不同采收期香椿茶發(fā)酵前后活性成分、降糖活性及其揮發(fā)性成分比較分析

蔣鵬飛，高海東，趙麗麗，王趙改,*，史冠瑩，張 樂，王曉敏，王旭增

（1.河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450000；2.河南省商業(yè)科學(xué)研究所有限責(zé)任公司，河南 鄭州 450002）

香椿（Toona sinensis(A. Juss.) Roem）為楝科香椿屬落葉喬木，已有2 300多年的栽培歷史，是我國特有的集材、菜、藥于一體的珍貴木本植物[1]。香椿嫩芽香氣濃郁，口味獨(dú)特，富含人體所必需的氨基酸、蛋白質(zhì)、維生素和微量元素等多種營養(yǎng)成分，具有較高的食用價(jià)值[2]。此外，香椿的根、樹皮、種子等均可入藥，富含黃酮、多酚、萜類、生物堿等多種生物活性成分，具有顯著的抗氧化、抗癌、降血糖、降血壓、減肥等功效，且在生長過程中自身能夠分泌驅(qū)蟲物質(zhì)，無需噴施農(nóng)藥，是名副其實(shí)的綠色蔬菜[3-4]。隨著人們生活水平的提高和保健意識(shí)的增強(qiáng)，茶飲作為一種保健飲品，在調(diào)整機(jī)體代謝平衡、保持身心健康方面具有較好的預(yù)防甚至治療作用，因此倍受消費(fèi)者關(guān)注。紅茶因茶性溫和、兼容性強(qiáng)，具有紅湯紅葉、香甜味醇、保健功效等特征[5]，成為全球消費(fèi)量最大的茶類，約占消費(fèi)總量的80%。

近年來，在市場經(jīng)濟(jì)的驅(qū)使下，香椿種植在全國范圍內(nèi)出現(xiàn)規(guī)?；驮?，而研究者對(duì)香椿的研究主要集中在品種選育[6]、栽培管理[7]、貯藏保鮮[8]、品質(zhì)分析[9-12]等方面，但對(duì)香椿加工制品的研究較少。目前香椿加工制品多以腌制為主，存在營養(yǎng)損失大、產(chǎn)品單一且附加值低、產(chǎn)業(yè)鏈短等諸多問題，嚴(yán)重阻礙了香椿產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[13]。基于此，項(xiàng)目組以香椿嫩芽為原料，利用紅茶發(fā)酵工藝制備香椿發(fā)酵茶[14]，不僅保留了香椿的淡香味道，消除了香椿中較為刺激的含硫類物質(zhì)的味道，而且通過適度的萎凋與發(fā)酵，激發(fā)鮮葉中酶活，促使鮮葉中大分子營養(yǎng)物質(zhì)被降解為可吸收的小分子，茶水中營養(yǎng)物豐富，口感醇厚甜爽。為了較全面系統(tǒng)地研究不同采收期香椿茶發(fā)酵前后品質(zhì)的變化情況，選取4、5、6月香椿嫩芽為材料制備香椿發(fā)酵茶，對(duì)不同采收期香椿茶發(fā)酵前后6 個(gè)樣品中主要活性成分、抗氧化活性、降糖活性及揮發(fā)性成分的變化規(guī)律進(jìn)行分析研究，以期為香椿發(fā)酵茶的開發(fā)、質(zhì)量控制及采收時(shí)期提供理論依據(jù)，同時(shí)為香椿的開發(fā)應(yīng)用及產(chǎn)業(yè)化發(fā)展提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

香椿嫩芽系2018年4～6月份采自河南省登封市三一香椿示范基地，采收日期分別為4月10日、5月10日、6月10日。將樣品分為2 組，并在采收當(dāng)天進(jìn)行處理。一組用于制備發(fā)酵樣品，將采摘的新鮮香椿嫩芽按照本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有的香椿紅茶發(fā)酵技術(shù)制備香椿發(fā)酵茶。制作工藝：原料選擇→清洗→萎凋→揉捻→發(fā)酵→毛火初烘→足火烘干→攤涼→包裝。另一組用于制備未發(fā)酵樣品，將采摘的新鮮香椿嫩芽40 ℃烘箱烘干，水分質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制在8%以下。將2 組樣品粉碎后置于干燥器中備用，使用前測(cè)定粉末的含水量。

