廣譜拮抗菌株的篩選誘變及抗菌物質(zhì)分離鑒定

高兆建，王秋芬，丁飛鴻，許 祥，趙宜峰，焦 魏，陳 騰,*

（1.徐州工程學院食品（生物）工程學院，江蘇 徐州 221018；2.海濱林場，河北 秦皇島 066100；3.長江桂柳食品睢寧有限公司，江蘇 徐州 221000；4.邳州市金大地肥料有限公司，江蘇 徐州 221300）

近年來，化學農(nóng)藥和傳統(tǒng)抗生素及防腐劑過量使用帶來的食品安全、環(huán)境問題以及細菌耐藥性問題越來越受關注[1]。對病原菌具有顯著抗性的脂肽類抗生素成為人們研究的焦點。芽孢桿菌屬的細菌自然界中分布廣泛，具有極強的抗逆能力，生長代謝過程中能產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)[2]，如抗菌蛋白、抗菌脂肽和揮發(fā)性抑菌物質(zhì)等，其中部分環(huán)脂肽類抑菌物質(zhì)具有較好的抗菌活性，它是芽孢桿菌通過非核糖體合成途徑產(chǎn)生的具有抗菌作用的脂肽類化合物，主要包括表面活性素（Surfactin），伊枯草菌素（Iturin）和芬芥素（Fengycin）3大類[3]。這些脂肽類物質(zhì)由脂肪酸鏈和肽環(huán)兩部分構成，7 個（Surfactin和Iturin）或10 個（Fengycin）α-氨基酸鏈接到一個獨特的β-氨基（Iturin）或β-羥基（Surfactin，F(xiàn)engycin）脂肪酸鏈上[3]。這種脂肪酸鏈的長度不一，Surfactin為C13～C16，Iturin為C14～C17，F(xiàn)engycin為C14～C18[4]。其特殊的化學結構賦予這些脂肽類抗菌物質(zhì)具備抗細菌、抗真菌[5]、抗腫瘤、抗病毒[6]、抗支原體、溶血栓等功能，其廣譜、高效、低毒、耐熱、耐酸、對蛋白酶穩(wěn)定[7]、不易產(chǎn)生耐藥性、易被生物降解等優(yōu)勢使得其在農(nóng)業(yè)[8]、食品[9]、醫(yī)藥、化妝品、環(huán)保[10]、畜牧業(yè)等[11]領域備受關注[12-13]。因此，繼續(xù)挖掘新型高效的脂肽類物質(zhì)，使其充分發(fā)揮其多元化的功能，具有重要的科學意義和實際應用價值。

目前，很多研究者致力于芽孢桿菌產(chǎn)生脂肽的研究，已經(jīng)從植物、土壤、海洋等各種環(huán)境中連續(xù)篩選出新的產(chǎn)脂肽菌株[14]，并從其發(fā)酵液中分離出不同結構類型的脂肽化合物。Aktuganov等[15]從愛媛類芽孢桿菌IB-X-b發(fā)酵液中鑒定了1 種Fengycin同系物，對麥根腐德氏霉（Drechslera sorokiniana）具有很強的抑菌作用；Cao Yun等[16]發(fā)現(xiàn)生防枯草芽孢桿菌SQR 9對抑制尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum）導致的黃瓜枯萎病有顯著效果，并通過高效液相色譜和質(zhì)譜技術從其發(fā)酵液中檢測到Fengycin和Bacillomycin。Hentati等[17]研究發(fā)現(xiàn)海洋細菌同溫層芽孢桿菌（Bacillus stratosphericus）FLU5在對石油污染土壤修復中具有重要作用，采用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight-tandem mass spectrometry，MALDI-TOF-MS/MS）技術確定了菌株分泌的Surfactin的存在。石舉然等[9]從野生蜂蜜中篩選出1 株產(chǎn)廣譜抗菌活性物質(zhì)的芽孢桿菌LZ-5，利用柱層析及高效液相色譜等技術確定LZ-5產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)為IturinA2、IturinA3和IturinA6的混合物。

