑制作用與劑量濃度呈正相關(guān)[15]。糖尿病會(huì)引起機(jī)體抗氧化能力的下降，因此，提高抗氧化能力會(huì)從側(cè)面有效的緩解糖尿病以提高機(jī)體氧化應(yīng)激能力。黃欽欽等通過酶解條斑紫菜獲得以1 000 Da以下二肽到五肽為主的小分子活性肽蛋白酶解液，并解析出兩條多肽的氨基酸序列，分別為丙氨酸-脯氨酸（Ala-Pro）、脯氨酸-甘氨酸-甘氨酸-纈氨酸（Pro-Gly-Gly-Val），測(cè)出 1 000 Da以下粗肽液對(duì)α-葡萄糖苷酶的IC50為19.83 μg/mL，低于阿卡波糖的IC50值 35.65 μg/mL，具有明顯的降血糖功能[16]。

1.4 膳食纖維

膳食纖維被定義為“凡是不能被人體內(nèi)源酶消化吸收的可食用植物細(xì)胞、多糖、木質(zhì)素以及相關(guān)物質(zhì)的總和”，海藻中含有豐富的膳食纖維，馬尾藻、江蘺等均是其來源[17]。湯宇青等將石莼脫蛋白處理后得到水溶性膳食纖維，測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性均高于未脫蛋白前，其最大抑制率分別為43.90%、63.02%，并具有明顯的量效關(guān)系[18]。李耀冬等通過對(duì)四氧嘧啶糖尿病小鼠模型灌胃高、中、低劑量組的復(fù)方海藻膳食纖維混懸液，并測(cè)量模型小鼠的空腹血糖含量，結(jié)果表明高、中、低劑量組的血糖含量均低于正常小鼠的血糖（21.52±2.55）mmol/mL，且存在明顯的劑量關(guān)系，證實(shí)海藻膳食纖維可有效的降低模型小鼠的血糖水平并減輕胰島β細(xì)胞受損程度[19]。Isabel等通過研究健康志愿者餐后血糖反應(yīng)，先采集禁食狀態(tài)下的血糖含量，再測(cè)量食用海苔15、30、45、60、90、120 min時(shí)的血樣分析表明，攝入富含膳食纖維的海苔面包后，在30 min～60 min時(shí)發(fā)現(xiàn)了葡萄糖粒，葡萄糖水平持續(xù)到120 min，以此計(jì)算淀粉消化率做為預(yù)測(cè)血糖含量的指標(biāo)，其作用機(jī)制可能是通過改變面包中淀粉的生物利用度，促進(jìn)淀粉的消化以降低血糖水平[20]。Mojica等通過比較裙帶菜、長(zhǎng)卷心菜、紫菜的氯仿、乙醇和水溶液提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶和葡萄糖擴(kuò)散的體外抑制活性表明，可溶性膳食纖維對(duì)降血糖具有有效作用[21]。肖紅波等通過給四氧嘧啶糖尿病小鼠喂食高、低劑量組的可溶性裙帶菜膳食纖維，測(cè)定其血糖，發(fā)現(xiàn)其對(duì)正常小鼠的血糖含量無明顯影響，其血糖含量均在（8.55±1.13）mmol/L，但對(duì)模型組小鼠的血糖含量有顯著降低，高、低劑量組模型小鼠的糖異生率為7.8%、5.6%，作用機(jī)制可能為降低了四氧嘧啶對(duì)胰島β細(xì)胞的損傷或改善了受損傷胰島β細(xì)胞的功能，以達(dá)到降血糖的功效[22]。