標(biāo)準(zhǔn)品α-葡萄糖苷酶、4-硝基苯-α-D-吡喃葡萄糖苷（4-nitrophenyl-α-D-glucopyranoside，pNPG） 美國Sigma公司；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH） 東京化成工業(yè)株式會(huì)社；蘆丁、人參皂苷、咖啡堿、L-茶氨酸（均為優(yōu)級(jí)純） 北京索萊寶生物科技有限公司；葡萄糖（分析純） 天津市化學(xué)試劑六廠三分廠；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品 天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；其他試劑均為國產(chǎn)分析純；水為去離子水。

1.2 儀器與設(shè)備

BL-250 A型高速多功能粉碎機(jī) 浙江省永康市青松五金廠；DGG-9140型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司；SB-5200 DTD超聲波清洗機(jī) 寧波新芝生物科技股份有限公司；ME204E型電子天平 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；GENESYS 10S型UVVIS紫外分光光度計(jì) 美國Thermo公司；H1850R型高速冷凍離心機(jī) 湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器開發(fā)有限公司；MA150賽多利斯紅外水分測(cè)定儀 上海全扶實(shí)業(yè)有限公司；7890A-5975C氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀、HP-5MS毛細(xì)管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）、頂空固相微萃取裝置（包括手持式手柄，50/30 μm DVB/CAR/PDMS，15 mL頂空瓶） 美國安捷倫公司。

1.3 方法

1.3.1 活性成分提取

準(zhǔn)確稱取3.0 g樣品粉末置于250 mL錐形瓶中，加入100 mL沸水混合均勻，于100 ℃恒溫水浴鍋中浸泡提取30 min，收集上清液，殘?jiān)僭谙嗤瑮l件下提取2 次。最后合并所有上清液，減壓濃縮后用蒸餾水定容至50 mL，4 ℃貯藏備用。使用時(shí)以相應(yīng)溶劑稀釋至合適質(zhì)量濃度。

1.3.2 活性物質(zhì)指標(biāo)測(cè)定

總黃酮含量測(cè)定：參照Al(NO3)3-NaNO2-NaOH分光光度法[15]；多糖含量測(cè)定：參考硫酸-苯酚顯色法[16]；總皂苷含量測(cè)定：參照香草醛-冰醋酸比色法[16]；茶多酚含量測(cè)定：參照GB/T 8313—2008《茶葉中茶多酚和兒茶素類含量的檢測(cè)方法》[17]中福林-酚比色法；游離氨基酸含量測(cè)定：參照GB/T 8314—2013《茶 游離氨基酸總量的測(cè)定》[18]中水合茚三酮比色法；咖啡堿含量測(cè)定：參照GB/T 8312—2013《茶 咖啡堿測(cè)定》[19]中紫外分光光度法；茶色素含量測(cè)定：參考紫外分光光度法[20]。

1.3.3 DPPH自由基清除率的測(cè)定

稱取7.896 mg DPPH，用無水乙醇定容到100 mL，即配成0.20 mmol/L的DPPH醇溶液，4 ℃冰箱避光保存。樣品提取液配制成1 250.00 μg/mL的母液，再梯度稀釋成1 250.00、625.00、312.50、156.25、78.13、39.06、19.53、9.77、4.88 μg/mL。分別取2 mL稀釋適當(dāng)濃度的樣品提取液，再加入2 mL 0.20 mmol/L的DPPH醇溶液，將其充分混勻后避光放置30 min，波長517 nm處測(cè)試不同濃度樣品的吸光度，平行測(cè)定3 次[21]。DPPH自由基清除率按式（1）計(jì)算。

式中：A1為樣品提取液吸光度；A2為無水乙醇代替DPPH醇溶液的對(duì)照實(shí)驗(yàn)吸光度；A0為蒸餾水代替樣品提取液或VC的空白實(shí)驗(yàn)吸光度。