研究表明，不同種屬芽孢桿菌分泌的抗菌脂肽類別有顯著不同，其抗逆性及生物學功能也會有很大差異[18]。而且，即使是同一類菌株，發(fā)酵條件不同，也可能會產(chǎn)生不同結構的環(huán)脂肽變異體，進而發(fā)揮不同的生物學功能。有關地衣芽孢桿菌所產(chǎn)抗菌物質(zhì)的研究也有報道，但抗菌特性與本研究有顯著差異。本研究從自然界中分離1 株廣譜抗性的菌株，進一步通過物理化學復合誘變選育提高抗菌物質(zhì)產(chǎn)量，并從發(fā)酵液中分離純化抗菌物質(zhì)，通過質(zhì)譜分析其可能的與抑菌活性有關的脂肽類化合物組成及成分，以期為抗菌脂肽的研究和應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品與菌種

本研究篩選土樣取自江蘇省徐州市云龍區(qū)徐州工程學院周邊菜地及泉山區(qū)云龍山。

供試菌株為本實驗室從土樣中自行分離的菌株；用于檢測抑菌活性的參考菌株部分購自中國普通微生物菌種保藏管理中心，部分由徐州工程學院江蘇省重點建設實驗室保存，菌種如下：大腸桿菌（Escherichia coliCGMCC 1.1850）、傷寒沙門氏菌（Salmonella typhi）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureusCGMCC 1.128）、志賀氏菌（Shigella Castellani，本實驗室保存）和銅綠假單胞和芽孢桿菌（Pseudomonas aeruginosaCGMCC 1.1785）、蠟樣芽孢桿菌（B. cereus，本實驗室保存）、枯草芽孢桿菌（B. subtilis，本實驗室保存）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiaeCGMCC 2.3973）、尖孢鐮刀菌（Fusarium cusarium，本實驗室保存）、深綠木霉（Trichoderma cerevisiae，本實驗室保存）、黑曲霉（Aspergillus nigerCGMCC 3.6469）。

1.1.2 培養(yǎng)基

營養(yǎng)肉湯（nutrient broth，NB）培養(yǎng)基：蛋白胨1 g/100 mL，牛肉膏0.5 g/100 mL，氯化鈉0.5 g/100 mL，瓊脂粉1.5 g/100 mL，pH 7.2～7.4，121 ℃滅菌15 min，用于指示菌培養(yǎng)。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖4.0 g/1 0 0 m L，牛肉膏0.5%，酵母提取物0.5 g/1 0 0 m L，蛋白胨1.5 g/100 mL，NaH2PO4·2H2O0.02 g/100 mL，Na2HPO4· 2H2O0.05g / 100 mL ，Mg2SO4·7H2O 0.05 g/100 mL，CaCl20.02 g/100 mL，MnSO40.02 g/100 mL，pH 7.4，121 ℃滅菌15 min。

1.2 儀器與設備

Sigma3k15型冷凍離心機 德國Sigma公司；GeneAmp 9700型聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國應用生物系統(tǒng)公司；JS-680D型凝膠成像系統(tǒng) 上海培清科技有限公司；1100型高效液相色譜儀 美國安捷倫科技有限公司；QexactiveOrbitrap型高分辨質(zhì)譜儀 美國Thermo Fisher公司；CascadaTMAN型超純水系統(tǒng) 美國PALL公司；UV-2450紫外-可見光分光光度計 日本島津公司。

1.3 方法

1.3.1 菌株篩選

將土樣懸濁液80 ℃水浴處理20 min，系列稀釋并于NB平板涂布，37 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，將單菌落轉(zhuǎn)接于另一塊平板。培養(yǎng)2～3 d后的培養(yǎng)皿，在皿蓋中倒入1 mL氯仿，倒扣于超凈工作臺熏蒸50 min，倒掉多余氯仿并加稀釋5 倍的指示菌菌液1 mL，平板全部浸潤后倒掉多余菌液，晾干平皿，室溫培養(yǎng)12 h后，觀察并記錄抑菌效果。

初篩得到菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)3 d。發(fā)酵液經(jīng)4 ℃、12 000 r/min離心5 min得發(fā)酵上清液。分別用大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、黑曲霉為指示菌進行抑菌活性復篩，選擇抑菌譜最廣、抑菌圈最大的菌株進一步研究。

