超聲波技術(shù)在微生物工程中的應用進展

李云亮，王曉靜，阮思煜，周安奇，劉曉霜，徐雅宣，馬海樂

（江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮(zhèn)江 212013）

微生物工程起源于20世紀70年代，是指利用微生物的生命活動，通過現(xiàn)代化工程技術(shù)，生產(chǎn)人們所需的物質(zhì)或直接應用于工業(yè)化生產(chǎn)的技術(shù)體系，是將傳統(tǒng)發(fā)酵與現(xiàn)代化基因工程、細胞工程等新技術(shù)結(jié)合并迅速發(fā)展起來的現(xiàn)代發(fā)酵技術(shù)[1-3]，主要側(cè)重于微生物資源的開發(fā)利用、微生物菌種的選育培育、生物反應器的設(shè)計、發(fā)酵條件的優(yōu)化、發(fā)酵過程參數(shù)快速檢測以及產(chǎn)物的提取和分離等方面[4-5]。

超聲波是頻率高于20 kHz的聲波，與可聞波（頻率在16～20000 Hz）相比，頻率更高、波長更短，在傳播過程中具有方向性好、能量大、穿透能力強和易引起空化作用等特有性質(zhì)[6]。近年來，隨著國內(nèi)外超聲波生物反應設(shè)備的研究和開發(fā)，超聲波對微生物工程的影響正引學者廣泛的關(guān)注。超聲波在實際應用中主要分為功率超聲波和檢測超聲波[7]，前者一般利用超聲波作為能量載體；后者一般利用超聲波作為信息載體。超聲波作為能量載體，在微生物工程中主要集中應用于遺傳育種、強化發(fā)酵工藝、有害微生物控制、發(fā)酵產(chǎn)物的提取與分離等方面[5]；作為信息載體，主要用于檢測發(fā)酵產(chǎn)物的濃度[8]。結(jié)合本課題組近年來的研究成果，本文對超聲波技術(shù)在微生物工程中的應用進展進行了詳細論述。

1 功率超聲波的應用

1.1 基因工程與遺傳育種

功率超聲波在基因工程與遺傳育種中主要應用于兩方面：一是超聲波誘導基因轉(zhuǎn)移，即在超聲的空化作用下，空泡周圍細胞的細胞壁和質(zhì)膜被擊穿或質(zhì)膜透性可逆改變，細胞內(nèi)外物質(zhì)相互交換，從而將外源基因?qū)爰毎衃7]；二是超聲波誘導基因突變，其作用機制可能是其產(chǎn)生的高溫、高壓和自由基，致使遺傳物質(zhì)發(fā)生突變[9]。

基因轉(zhuǎn)移是指人為的將目的基因轉(zhuǎn)移入受體細胞內(nèi)的過程，可以使菌體快速獲得新的遺傳性狀進而表達，在基因工程中發(fā)揮著重要作用[10]。與其他基因轉(zhuǎn)移方法相比，超聲波誘導基因轉(zhuǎn)移法具有安全可靠、操作簡單、可控制性強等優(yōu)點。早在1990年，許寧等[11]首次通過超聲波處理將外源基因?qū)胫参锝M織和帶壁細胞中，使外源GUS基因在小麥愈傷組織中獲得了短暫表達。宋厚輝等[12]建立了一種簡單快速的、采用低頻、低功率超聲波介導的遺傳轉(zhuǎn)化體系，利用超聲波在微生物細胞膜表面形成的瞬時微型囊泡裹入細胞外部的生物大分子，在細胞自我修復的同時，囊泡連同內(nèi)容物一起嵌入細胞內(nèi)部，完成轉(zhuǎn)化過程。何正文[13]簡化了超聲波轉(zhuǎn)化法，將質(zhì)粒pET-20b（+）成功轉(zhuǎn)入宿主細胞大腸桿菌E.coli BL21（DE3）中。孫尚琛[14]研究分析了超聲波介導轉(zhuǎn)化過程中的宿主細胞的理化性質(zhì)和轉(zhuǎn)化發(fā)生的基礎(chǔ)條件，結(jié)果表明與宿主細胞內(nèi)外膜通透性的改變、二價金屬離子與細胞壁成分肽聚糖的相互作用等有關(guān)。王永剛等[15]利用超聲波成功將質(zhì)粒pET28α轉(zhuǎn)化到枯草芽孢桿菌中，發(fā)現(xiàn)不同條件超聲波處理均能改變細胞膜通透性，且胞內(nèi)物質(zhì)的釋放量與超聲波處理的時間和頻率具有相關(guān)性，通過電鏡觀察到超聲波處理后的細胞外表面凹凸不平、褶皺變形，推斷超聲波介導的DNA轉(zhuǎn)化是細胞生理響應和超聲波共同作用的結(jié)果，揭示了超聲波誘導基因轉(zhuǎn)移的生物學機制。