1.3.4α-葡萄糖苷酶活性抑制能力

以pNPG為反應(yīng)底物，經(jīng)α-葡萄糖苷酶水解α-1,4-葡萄糖苷鍵后釋放出對(duì)硝基苯酚，在波長410 nm處檢測(cè)黃色對(duì)硝基苯酚的生成量作為酶活力大小的判定標(biāo)準(zhǔn)[22]。樣品提取液配制成5.00 mg/mL的母液，再稀釋成5.00、4.00 、3.00、2.00、1.00、0.20、0.10、0.05 mg/mL。

向5 mL試管中依次加入0.10 mol/L的磷酸鉀緩沖液（pH 6.8）、不同質(zhì)量濃度的樣品提取液和α-葡萄糖苷酶（1 U/mL）后，37 ℃水浴加熱20 min。然后加入pNPG溶液（2.50 mmol/L）作為反應(yīng)底物以啟動(dòng)反應(yīng)，于37 ℃水浴條件下反應(yīng)30 min。最后加入610 μL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)，于波長410 nm處測(cè)定各組OD值，每組實(shí)驗(yàn)平行測(cè)定3 次。實(shí)驗(yàn)各組物質(zhì)加入量如表1所示。

表1 pNPG法測(cè)定α-葡萄糖苷酶活力方法Table 1 Preparation of reaction systems used for measurement of α-glucosidase activity by pNPG method

不同濃度樣品提取液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制能力按式（2）計(jì)算：

式中：Ai為樣品實(shí)驗(yàn)組的吸光度；Aj為樣品空白組的吸光度；A0為對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的吸光度；A1為對(duì)照空白組的吸光度。

1.3.5 揮發(fā)性成分分析

頂空固相微萃?。簻?zhǔn)確稱取0.50 g樣品于15 mL頂空瓶中，密封后于40 ℃水浴中平衡15 min，插入50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取頭，萃取30 min后取出萃取頭，插入GC-MS進(jìn)樣口解吸5 min。

G C 條件： H P - 5 M S 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初溫40 ℃，保持3 min，以5 ℃/min的速率升溫至150 ℃，保持2 min，以8 ℃/min的速率升溫至230 ℃，保持5 min結(jié)束；進(jìn)樣口溫度250 ℃；載氣高純氦氣；無分流比，流速1.0 mL/min。

MS條件：電子電離源；四極桿溫度150 ℃；離子源溫度230 ℃；傳輸線溫度250 ℃；電子能力70 eV；質(zhì)量掃描范圍40～800 u；檢索圖庫為NIST08.LIB。

定性和定量：采用頂空固相微萃取GC-MS聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行檢索分析，檢索圖譜與隨機(jī)Xcalibur工作站NIST08.LIB標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜庫相匹配，并與參考文獻(xiàn)中相關(guān)化合物的保留指數(shù)進(jìn)行比對(duì)分析；只記錄相似度大于80%的揮發(fā)性物質(zhì)，采用峰面積歸一法計(jì)算各組分的相對(duì)含量[23-24]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果與分析

2.1 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后活性成分分析

表2 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后活性成分比較Table 2 Bioactive components of fermented and unfermented T. sinensis tea at different harvest periods

多糖和游離氨基酸是茶湯滋味的重要化學(xué)成分，分別提供甜味和鮮味；總黃酮、皂苷、茶多酚是茶葉中具有保健功能的主要成分；咖啡堿是茶葉中的重要代謝產(chǎn)物，有利于提高茶湯整體的鮮爽度；茶色素主要包含茶黃素、茶紅素、茶褐素，是構(gòu)成茶湯“亮、紅、褐”的主要成分。由表1可知，6 個(gè)樣品中總黃酮、多糖、皂苷、茶多酚、游離氨基酸、咖啡堿和茶色素的含量范圍分別為12.23～23.11 mg/g、87.43～123.78 mg/g、12.16%～14.33%、0.89%～2.33%、9.21%～11.99%、3.21%～4.31%、7.13%～8.63%。隨著采收期的延長，香椿茶發(fā)酵前后樣品中總黃酮、多糖、茶多酚和茶色素的含量逐漸增加，皂苷、游離氨基酸和咖啡堿含量呈波動(dòng)變化趨勢(shì)。與劉常金[25]和Wang Kaijin[26]等研究結(jié)果中黃酮和皂苷的變化趨勢(shì)一致，但含量具有一定的差異，這可能是因?yàn)樗x的香椿嫩芽品種和生長環(huán)境不同所致。不同采收期香椿茶樣品經(jīng)發(fā)酵處理后，總黃酮、多糖、皂苷、茶多酚和游離氨基酸含量比發(fā)酵前逐漸減少，咖啡堿和茶色素含量逐漸增加。這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中，代謝作用旺盛，多糖類物質(zhì)被逐漸消耗，總黃酮、皂苷、茶多酚和游離氨基酸等物質(zhì)在濕熱作用下發(fā)生氧化、降解和轉(zhuǎn)化所致，同時(shí)促進(jìn)了咖啡堿的合成[27]。茶色素是茶多酚的主要水溶性氧化產(chǎn)物，在發(fā)酵過程中，香椿茶中茶多酚在酶的作用下，氧化成鄰醌，再縮聚成茶黃素、茶紅素等物質(zhì)，同時(shí)茶黃素、茶紅素又進(jìn)一步氧化聚合成茶褐素，最終使茶色素含量不斷積累[28]。