1.3.2 拮抗菌株分類鑒定

參照文獻[19]對拮抗菌株進行形態(tài)特征觀察和生理生化實驗。

拮抗菌株16S rDNA序列測定與分析：提取總DNA進行16S rDNA序列PCR擴增。擴增的引物設計如下：上游引物5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’，下游引物5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’。PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性45 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸90 s，30 次循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。引物的合成和PCR產(chǎn)物的測序由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。測序結果運用BLAST軟件進行序列比對，選取各不同屬的一些代表菌株的16S rDNA序列，用ClustalX1.83與MEGA5.1軟件，采用NJ（Neighbor-Joining）法構建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 脂肽粗提物抗菌譜的測定

固體培養(yǎng)基打孔瓊脂擴散法測定發(fā)酵濾液抑菌活性。固體培養(yǎng)基滅菌后倒平板，待其凝固后，加入200 μL活化培養(yǎng)好的指示菌菌液，涂布均勻并晾干后，用無菌打孔器打孔，孔中加入100～200 μL發(fā)酵上清液，正面放置，培養(yǎng)1～3 d，觀察抑菌效果，并用游標卡尺測量抑菌圈直徑，以無菌水作陰性對照。其中細菌選用NB固體培養(yǎng)基，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，真菌選用馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養(yǎng)基， 28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，然后觀察抑菌圈的有無，并采用十字交叉法測量抑菌圈直徑，各處理重復 3 次。

1.3.4 菌株誘變

紫外線-硫酸二乙酯（diethyl sulfate，DES）復合誘變：取對數(shù)生長期菌液10 000 r/min離心5 min后，沉淀用生理鹽水稀釋成濃度為108個/mL的菌懸液。將裝有5 mL菌懸液的無菌平皿置于磁力攪拌器上，在實驗前打開紫外燈預熱10 min，在距離15 W紫外燈30 cm處進行誘變。分別照射6、9、15、30、45 s，每個照射時間各取0.1 mL處理后的菌液涂布于篩選平板上，30 ℃避光培養(yǎng)5 d，將致死率在95%以上平板上的菌株檢測抗菌活性。將活性高的菌株選為出發(fā)菌株，進一步采用DES化學法誘變。菌懸液加入到體積為25 mL的三角瓶中，再加入0.2 mL體積分數(shù)50%的DES溶液，振蕩不同時間，再加入0.5 mL 85%的硫代硫酸鈉溶液終止反應。取不同梯度的菌懸液稀釋涂布平板。37 ℃培養(yǎng)2～3 d。以金黃色葡萄球菌為指示菌，檢測菌株抑菌活性，選取抑菌活性最強的菌株。

遺傳穩(wěn)定性實驗：為分析突變菌的遺傳穩(wěn)定性，在固體板上活化菌，轉(zhuǎn)移到液體進行一級培養(yǎng)。連續(xù)轉(zhuǎn)移10 次，分別發(fā)酵培養(yǎng)48 h，然后分析比較突變株抑菌能力的遺傳穩(wěn)定性。

1.3.5 脂肽分離與分析

1.3.5.1 脂肽Sephadex G-10凝膠層析分離

采用酸沉淀法進行提取。誘變獲得的優(yōu)良菌株發(fā)酵液4 ℃、10 000 r/min離心10 min后，去除菌體，收集發(fā)酵上清液，用6 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH 2.0，輕微攪動，4 ℃靜置24 h后于10 000 r/min離心15 min，收集沉淀，加入甲醇后用1 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH 7.0，用甲醇抽提沉淀3 次，合并抽提液，于40～45 ℃減壓蒸發(fā)，得到固體粗提物。

用Sephadex G-10色譜柱對脂肽粗提物純化。10 mmol/L Tris-HCl緩沖液（pH 8.0）平衡層析柱，固體抗菌物質(zhì)粗提物緩沖溶液溶解后上Sephadex G-10柱（1.6 cm×100 cm），用相同緩沖液洗脫，流速為0.4 mL/min，自動收集器每管收集0.8 mL。將每管測定其對金黃色葡萄球菌的抑菌活性。