1.5 酚類

海藻多酚是海藻次級(jí)代謝產(chǎn)物，隨著提取和分離純化技術(shù)的改進(jìn)，人們對(duì)其生物活性有了更深的了解，其在降血糖新藥開發(fā)的作用越來越重要。海藻多酚具有很強(qiáng)的自由基清除性能，因此具有較強(qiáng)的抗氧化能力。Spurr等發(fā)現(xiàn)水和乙醇-水的混合物是大規(guī)模從海藻中提取間苯二酚最適合的溶劑[23]。Seung-Hong Lee等從褐藻Ecklonia cava中提取到一種鄰苯二酚的生物多酚化合物，以80名糖尿病前期的男性和女性成年人為研究對(duì)象，分為平行分組設(shè)計(jì)的隨機(jī)、雙盲和安慰劑對(duì)照試驗(yàn)，記錄血糖參數(shù)、血清生化和血液學(xué)的影響，發(fā)現(xiàn)其可保護(hù)細(xì)胞免受高血糖引起的氧化應(yīng)激所造成的傷害，也可對(duì)2型糖尿病患者的肝糖和脂質(zhì)代謝具有有益作用[24]。Hyun-Ah Lee等從褐藻Ecklonia cava中分離到一種間苯三酚，以鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠為模型，喂食后在0、30、60、120 min從尾靜脈采血，并通過血糖儀測(cè)量血糖，并以阿卡波糖為陽性對(duì)照，測(cè)定其對(duì)α-葡萄糖苷酶和α-淀粉酶的抑制活性，發(fā)現(xiàn)其IC50分別為23.35、6.94 mg/mL，而且該酚還可延遲碳水化合物的消化和在小腸中的吸收，從而降低了餐后血糖水平[25]。

2 褐藻降血糖活性的檢測(cè)方法

2.1 動(dòng)物模型

在驗(yàn)證提取物降血糖功能時(shí)，通常使用四氧嘧啶和鏈脲佐菌素誘導(dǎo)的糖尿病小鼠模型。其原理是：四氧嘧啶是有毒的葡萄糖類似物，其優(yōu)先通過葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白積累在胰腺β細(xì)胞中，在細(xì)胞內(nèi)硫醇（尤其是谷胱甘肽）存在的條件下，四氧嘧啶在循環(huán)氧化還原反應(yīng)中會(huì)與其還原產(chǎn)物二乙酸產(chǎn)生活性氧，并與鐵催化反應(yīng)步驟中產(chǎn)生羥自由基，這些羥自由基導(dǎo)致β細(xì)胞的死亡，并最終導(dǎo)致胰島素依賴性“四氧嘧啶糖尿病”。鏈脲佐菌素分為葡萄糖和甲基亞甲基脲部分，由于其烷基化特性，后者可以修飾生物大分子，使DNA斷裂并破壞β細(xì)胞，從而導(dǎo)致胰島素依賴狀態(tài)[26]。而在高血糖小鼠模型的建立上也要注重模型的穩(wěn)定性和成模率。朱之烽等通過正交試驗(yàn)，確定了在第3周開始注射鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ），注射劑量為85 mg/kg（注射2次，每次間隔5 d），成模率在90%以上，使其更接近2型糖尿病[27]。

2.2 分子模型

因?yàn)槟壳捌毡榈慕笛撬幬铮ò⒖úㄌ?、格列寧）均是?葡萄糖苷酶抑制劑，所以提取物對(duì)α-葡萄糖苷酶的抑制作用是一個(gè)降血糖效果的指標(biāo)。α-糖苷酶抑制劑不像胰島素或磺酰脲類具有降血糖活性，相反，在攝入碳水化合物后降低健康和糖尿病個(gè)體的餐后血糖升高，減少餐后胰島素分泌，其減少了極低密度脂蛋白的合成，并且與胰島素和磺酰脲類藥物相比，沒有脂肪形成潛力[28]。其酶促反應(yīng)體系如下：以阿卡波糖為陽性對(duì)照，等量的緩沖液為陰性對(duì)照，樣品液先通過微孔膜過濾，將α-葡萄糖苷酶與各濃度梯度的樣品溶液充分混合，然后經(jīng)過保育，再加入適量的對(duì)硝基苯-α-D-葡萄糖苷（P-Nitrobenzene-α-D-glucoside，PNPG），最后再加入終止劑，在405 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度（OD）值，其抑制率公式為：