2.2 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后DPPH自由基清除能力分析

圖1 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后樣品提取液的DPPH自由基清除能力Fig. 1 DPPH radical scavenging activity of extracts from fermented and unfermented T. sinensis tea at different harvest periods

表3 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后樣品提取液的抗氧化能力和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力的IC50值Table 3 IC50 values of extracts from fermented and unfermented T. sinensis tea at different harvest periods for DPPH radical scavenging and α-glucosidase inhibition

如圖1、表3所示。當(dāng)樣品提取液質(zhì)量濃度從4.88 μg/mL增加至312.50 μg/mL時(shí)，所有樣品的DPPH自由基清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)樣品提取液質(zhì)量濃度大于312.50 μg/mL時(shí)，清除能力趨于平緩，且當(dāng)清除能力低于80%時(shí)，樣品的DPPH自由基清除能力表現(xiàn)出明顯的量效關(guān)系。不同采收期發(fā)酵后香椿茶IC50值均高于未發(fā)酵，未發(fā)酵香椿茶對(duì)DPPH自由基清除能力略大于發(fā)酵后的香椿茶。香椿茶發(fā)酵前后DPPH自由基清除能力的IC50值大小均為6月＜5月＜4月，DPPH自由基清除能力隨采收時(shí)間的延長而逐漸增加。楊清[29]研究發(fā)現(xiàn)桑葉對(duì)DPPH自由基清除能力略高于桑紅茶和新型桑紅茶，劉佳奇等[30]研究也發(fā)現(xiàn)乳酸菌發(fā)酵后紅茶飲料對(duì)DPPH自由基、2,2’-聯(lián)氮-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二銨鹽陽離子自由基、羥自由基清除能力比發(fā)酵前略有降低，這可能是因?yàn)榘l(fā)酵過程中，起到主要抗氧化作用的多酚類物質(zhì)被部分氧化為某些色素物質(zhì)。

2.3 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用分析

圖2 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后樣品提取液的α-葡萄糖苷酶活性抑制作用Fig. 2 α-Glucosidase inhibitory activity of extracts from fermented and unfermented T. sinensis tea at different harvest periods

如圖2、表3所示，隨著樣品提取液質(zhì)量濃度的增加，4月香椿茶發(fā)酵前后對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用先增強(qiáng)后趨于平穩(wěn)。5月和6月香椿茶發(fā)酵前后對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用表現(xiàn)為：當(dāng)樣品提取液質(zhì)量濃度小于0.20 mg/mL時(shí)，此時(shí)酶促反應(yīng)處于一級(jí)反應(yīng)階段，抑制率與抑制濃度呈明顯的量效關(guān)系；當(dāng)樣品提取液質(zhì)量濃度在0.20～3.00 mg/mL范圍內(nèi)，酶促反應(yīng)處于混合反應(yīng)階段；當(dāng)樣品提取液質(zhì)量濃度大于3.00 mg/mL時(shí)，酶促反應(yīng)處于零級(jí)反應(yīng)階段，抑制率不再隨著樣品提取液質(zhì)量濃度的增加而上升，趨于平穩(wěn)。6 個(gè)樣品提取液對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的IC50值由小到大為6月發(fā)酵＜6月未發(fā)酵＜5月發(fā)酵＜5月未發(fā)酵＜4月發(fā)酵＜4月未發(fā)酵，可以看出香椿茶發(fā)酵前后對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制能力均為6月＞5月＞4月，不同月份香椿發(fā)酵茶對(duì)α-葡萄糖苷酶活性抑制能力略高于未發(fā)酵。