1.3.5.2 脂肽粗提物反相高效液相色譜純化與鑒定

將經(jīng)過Sephadex G-10收集到的有抑菌活性的洗脫液用半制備高效液相色譜系統(tǒng)進一步純化并檢測活性物質(zhì)的純度，以確保樣品的純度達到結構鑒定的要求。樣品上柱前經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，洗脫劑經(jīng)抽濾裝置脫氣。高效液相色譜條件：色譜柱Agilent XDB-C18柱；紫外檢測器；檢測波長215 nm；以體積分數(shù)5%～30%的乙腈線性梯度洗脫；柱溫25 ℃；流速0.5 mL/min。檢測收集管抗菌活性。

利用MALDI-TOF-MS對抑菌活性組分進行分析鑒定，α-氰基-4-羥基肉桂酸基質(zhì)溶解在含0.1%三氟乙酸的30%乙腈溶液中，采用正離子反射模式獲得譜圖。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

2 結果與分析

2.1 廣譜拮抗菌株的篩選

表1 篩選菌株發(fā)酵上清液抑菌譜Table 1 Antimicrobial spectrum of the fermentation supernatant of the screened strains

從土壤中共篩選出67 株具抑菌圈的菌株，其中抑菌活性強的菌株有8 株，結果如表1所示。7 種供試菌對沙門氏菌和金黃色葡萄球菌具有抑菌效果；6 種供試菌對枯草芽孢桿菌、蠟樣芽孢桿菌及大腸桿菌具有抑制作用；對銅綠假單胞菌及志賀氏菌可抑制的供試菌較少，僅3 種供試菌可對銅綠假單胞菌抑制；對釀酒酵母有抑制作用的有4 株，對霉菌黑曲霉和深綠木霉有抑制作用的菌株有7 株?？梢钥闯鼍闤F32與其他菌株的相比有顯著抑菌差異，對所選用的10 種指示菌都具有良好的抑制效果，菌株XF32發(fā)酵上清液對部分霉菌、酵母菌及細菌的抑菌情況如圖1所示。選擇菌株XF32進一步實驗。

圖1 菌株XF32抗菌物質(zhì)對真菌和細菌的抑菌活性Fig. 1 Antifungal and antibacterial activities of antibacterial substances produced by strain XF32

2.2 拮抗菌株鑒定

2.2.1 菌落形態(tài)及生理生化鑒定

圖2 地衣芽孢桿菌形態(tài)Fig. 2 Morphological characteristics of strain XF32

菌株XF32在NB固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)24 h后，菌落形態(tài)如圖2所示。菌落為圓形，乳白色，邊緣不整齊，且表面粗糙不透明、有皺褶，中間有突起，具有芽孢桿菌典型的生長特征。染色后顯微鏡下觀察，產(chǎn)芽孢，革蘭氏染色陽性，呈直桿狀，單個菌體，兩端鈍圓，芽孢橢圓中生。

表2 菌株XF32的生理生化特性Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain XF32

生理生化特征見表2。菌株XF32接觸酶陽性，VP陽性，厭氧生長，能使明膠液化。不能夠利用吲哚和阿拉伯糖醇。能夠利用蔗糖、葡萄糖和木糖產(chǎn)酸，利用葡萄糖產(chǎn)氣。能夠在pH 5.5和pH 9.0的條件下生長，耐受7%的鹽環(huán)境。

從菌株的形態(tài)以及生理生化特性看，本實驗中分離篩選的菌株XF32與文獻[19]中標準菌株的相關指標比較分析，可初步認為菌株XF32屬于芽孢桿菌屬的地衣芽孢桿菌（B. licheniformis）。

2.2.2 菌株的分子鑒定

圖3 基于16S rDNA序列的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequences of strain XF32

為了進一步確定XF32的種屬，經(jīng)16S rDNA分子生物學鑒定測序，菌株XF32 16S rDNA序列長1 452 bp，與GenBank中所有已測定的原核生物的16S rDNA序列進行比對，與之相似度達99%的菌株為地衣芽孢桿菌。選擇11 株相似性較高的標準菌株構建系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖3可見，XF32與地衣芽孢桿菌自然聚為一支。因此，結合形態(tài)及生理生化特征，XF32鑒定為地衣芽孢桿菌。