超聲波誘導基因突變作為一種新型物理誘變技術(shù)，具有操作方便、安全、效果好等優(yōu)點，應用于微生物育種，既能單獨使用又能聯(lián)合其他方法誘變。劉艷等[16]用超聲波誘變篩選蝦青素高產(chǎn)菌株，出發(fā)菌株CTD004經(jīng)過三輪超聲波誘變后，菌株產(chǎn)蝦青素能力達到190.6 mg/L，比出發(fā)菌株增加了126.0 mg/L。劉嫻等[17]以啤酒酵母為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外和超聲波復合誘變后，菌株果膠提取率提高了6.38%，并且突變株具有良好的遺傳穩(wěn)定性。王慶權(quán)等[18]通過超聲波誘變結(jié)合苯磺隆抗性處理，獲得了雙乙酰生成量明顯降低的啤酒酵母突變株，在連續(xù)傳代20次后，突變菌株特性均無明顯變化。王亮等[19]通過將超聲波和硫酸二乙酯復合誘變，得到黃嘌呤和鳥嘌呤雙重營養(yǎng)缺陷型突變株xan－gua－-c，在發(fā)酵20 d時其蟲草素產(chǎn)量比原始菌株提高了40%左右，解決了蟲草素低產(chǎn)率從而限制了其大規(guī)模生產(chǎn)和應用的問題。

工程菌所表達的異源蛋白分為可溶性部分和不溶性的包涵體部分，包涵體的形成對蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)正確折疊是不利的，但是對于一些對蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)要求不嚴格的重組蛋白的表達非常有利，如復性容易的重組蛋白和一些后續(xù)需要化學試劑或蛋白酶處理的蛋白。以包涵體形式表達的重組蛋白在微生物工程下游生產(chǎn)過程中具有一定優(yōu)越性，因此李云亮等[20]發(fā)明了一種促進重組蛋白包涵體形成的方法，在對工程菌誘導表達時，在不提高誘導物（異丙基-β-D-硫代半乳糖苷）濃度的前提下，采用掃頻式超聲波設(shè)備對工程菌進行低強度、短時間的超聲波處理，加快了誘導物的滲透，使重組蛋白高表達時更易形成包涵體。該方法操作工藝簡單，降低了誘導物對宿主細胞的毒害作用，并且適用于在較低的誘導溫度下才能表達重組蛋白的工程菌。

1.2 發(fā)酵過程

微生物發(fā)酵過程中應用超聲波技術(shù)，可使細胞表面瞬間造成微傷，破裂細胞壁，改變細胞膜通透性，細胞內(nèi)含物被釋放。在超聲波功率較低時，對微生物的傷害較小，很容易自身修復，對生物體不會造成損傷或死亡[21]。低功率超聲波應用于微生物的發(fā)酵過程中，不僅可以加速細胞生長，而且可以促進有益次生代謝產(chǎn)物的合成[22]。

國外關(guān)于超聲波技術(shù)應用于發(fā)酵過程中的研究開展的較早也較多，國內(nèi)雖然起步較晚，但也取得了一定成果。Dai等[23]研究了低頻率超聲波刺激對核黃素發(fā)酵生產(chǎn)阿氏假囊酵母（E.ashbyii）的影響，結(jié)果表明，不同頻率的低頻率超聲波處理均能促進菌絲生長，處理后的發(fā)酵液中的葡萄糖和核酸含量均下降，在最優(yōu)條件下，發(fā)酵時間縮短36 h，次生代謝產(chǎn)物核黃素產(chǎn)率提高約5倍。孟祥勇等[24]進行了循環(huán)超聲波輔助黃酒后發(fā)酵風味物質(zhì)的變化分析，發(fā)現(xiàn)此處理不僅可維持黃酒的酒精度，還能提高黃酒醪液氨基酸和酯類的總含量，顯著降低高級醇含量，縮短發(fā)酵時間和釀造周期。Dai等[25]在研究低強度超聲波對釀酒酵母生長、細胞膜通透性和乙醇耐受性的影響中發(fā)現(xiàn)，在頻率為28 kHz、功率為140 W/L、持續(xù)時間1 h的條件下，超聲波處理使釀酒酵母生物量增加了127.03%，超聲波處理還可增強釀酒酵母菌細胞膜的通透性，細胞外蛋白、核酸和果糖-1,6-二磷酸的含量增加，酵母菌可以耐受培養(yǎng)基中濃度較低的酒精。孫悅[26]研究探討了超聲波對巴氏醋桿菌發(fā)酵生產(chǎn)的影響，結(jié)果表明，在超聲波條件為功率600 W、時間15 min、溫度40 ℃時，巴氏醋桿菌的生物量增加了82.35%；在巴氏醋桿菌生長穩(wěn)定中期（25 h）時進行超聲波處理，其總酸含量比對照組高16.70%。Huang等[27]研究了利用超聲波處理副干酪乳桿菌生產(chǎn)酸奶肽的三種方案，在最優(yōu)此條件下，發(fā)酵培養(yǎng)基中肽的含量為5.9 mg/mL，比對照組樣品增加了64.23%，肽產(chǎn)率為14.2%。同時研究發(fā)現(xiàn)超聲波處理提高了發(fā)酵培養(yǎng)基中酸性蛋白酶、中性蛋白酶和堿性蛋白酶的酶活性。以上研究為實現(xiàn)超聲波技術(shù)在傳統(tǒng)食品發(fā)酵工業(yè)化生產(chǎn)中的應用提供了可行性。