抑制率/%=（1-樣品組OD值/陰性對(duì)照組OD值）×100

同時(shí)蛋白酪氨酸磷酸酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B，PTP1B）是開發(fā)治療糖尿病藥物的有效靶點(diǎn)之一，PTP1B是胰島素信號(hào)通路的重要調(diào)節(jié)劑，其可使胰島素受體激酶的絡(luò)氨酸殘基去磷酸化來負(fù)調(diào)控胰島素信號(hào)的傳導(dǎo)，因此PTP1B是治療2型糖尿病的誘人靶標(biāo)[29]。

3 褐藻降血糖活性物質(zhì)的提取方法

3.1 多糖類的提取

褐藻多糖提取多以成本低且操作簡(jiǎn)單的稀酸、稀堿和水提法居多，隨著近些年來微波、超聲、酶解法的發(fā)展，人們對(duì)其提取工藝的研究越加深入。戴圣佳等通過單因素和正交試驗(yàn)優(yōu)化了海藻多糖硫酸酯的超聲提取工藝，確定了最佳提取條件：超聲功率250 W、超聲時(shí)間 25 min、料液比 1 ∶70（g/mL）、溫度 60 ℃[30]。譚潔怡等進(jìn)行了超聲波法提取裙帶菜中褐藻多糖硫酸酯的提取工藝優(yōu)化，確定了最佳提取條件：固液比1∶100（g/mL）、超聲功率 1 000 W、超聲時(shí)間 25 min，該條件下的褐藻多糖硫酸酯的得率和純度比水提法提高了23.59%、30.92%[31]。Rosa等進(jìn)行了微波法提取巖藻依聚糖的提取工藝優(yōu)化，確定了最佳提取條件：在壓力 827.4 kPa、萃取時(shí)間 1 min、料液比 1 ∶25（g/mL）時(shí)，巖藻依聚糖的收率最高為18.22%[32]。Noelia等對(duì)超聲法提取鼠尾藻中的巖藻依聚糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，確定了最佳提取條件：溫度25℃、超聲功率150 W、頻率40 kHz、時(shí)間5 min～30 min，在最佳條件下提取到的產(chǎn)物：質(zhì)量比為 1∶0.70∶0.33∶0.27∶0.22∶0.10 的巖藻糖：半乳糖：葡萄糖：木糖：甘露糖：鼠李糖的寡糖，超聲提取裙帶菜可提高收率并減少提取時(shí)間，而且比標(biāo)準(zhǔn)巖藻依聚糖（767.2 kDa）和常規(guī)巖藻依聚糖（582.5 kDa）相比，平均相對(duì)分子質(zhì)量降低了（390.6 kDa）[33]。Quitain 等進(jìn)行了微波-水提法對(duì)裙帶菜中提取褐藻糖膠的工藝研究，結(jié)果表明，與常規(guī)加熱相比，微波加熱更具優(yōu)勢(shì)，可以在接近140℃的溫度下獲得5 kDa～30 kDa的低分子量組分，在恒定的微波功率下，在短短的1min照射時(shí)間內(nèi)連續(xù)進(jìn)行微波照射，就可獲得理想結(jié)果，并且在水熱加熱的微波照射過程中，由于分子攪拌，局部加熱和傳質(zhì)的改善等熱效應(yīng)，褐藻糖膠的降解得到增強(qiáng)[34]。

3.2 褐藻寡糖的提取

傳統(tǒng)的褐藻寡糖多是用濃酸水解海藻酸鈉，但伴隨著嚴(yán)重污染和聚合度難以控制等問題，隨著酶解法、氧化降解法等的提出，大大解決了該問題。賀秋紅等利用響應(yīng)面法優(yōu)化了海藻寡糖的提取工藝，最佳條件為：海藻酸鈉質(zhì)量濃度1 g/100 mL、酶解溫度40℃、pH8.0，得到的寡糖的平均聚合度為4.08，比優(yōu)化前降低了27.35%[35]。李海波等采用氧化降解技術(shù)從馬尾藻等藻類中提取海藻膠低聚寡糖的工藝進(jìn)行了優(yōu)化，最佳條件為：氧化劑（H2O2）濃度6%、反應(yīng)時(shí)間8 h，其產(chǎn)率達(dá)到最高60%左右[36]。Hyun-Jee Kim等從褐藻Sargassum Thunbergii中提取了一種可降解藻酸鹽的細(xì)菌，通過16 S rRNA序列分析其為弧菌屬菌株，可在pH為7、3% NaCl和6%海藻酸、孵育48 h，經(jīng)過薄層色譜分析結(jié)果表明，其可用于藻酸鹽寡糖的制備[37]。