2.3 拮抗菌株誘變結果

表3 誘變后復篩結果Table 3 Re-screening results after mutagenesis

測定復合誘變后不同篩選菌株的抑菌情況，由表3可知，抑菌圈直徑在10～15 mm和15～20 mm區(qū)間內(nèi)占大多數(shù)，比例分別為30.15%和33.09%。突變菌株XF32-22抑菌圈直徑27.8 mm，比誘變前的菌株抑菌圈直徑提高了52.7%。說明菌株的誘變獲得了較好效果。進一步對突變株XF32-22生長及抑菌活性的遺傳穩(wěn)定性進行考察，如圖4所示。XF32-22連續(xù)傳代10 次，其抑菌圈直徑大小穩(wěn)定在19～22 mm，這與復篩的抑菌圈直徑大小一致。表明，XF32-22突變株具有較好的遺傳穩(wěn)定性。結合上述結果，紫外線-DES化學誘變的復合誘變方法在高產(chǎn)菌株的誘變選育中值得廣泛應用。

圖4 遺傳穩(wěn)定性結果Fig. 4 Genetic stability of mutants

2.4 脂肽分離純化

2.4.1 脂肽Sephadex G-10凝膠層析

圖5 Sephadex G-10分離抗菌物質(zhì)Fig. 5 Elution profile of antifungal substances on Sephadex G-10

地衣芽孢桿菌XF32-22發(fā)酵液抗菌粗提物經(jīng)Sephadex G-10洗脫，215 nm波長處紫外吸收檢測，出現(xiàn)4 個大的洗脫峰，分別表示為峰1～4。如圖5所示，對每支收集管檢測抗菌活性，結果顯示有抗菌活性的收集管主要集中在23～30號管，同吸收峰2相重疊。而其他吸收峰沒有檢測出抑菌性。將有活性收集管合并，進一步分離純化。

2.4.2 脂肽半制備高效液相色譜分析

圖6 地衣芽孢桿菌XF32-22抗菌物質(zhì)的半制備高效液相色譜分離Fig. 6 Semi-preparative RP-HPLC profile of antimicrobial substance produced by XF32-22

經(jīng)Sephadex G-10純化后的抑菌活性物質(zhì)再經(jīng)過半制備高效液相色譜純化，結果如圖6所示。經(jīng)半制備高效液相色譜分離后，得到多個組分峰，由此說明前期純化的抗菌物質(zhì)中含有較多的雜質(zhì)成分。通過對各洗脫峰的抑菌活性檢測發(fā)現(xiàn)，只有在出峰時間26 min的組分具有明顯的抑菌活性，說明經(jīng)過一系列的分離純化步驟，本研究已經(jīng)成功的獲得純度較高的抑菌活性物質(zhì)，將該組分收集后用于MALDI-TOF-MS鑒定。

2.4.3 抗菌物質(zhì)鑒定

芽孢桿菌的拮抗活性物質(zhì)主要為非核糖體途徑合成的脂肽類化合物。MALDI-TOF-MS分析廣泛應用于芽孢桿菌脂肽類化合物的檢測。采用MALDI-TOF-MS對有抑菌活性的收集峰組分進行分析，一級質(zhì)譜顯示，菌株XF32-22在m/z1 477.36、1 491.52和1 505.67處有離子峰（簇）出現(xiàn)（圖7），這3 個離子峰均對應于Fengycin的質(zhì)量。3 個離子峰的相對分子質(zhì)量依次相差14，即恰好1 個CH2，推測其屬脂肪酸鏈上差1 個亞甲基所導致，該物質(zhì)與已報道的脂肽類化合物Fengycin的相對分子質(zhì)量一致。目前，關于Fengycin化合物的鑒定主要是依據(jù)其質(zhì)譜分子峰。綜上所述，質(zhì)譜分析證明抗菌物質(zhì)主峰中主要成分為脂肽類化合物Fengycin，且含量較純，根據(jù)峰面積可計算出純度達90%以上。同時也證明了該脂肽粗提物分離后的活性較高產(chǎn)物主要成分為Fengycin。由此推斷分離篩選的具有廣譜抗菌活性的XF32菌株拮抗活性可能與其脂肽化合物的合成與分泌有關。