關(guān)于超聲波和微生物之間相互作用的機制，有學者提出，超聲波的空化作用促進了菌體可逆滲透，提高了細胞內(nèi)外物質(zhì)的運輸能力，減少了次級代謝產(chǎn)物的積累對微生物的抑制作用，從而提高了代謝產(chǎn)物的得率，也有學者認為，CO2會抑制細胞生長，而低強度超聲波可以減少發(fā)酵液中CO2的溶解度，從而促進細胞增殖[21]。Huang等[28]利用自行研制的掃頻超聲波設(shè)備對熱帶念珠菌進行低強度超聲波輻照，結(jié)果表明，超聲波處理后細胞通透性和細胞生長速度明顯提高，控制熱帶念珠菌增殖的關(guān)鍵基因顯著上調(diào)，從遺傳學水平初步解釋了超聲波促進微生物增殖的機制。刑歡[29]研究發(fā)現(xiàn)，低強度超聲波可以促進熱帶假絲酵母增殖，在最佳處理條件下，菌體生物量增加值最高可達到148.5%，并通過轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)發(fā)現(xiàn)了超聲波促進熱帶假絲酵母增殖的關(guān)鍵基因和信號通路，闡釋了低強度超聲波調(diào)控熱帶假絲酵母細胞周期的分子機制。

目前為止，大多數(shù)關(guān)于超聲波處理促進微生物發(fā)酵的研究都是采用間歇超聲波處理方法進行的，Zhang等[30]開發(fā)了一種新型超聲波設(shè)備，即多頻掃描槽式超聲波設(shè)備，采用原位超聲波輻照促進發(fā)酵的方法，探討了不同工作模式（固定頻率和掃頻）、不同頻率的超聲波處理對釀酒酵母生長和代謝產(chǎn)量的影響。結(jié)果表明：固定頻率超聲波能顯著促進釀酒酵母的生長和代謝產(chǎn)量，并發(fā)現(xiàn)在最佳工藝條件下（頻率23 kHz、發(fā)酵時間48 h），乙醇的產(chǎn)量增加了19.33%，β-苯乙醇等代謝物的含量也增加，證實了原位超聲波處理方法比間歇處理方法更適用于工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)。

1.3 有害微生物的控制

超聲波空化作用可以使液體產(chǎn)生瞬間高溫、高壓變化，使微生物細胞內(nèi)容物受到強烈的震蕩，從而達到對微生物的破壞作用，即達到殺菌的目的[31]。將超聲波技術(shù)應用于控制微生物的生長或消滅有害微生物，具有能耗低、時間短，有效保留產(chǎn)品的營養(yǎng)成分和色香味等特點[32]。

朱邵華[33]利用超聲波發(fā)生儀對醬油進行滅菌處理，證明超聲波可以對液體食品進行有效滅菌，當超聲波滅菌4 min以上時，醬油樣品中微生物菌落總數(shù)明顯下降，死亡率達到68.4%。吳雅紅等[34]用超聲波技術(shù)代替高溫滅菌，發(fā)現(xiàn)經(jīng)超聲波滅菌后的綠茶茶湯，雖有少量金黃色葡萄球菌和枯草芽孢桿菌生長，但在安全衛(wèi)生標準范圍內(nèi)，并且茶多酚損失率小于高溫滅菌的茶多酚損失率。楚文靖等[35]研究了超聲波處理對藍莓汁殺菌率和品質(zhì)的影響，結(jié)果顯示超聲波參數(shù)對藍莓汁殺菌效果有顯著影響，最佳殺菌條件為功率180 W、超聲時間8 min、超聲溫度40 ℃，此時藍莓汁的殺菌率可以達到64%，且超聲波處理對藍莓汁可溶性固形物、pH及色澤影響較小。