2.4 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后各指標(biāo)相關(guān)性分析

表4 6 種樣品中活性物質(zhì)與其DPPH自由基清除能力和α-葡萄糖苷酶活性抑制作用的相關(guān)性分析Table 4 Correlation coefficients between bioactive substances of six tea samples and their DPPH radical-scavenging and α-glucosidase inhibitory activity

如表4所示，DPPH自由基清除能力與總黃酮含量呈極顯著正相關(guān)（P＜0.01），與茶多酚含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與咖啡堿含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）；而α-葡萄糖苷酶活性抑制能力與黃酮含量呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），與咖啡堿含量呈顯著負(fù)相關(guān)（P＜0.05）。由此可看出，樣品中總黃酮和茶多酚含量與DPPH自由基清除能力之間、總黃酮含量與α-葡萄糖苷酶活性抑制能力之間可能具備一定的量效關(guān)系，是主要的抗氧化活性物質(zhì)和降糖活性物質(zhì)，而其他測(cè)定物質(zhì)則無顯著貢獻(xiàn)。由相關(guān)性分析結(jié)果可推測(cè)，樣品中抗氧化和降糖活性物質(zhì)來源較復(fù)雜，除總皂苷、總黃酮、總多酚外，有機(jī)酸、維生素等其他活性物質(zhì)也可能通過直接猝滅或抑制自由基、提供質(zhì)子或電子、抑制α-葡萄糖苷酶活性等方式，共同發(fā)揮抗氧化和降糖效應(yīng)[31-32]。

2.5 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后的揮發(fā)性成分比較分析

2.5.1 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后揮發(fā)性成分種類及相對(duì)含量

表5 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后揮發(fā)性成分的GC-MS分析結(jié)果Table 5 GC-MS analysis results of volatile components of fermented and unfermented T. sinensis tea at different harvest periods

續(xù)表5

續(xù)表5

表6 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后揮發(fā)性成分種類及相對(duì)含量Table 6 Types and relative contents of volatile components of fermented and unfermented T. sinensis tea at different harvest periods

由表5和表6可知，不同采收期香椿茶發(fā)酵前后6 個(gè)樣品中共檢測(cè)鑒別出醛類、含硫類、醇類、酮類、萜烯類、烯類氧化物和其他類7 類90 種揮發(fā)性成分，其中4月、5月、6月香椿茶發(fā)酵前后分別檢出42 種和49 種、47 種和52 種、50 種和51 種。

萜烯類是新鮮香椿揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)中含量最高和種類最多的一類化合物，對(duì)香椿風(fēng)味起著重要作用。6 個(gè)樣品中萜烯類物質(zhì)的相對(duì)含量最高（77.46%～84.76%），且多為倍半萜烯（C15H24），相對(duì)含量最高的為石竹烯（31.23%～37.19%）。檢測(cè)到萜烯類化和物共有16 種，分別為δ-欖香烯、π-蓽澄茄油烯、古巴烯、1R,3Z,9S-2,6,10,10-四甲基雙環(huán)[7.2.0]十一-2,6-二烯、β-欖香烯、[1R-(1R*,4Z,9S*)]-4,11,11-三甲基-8-亞甲基-二環(huán)[7.2.0]4-十一烯、雪松烯、石竹烯、β-蓽澄茄油烯、π-欖香烯、α-愈創(chuàng)木烯、Z,Z,Z-1,5,9,9-四甲基-1,4,7-環(huán)十一碳三烯、(-)-g-杜松烯、β-蛇床烯、β-馬攬烯、π-愈創(chuàng)木烯。隨著采收期的延長萜烯類物質(zhì)的含量呈上升趨勢(shì)，有些物質(zhì)僅出現(xiàn)在特定的采收期樣品中，這說明不同采收期可能對(duì)香椿茶揮發(fā)性成分存在一定影響。研究表明萜烯類化合物大多具有花香、甜香及水果香等比較柔和的氣味，可以起到中和噻吩類物質(zhì)刺激性氣味的作用[33]。