圖7 地衣芽孢桿菌XF32-22脂肽類化合物的MALDI-TOF-MS分析Fig. 7 MALDI-TOF-MS of lipopeptides produced by strain XF32-22

3 討 論

芽孢桿菌是一類產(chǎn)生抗菌脂肽的重要微生物資源，目前對于芽孢桿菌抗菌脂肽的報道較多，有枯草芽孢桿菌（B. subtilis）[18]、莫海威芽孢桿菌（B. mojavensis）[18]、甲基營養(yǎng)型芽孢桿菌（B. methylotrophicus）[20]、解淀粉芽孢桿菌（B. amyloliquefaciens）[7,21-22]等，這些研究主要集中在抗菌脂肽在分離純化、抑菌活性及植物保護方面的應用，因產(chǎn)量較低、抑菌譜窄，抗菌脂肽的應用范圍受到極大限制。本研究篩選到1 株廣譜抗菌菌株，通過菌落形態(tài)、生理生化測定及16S rDNA進一步分析，菌株鑒定地衣芽孢桿菌，進一步豐富了產(chǎn)抗菌脂肽的微生物資源。目前已有多篇文獻報道地衣芽孢桿菌分泌脂肽，Batrakov等[23]從深井熱水中分離的地衣芽孢桿菌603所產(chǎn)脂肽對棒狀桿菌屬（Corynebacterium variabilis）菌株有抑菌活性，對不動桿菌（Acinetobactersp.）抑菌活性很弱。Rivardo等[24]研究發(fā)現(xiàn)單獨使用地衣芽孢桿菌V9T14所產(chǎn)脂肽對大腸桿菌的抑制作用效果遠低于其和多種抗生素協(xié)同作用。Lawrance等[25]從島上分離了產(chǎn)生抗菌脂肽的地衣芽孢桿菌NIOT-AMKV06，其脂肽具有強熱穩(wěn)定性和顯著降低表面活性的特征，對致病菌糞腸球菌、傷寒沙門氏菌以及枯草芽孢桿菌有顯著抑菌活性，但對大腸桿菌無抑菌活性，抑菌譜較窄。與已報道文獻對比，本研究分離的地衣芽孢桿菌XF32菌株所產(chǎn)抗菌物質(zhì)抑菌譜廣，對本實驗的革蘭氏陽性菌、陰性菌及真菌均具有顯著的抑菌活性，這為其后續(xù)開發(fā)應用提供基礎。

為進一步提高菌株脂肽產(chǎn)量，本研究采用紫外線和DES 2 種誘變技術，通過抑菌圈法篩選到了脂肽產(chǎn)量顯著提高的菌株XF32-22，其抗菌脂肽產(chǎn)量與野生菌XF32相比顯著提高。且遺傳穩(wěn)定性良好，為其工業(yè)化發(fā)酵和實際應用提供了可行性，為利用多種誘變技術遺傳選育高產(chǎn)抗菌肽菌株提供了新的研究方法和思路。

芽孢桿菌屬菌株最大優(yōu)點是繁殖速度快、營養(yǎng)要求簡單，具有抗逆性芽孢，能產(chǎn)生數(shù)十種次生代謝產(chǎn)物，脂肽是非常重要的一類，包括Surfactin、Fengycin、Iturin三個最重要的家族[7]，脂肽一般是由羥基脂肪酸和氨基酸連接成的環(huán)肽，Iturin主要抑制真菌生長[5]，Surfactin主要抑制細菌、病毒、支原體生長[26]，F(xiàn)engycin對絲狀真菌有強烈的抑制作用[27]。目前已有許多芽孢桿菌菌株用于控制植物病害[14,16]，特別是用于真菌病，例如灰霉病菌（Botrytis cinerea）、辣椒疫霉菌（Phytophthora capsici）[28-31]。本研究篩選的地衣芽孢桿菌菌株發(fā)酵液中獲得脂肽粗提物，抑菌結果顯示對革蘭氏陽性菌、陰性細菌和真菌均有顯著抑制作用，由此推測菌株XF32-22在發(fā)酵中除主要產(chǎn)生Fengycin類脂肽外，還可能同時產(chǎn)生多種類型的抗菌物質(zhì)，如Surfactin、Iturin等，這些抗菌脂肽在抑菌過程中可能協(xié)同發(fā)揮作用[31]，增強整體抑菌效果。Ongena等[32]報道枯草芽孢桿菌S499產(chǎn)生的Surfactin和Fengycin類脂肽兩者協(xié)同作用增強了抑菌能力。張榮勝等[22]發(fā)現(xiàn)從解淀粉芽孢桿菌Lx-11發(fā)酵液中提取的粗提物中含有Surfactin、Bacillomycin D和Fengycin 3 種脂肽類抗生素，協(xié)同發(fā)揮較強的生防特性。