與傳統(tǒng)殺菌方法相比，超聲波殺菌效果有限，因此近年來研究者常將超聲波作為輔助殺菌方法，與其他殺菌技術(shù)聯(lián)合使用，以提升殺菌效果[32]，目前已有研究將超聲波與溫度[36]、臭氧[37]、納米二氧化肽[38]、微波[39-40]、激光[41]、脈沖光[42]、抗菌劑[43]等協(xié)同滅菌。張曜[36]采用超聲波細胞粉碎儀作為副溶血性弧菌的殺菌設(shè)備，發(fā)現(xiàn)當超聲波頻率為500～600 Hz時與溫度的協(xié)同效果最佳，殺菌率可達97%左右。Brenda等[44]研究發(fā)現(xiàn)微波與超聲波技術(shù)結(jié)合處理可用于黑莓汁中微生物的滅活，處理后的黑莓汁與對照組相比，霉菌、酵母菌和好氧菌數(shù)量明顯下降，并且在貯藏一個月后，果汁中總多酚和花青素的保留率分別為87%、90%。Wang等[45]探索了一種紫外輔助超聲波殺菌技術(shù)，這種技術(shù)用于芒果汁的殺菌，不僅對果汁感官特性的損害最小，而且提高了芒果汁的營養(yǎng)價值和安全性，具有極高的商業(yè)價值。

目前的研究大部分是對超聲波工藝參數(shù)的優(yōu)化，對于超聲波殺菌的機制研究較少。王薇薇等[9]提出超聲波殺菌的主要機制是空化效應使細胞壁變薄及其產(chǎn)生的局部高溫、高壓和自由基。Fan等[46]研究了超聲波和熱處理協(xié)同鈍化枯草芽孢桿菌孢子及其機制，結(jié)果發(fā)現(xiàn)超聲波頻率20 kHz、功率密度20 W/mL、溫度80 ℃處理40 min時，芽孢菌落數(shù)的對數(shù)值減少了2.43±0.08，同時發(fā)現(xiàn)大量細胞死亡和DPA（吡啶-2,6二羧酸）釋放，表明超聲波和熱協(xié)同殺滅枯草芽孢桿菌孢子不是通過滅活孢子皮層溶解酶或萌發(fā)受體，而是通過損害某些中間代謝關(guān)鍵酶使孢子失活，但對這些關(guān)鍵酶還需進一步鑒定。遲媛等[47]在研究超聲波協(xié)同次氯酸鈉對腐敗菌的殺菌效果中發(fā)現(xiàn)，兩者協(xié)同作用會極大損傷菌體細胞外層結(jié)構(gòu)，胞內(nèi)物質(zhì)外溢、細胞器溶解及細胞皺縮等情況更為嚴重，與相同時間下單獨次氯酸鈉殺菌效果相比，協(xié)同作用殺菌對數(shù)值提高了13%～67%，并提出該效應的作用機制可能是因為在殺菌過程中，超聲波優(yōu)先作用于菌體細胞壁，超聲波的空化效應破壞了菌體外層結(jié)構(gòu)，因此次氯酸鈉直接作用于裸露的菌體，兩者的協(xié)同作用強化了殺菌效應，從而加速菌體細胞死亡。

1.4 發(fā)酵產(chǎn)物的提取分離

超聲波提取技術(shù)是在傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種新技術(shù)，根據(jù)超聲波的空化等性質(zhì)破壞細胞，降低物質(zhì)溶出阻力，提高擴散速率，從而獲得所需物質(zhì)，與傳統(tǒng)提取方法相比，具有操作簡單、不需要加熱、提取速度快，產(chǎn)品得率高等特點[48]。