含硫類物質(zhì)一般具有較低的感知閾值和較強(qiáng)的氣味，呈現(xiàn)出類似于大蒜、韭菜、洋蔥等刺激性氣味，對(duì)香椿的獨(dú)特風(fēng)味起著至關(guān)重要的作用，也是目前新鮮香椿中公認(rèn)的重要揮發(fā)性物質(zhì)[34]。6 個(gè)樣品檢測(cè)到的含硫類物質(zhì)只有2,4-二甲基噻吩和1-(乙?guī)€基)-2-甲基-1-丙烯2 種，相對(duì)含量僅在1%左右。含硫類物質(zhì)隨著采收期的延長逐漸增加，但經(jīng)發(fā)酵后卻逐漸減少，這可能是因?yàn)楦稍锖桶l(fā)酵處理使揮發(fā)性成分發(fā)生變化，含硫類物質(zhì)的減少使樣品的香氣更加柔和協(xié)調(diào)[35]。

醛酮類物質(zhì)也是構(gòu)成香椿主要香氣特征的一大類物質(zhì)，其含量占總揮發(fā)性成分的8%左右。6 個(gè)樣品中共同檢出己醛、2,6,6-三甲基-1-環(huán)己烯-1-甲醛、3,5-辛二烯-2-酮、β-紫羅蘭酮、4,7,7a-三甲基-5,6,7,7a-四氫-2-(4H)-苯并呋喃酮5 種物質(zhì)，其中己醛含量最高，占比1.05%～3.27%，具有青草氣及蘋果香味。隨著采收期的延長，醛酮類物質(zhì)相對(duì)含量逐漸減少。發(fā)酵后4月和6月醛酮類物質(zhì)相對(duì)含量增加，5月卻減少。

酯醇類化合物也是香椿揮發(fā)性成分的重要組成部分，大多具有不同的果香、花香、清香等香氣味道，且閾值一般比較低，對(duì)新鮮香椿的刺激性氣味起到一定的中和作用。6 個(gè)樣品中醇類物質(zhì)相對(duì)含量隨著采收期的延長而逐漸減少，經(jīng)發(fā)酵處理后也逐漸減少。僅在發(fā)酵后的3 個(gè)香椿茶樣品中檢測(cè)出橙花叔醇乙酸酯這一種酯類物質(zhì)，相對(duì)含量為0.02%～0.21%。

烯類氧化物是萜烯類發(fā)生氧化反應(yīng)得到的一類物質(zhì)，具有部分萜烯類物質(zhì)的性質(zhì)。發(fā)酵之后烯類氧化物含量逐漸減少，這可能是因?yàn)樵诎l(fā)酵過程中發(fā)生反應(yīng)轉(zhuǎn)化為萜烯類物質(zhì)，使發(fā)酵后萜烯類物質(zhì)增加。

2.5.2 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后揮發(fā)性成分PCA

表7 PC的特征值及方差貢獻(xiàn)率Table 7 Eigenvalues and of the first three principal components and their contribution rates tot total variance

圖3 不同采收期香椿茶發(fā)酵前后樣品載荷圖（A、B）和得分圖（C、D）Fig. 3 PCA Loading plots and score plots for fermented and unfermented T. sinensis tea at different harvest periods

以不同采收期香椿茶發(fā)酵前后樣品中醛類、含硫類、醇類、酮類、萜烯類、烯類氧化物和其他類7 類揮發(fā)性物質(zhì)的相對(duì)含量為指標(biāo)，用SPSS進(jìn)行PCA，得到各PC的特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率。提取特征值大于1的PC，結(jié)果如表7所示。由表7可知，分析得到3 個(gè)PC，且這3 個(gè)PC的累計(jì)方差貢獻(xiàn)率達(dá)到88.01%，表示能夠解釋不同采收期香椿茶發(fā)酵前后香氣大部分的成分信息，因此，選擇這3 個(gè)PC進(jìn)行風(fēng)味品質(zhì)分析。