本研究對產(chǎn)脂肽的地衣芽孢桿菌XF32-22的發(fā)酵液進行酸沉淀處理，再過Sephadex G-10柱層析，上步的活性組分經(jīng)過半制備高效液相色譜分離，將抗菌活性組分進行MALDI-TOF-MS鑒定，確定為Fengycin。Fengycin是芽孢桿菌產(chǎn)生的抑菌脂肽中的一大類[4]，對多種植物病原真菌，尤其是絲狀真菌有較強的拮抗作用，低濃度時可導致病原菌細胞膜通透性改變，進而起到抑菌作用，高濃度時則以表面活性劑的方式作用于生物膜，破壞病菌細胞膜結構[33]。因脂肽具有穩(wěn)定性好、不易產(chǎn)生抗藥性、高效抗真菌等優(yōu)點，因而成為生物防治、食品防腐、醫(yī)藥等領域研究的熱點。如Hentati等[17]研究了1 株枯草芽孢桿菌FLU5所產(chǎn)生的有Surfactant脂肽類化合物，在環(huán)境修復中具有重要意義；Aktuganov等[15]報道了菌株Paenibacillus ehimensisIB-X-b可以產(chǎn)生多種Fengycin/Plipastatin A-C16類型的環(huán)狀脂肽。

國內(nèi)外對芽孢桿菌抗菌脂肽的研究越來越深入，已從菌株分離、抗菌肽純化、鑒定深入到遺傳、代謝和機理改造等方面。本研究分離篩選并誘變選育了地衣芽孢桿菌菌株XF32-22，分析了菌株分泌的脂肽類化合物的種類及抑菌特性，并為進一步采用基因工程的手段改良芽孢桿菌菌株，大幅度提高脂肽的發(fā)酵產(chǎn)量，為以后開發(fā)推廣抗菌脂肽的應用范圍打下了理論基礎。

4 結 論

本研究針對目前抗菌脂肽生產(chǎn)菌株在生產(chǎn)能力利用上的不足，從自然界中分離到1 株廣譜抗菌效果的菌株，生理生化指標結合16S rDNA序列測序結果表明XF32是地衣芽孢桿菌。進一步采用紫外-DES法誘變育種技術選育出了1 株脂肽生產(chǎn)性能優(yōu)良的高產(chǎn)菌株XF32-22。和傳統(tǒng)單純使用紫外誘變以及利用菌株自發(fā)突變獲取抗性突變株相比，采用紫外誘變結合DES復合誘變可以提高菌株的突變率，加快菌株選育的進程，更有效地提高脂肽產(chǎn)量，適合產(chǎn)抗菌脂肽菌株地衣芽孢桿菌XF32的誘變。利用酸沉淀、Sephadex G-10凝膠層析和半制備高效液相色譜獲得了高純度的抑菌活性物質(zhì)，經(jīng)MALDI-TOF-MS分析，確定抗菌物質(zhì)為脂肽類Fengycin。該脂肽對本研究使用的指示菌革蘭氏陰性細菌、陽性細菌及酵母菌和絲狀真菌均具有顯著的抑菌活性，有潛力在植物生防、食品防腐及醫(yī)藥等行業(yè)生產(chǎn)應用。研究為尋找新的具有廣譜抗菌活性的代謝產(chǎn)物奠定了理論基礎。