3.3 膳食纖維的提取

褐藻中含有大量的半纖維素和纖維素，是膳食纖維的重要來源。費(fèi)亞芬等從7種海藻中篩選出龍須菜的膳食纖維含量最豐富，其含量為67.17%，并用響應(yīng)面優(yōu)化了殘?jiān)攀忱w維的提取工藝，最佳條件為：料液比 1∶95（g/mL）、時(shí)間 50 min、溫度 50℃、功率 200 W，此條件的實(shí)際得率為8.23%[38]。呂鐘鐘通過單因素試驗(yàn)，確定了木瓜蛋白酶酶解蛋白質(zhì)的最佳工藝，其條件為：pH6.5、溫度50℃、酶量0.5%、酶解時(shí)間2 h[39]。李來好等通過酶-化學(xué)相結(jié)合的方法優(yōu)化了海帶膳食纖維的提取工藝，其最佳條件為：纖維素酶含量100U/g、蛋白酶2 000 U/g、時(shí)間1 h，其產(chǎn)率可達(dá)到27.1%[40]。

3.4 多酚類的提取

國內(nèi)外有關(guān)多酚的提取方法主要有：水和有機(jī)溶劑提取法、離子沉淀法、超聲波浸提法、低溫純化酶法、超臨界萃取等方法[41]。從海藻中分離得到的多酚主要為褐藻多酚類、黃酮類、酚酸類和鹵代酚類等。婁燕通過單因素試驗(yàn)和響應(yīng)面法優(yōu)化了從鼠尾藻中提取多酚的工藝，其最佳條件為：料液比為1∶25（g/mL）、乙醇濃度為40.2%、浸提時(shí)間40 min，其鼠尾藻多酚的理論浸出率為1.704%，實(shí)測(cè)為1.703%[42]。Minseok Yoon等通過響應(yīng)面法優(yōu)化了從褐藻Ecklonia cava中回收蘆丁單寧的提取條件，其最佳條件為：乙醇濃度為95%、提取溫度80℃、提取時(shí)間24 h，在此條件下，提取出的總蘆丁單寧為57.2 mg，間苯三酚的收率為7.8%[43]。Michalak等從滸苔中提取多酚，確定了最適實(shí)驗(yàn)條件為：時(shí)間8 h和100 μL纖維素酶的水解產(chǎn)率為36%，每100g干提取物的總酚含量為55mg沒食子酸當(dāng)量[44]。K.H.Sabeena等用體外抗氧化劑測(cè)定法篩選了16種來自丹麥海岸的海藻的水和乙醇提取物的抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)乙醇比水更有效的萃取多酚，通常，各種抗氧化測(cè)定與總酚含量相關(guān)性很好，說明藻類多酚是這些提取物的活性成分。但是，在某些抗氧化劑測(cè)定中，總酚含量較低的某些物種也顯示出良好的抗氧化功能，表明乙醇提取物中的其他成分如硫酸化多糖、蛋白質(zhì)等也具有抗氧化活性[45]。

4 展望

糖尿病已經(jīng)成為人類健康的一大殺手，而目前的降血糖藥物大多數(shù)是化學(xué)合成的，雖能有效的抑制高血糖，但隨著用藥的增加和身體狀況的變化，都會(huì)產(chǎn)生許多副作用，因此，海洋藥物是人類的一個(gè)重要選擇。海藻尤其是褐藻具有多種降血糖活性物質(zhì)，然而目前對(duì)其缺乏有效的提取手段，且大多數(shù)均利用化學(xué)方法提取，這無疑增加了提取成本。褐藻降血糖活性物質(zhì)的結(jié)構(gòu)鑒定、構(gòu)效關(guān)系與作用機(jī)制也尚不明確。隨著組學(xué)的發(fā)展，將此利用在降血糖海洋藥物的開發(fā)上顯得勢(shì)在必行。