超聲波提取技術(shù)多用于提取中草藥等天然藥物[49-50]，近年來也被廣泛應用于微生物發(fā)酵產(chǎn)物的提取。張紅[51]從汾河淤泥中分離得到高產(chǎn)類胡蘿卜素的菌株P(guān)SB-B，比較酸熱裂解法、研磨法、超聲波法三種方法提取類胡蘿卜素的效果，得出超聲波提取法效果最佳，為工業(yè)化低成本高產(chǎn)量生產(chǎn)類胡蘿卜素提供了理論依據(jù)和指導。盛悅[52]采用超聲波輔助提取法對猴頭菌液體、固體發(fā)酵產(chǎn)物中的多糖提取工藝進行了優(yōu)化，在最優(yōu)條件下，液體發(fā)酵產(chǎn)物多糖得率為7.03%，比傳統(tǒng)熱水浸提法提高了61.61%；固體發(fā)酵產(chǎn)物多糖得率為5.84%，比傳統(tǒng)熱水浸提法得率提高了50.52%。Salim等[53]以豆粕為底物，采用固態(tài)發(fā)酵技術(shù)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶和α-淀粉酶，研究中發(fā)現(xiàn)，超聲波輔助提取法比優(yōu)化后的傳統(tǒng)提取工藝獲得的酶產(chǎn)量更高，蛋白酶產(chǎn)量最高可達到330 IU，α-淀粉酶產(chǎn)量最高可達到825 IU，并且提取時間明顯縮短。

常用的分離方法有離心和過濾，但離心機存在不易與在線系統(tǒng)兼容、過濾器易堵塞等問題，Hawkes等[54]設(shè)計了一種分離系統(tǒng)，該系統(tǒng)以釀酒酵母為模型細胞，利用超聲駐波的力量作用于細胞，從而將細胞從懸浮液中分離出來。此系統(tǒng)可用于連續(xù)過濾分離，而且方便調(diào)節(jié)流速，易于在線使用且不受物理堵塞限制。Coakley[55]使用此方法，在低功率超聲波條件下分離酵母和大腸桿菌，結(jié)果表明，與離心分離法相比，酵母和大腸桿菌的分離速度快了3倍。此外，在分離細胞和分子方面，超聲波分離技術(shù)與常規(guī)的磁珠和介電泳相比也有很多優(yōu)勢。

2 檢測超聲波的應用

超聲波具有較強的穿透能力，當其信號較微弱時，其產(chǎn)生的能量不足以改變發(fā)酵液中細胞、酶等的生物性能，但發(fā)酵液產(chǎn)物的濃度、粘度等這些物理參數(shù)會影響聲波的傳播性質(zhì)，因此可利用這一特點實現(xiàn)超聲波的在線檢測[56]。Cowan等[57]用柔性板波(FPW)傳感器（一種超聲波傳感器）檢測大腸桿菌W3110在重力作用下細胞在溶液中的濃度變化，改進了傳統(tǒng)的細胞濃度測定方法，這種技術(shù)只需要很少的樣本量且允許在線數(shù)據(jù)收集。王武等[7]以麥汁為底物，在超聲波頻率為5.8 MHz時，利用超聲波技術(shù)進行了啤酒發(fā)酵過程中酵母濃度測量的實驗研究，發(fā)現(xiàn)在不同的溫度時，酵母濃度的變化對超聲波傳播速度的影響較大。高月華[58]根據(jù)超聲波測量原理，設(shè)計出一種超聲波檢測儀，用于發(fā)酵過程中酵母濃度的在線檢測，其測量系統(tǒng)由測量傳感器、超聲波信號發(fā)生器、檢測電路、微機系統(tǒng)等組成，此檢測儀可在工作現(xiàn)場高溫滅菌，且不污染發(fā)酵物。

與其他檢測技術(shù)相比，超聲波技術(shù)用于微生物發(fā)酵產(chǎn)物濃度的在線檢測，具有適應性強、設(shè)備成本低、操作簡單易上手等優(yōu)點，其應用前景十分廣闊。根據(jù)現(xiàn)有研究報道發(fā)現(xiàn)[59-61]，利用超聲波技術(shù)制備生物反應設(shè)備和生物傳感器雖有一些進展，但這些設(shè)備的有效利用取決于超聲波對其目標物質(zhì)的作用機制是否清晰。目前此技術(shù)在液態(tài)發(fā)酵中應用較多，如啤酒中酵母濃度、乙醇濃度[62]、醋酸濃度等檢測，而很少應用于固態(tài)發(fā)酵在線檢測[63]，這可能與相關(guān)模型的建立難易程度有關(guān)。

3 展望

目前超聲波技術(shù)已廣泛應用于微生物工程中，可以促進微生物生長，縮短發(fā)酵時間，進行菌種誘變，提取發(fā)酵產(chǎn)物、有害微生物控制以及在線檢測產(chǎn)物參數(shù)等。此類研究大多集中于超聲波工藝的優(yōu)化，在超聲波引起的細胞結(jié)構(gòu)、成分及功能改變機制等方面的報道很少，在這些方面的進一步研究有助于更加有效的控制超聲波處理過程，應是科研人員今后研究的方向。將超聲波技術(shù)等物理手段用于微生物工程中，對我國食品科學及微生物發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展具有重要意義。