如圖3A、B所示，醛類作為不同采收期香椿茶發(fā)酵前后樣品的主要揮發(fā)性物質(zhì)與PC1高度正相關(guān)（載荷系數(shù)為0.882），萜烯類與PC1呈高度負(fù)相關(guān)（載荷系數(shù)為-0.756）；PC2中載荷最高的正相關(guān)揮發(fā)性物質(zhì)為醇類和烯類氧化物（載荷系數(shù)＞0.8）；PC3中載荷最高的正相關(guān)為含硫類物質(zhì)，但載荷系數(shù)僅為0.691。上述結(jié)果說明醛類、萜烯類、醇類以及烯類氧化物是不同采收期香椿茶發(fā)酵前后樣品中含量發(fā)生顯著變化的揮發(fā)性物質(zhì)。

如圖3C、D所示，PC1得分最高的為4月發(fā)酵組，影響它的主要揮發(fā)性成分為醛類，它可能決定了4月發(fā)酵樣品的風(fēng)味特征；PC2得分較高的為4月未發(fā)酵組和5月發(fā)酵組，PC2可以將它們與其他4 種樣品完全區(qū)分開，因此醇類和烯類氧化物可能決定了兩者的風(fēng)味特征；PC3得分最高的為5月未發(fā)酵組。4月未發(fā)酵、6月發(fā)酵、6月未發(fā)酵樣品在圖3C、D中均分布于第1象限、第4象限、第3象限；4月發(fā)酵、5月未發(fā)酵、5月發(fā)酵樣品在圖3C、D中分布在不同的象限，表明不同采收期香椿茶發(fā)酵前后樣品在2 個(gè)圖中位于不同的象限，PCA可以對(duì)其進(jìn)行有效區(qū)分。

3 結(jié) 論

本研究采用4月、5月、6月的香椿嫩芽制備香椿發(fā)酵茶，對(duì)比分析了不同采收期香椿茶發(fā)酵前后6 個(gè)樣品的主要活性成分、抗氧化活性、降糖活性及揮發(fā)性成分的變化規(guī)律，根據(jù)此研究結(jié)果為香椿發(fā)酵茶采收期的確定和發(fā)酵前后品質(zhì)的變化提供判定依據(jù)，為香椿發(fā)酵茶的開發(fā)、質(zhì)量控制及后期產(chǎn)品加工提供參考。

6 個(gè)樣品的主要活性成分、抗氧化活性和降糖活性有顯著性差異。隨著采收期的延長，香椿茶發(fā)酵前后樣品中總黃酮、多糖、茶多酚和茶色素的含量逐漸增加，皂苷、游離氨基酸和咖啡堿含量呈波動(dòng)變化趨勢(shì)；DPPH自由基清除能力和α-葡萄糖苷酶活性抑制能力逐漸減弱。不同采收期香椿茶樣品經(jīng)發(fā)酵處理后，總黃酮、多糖、皂苷、茶多酚和游離氨基酸含量逐漸減少，咖啡堿和茶色素含量逐漸增加；DPPH自由基清除能力逐漸減弱，α-葡萄糖苷酶活性抑制能力逐漸增強(qiáng)。通過相關(guān)性分析，6 個(gè)樣品中主要抗氧化和降糖活性物質(zhì)均為總黃酮。

利用頂空固相微萃取GC-MS檢測(cè)6 個(gè)樣品，結(jié)果發(fā)現(xiàn)6 個(gè)樣品中共檢測(cè)鑒別出7 類90 種揮發(fā)性成分，其中4月、5月、6月香椿茶發(fā)酵前后分別檢出42 種和49 種、47 種和52 種、50 種和51 種，萜烯類物質(zhì)數(shù)量（20～26 種）和相對(duì)含量（77.46%～84.79%）明顯高于其余種類。通過PCA，不同采收期香椿茶發(fā)酵前后6 個(gè)樣品中含量發(fā)生顯著變化的揮發(fā)性物質(zhì)是醛類、萜烯類、醇類以及烯類氧化物，得分較高的是4月和5月香椿茶發(fā)酵前后的4 個(gè)樣品，表明PCA能較好地反映不同樣品的差異性。

綜上所述，采用5月香椿嫩芽制作的香椿發(fā)酵茶品質(zhì)較好。