白介素17在心房顫動模型大鼠中的作用機制研究

謝 建，梁珊珊，宋 波，秦忠心，彭俊秋，王 冰，趙大奎

心房顫動是臨床常見的心律失常之一，易導致心力衰竭、腦卒中等并發(fā)癥[1]，給家庭和社會帶來沉重負擔，因此，明確心房顫動的發(fā)生發(fā)展機制對預(yù)防和治療心房顫動有重要意義。心房纖維化被認為是心房顫動發(fā)生與維持的關(guān)鍵因素[2]。心房纖維化主要是心肌細胞外基質(zhì)重構(gòu)。多種炎癥細胞及炎性因子參與心肌細胞外基質(zhì)重構(gòu)[3]。輔助性T細胞17(T helper 17，Th17)是近年來新發(fā)現(xiàn)的一種由TH0細胞在轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)、白介素6(interleukin-6，IL-6)、白介素23(IL-23)和白介素21(IL-21)刺激下分化而成CD4+T細胞亞群，主要分泌白介素17(IL-17)而發(fā)揮促炎作用[4]，在自身免疫性疾病和機體防御反應(yīng)中具有重要意義[5]，而干擾素、白介素4(IL-4)、細胞因子信號傳送阻抑蛋白3可抑制TH0細胞分化為TH17細胞[6]。

TH17細胞在自身免疫中發(fā)揮重要作用。相關(guān)研究證實，IL-17、白介素1(IL-1)、IL-6及干擾素在心力衰竭、病毒性心肌炎、動脈粥樣硬化等多種疾病中發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用[7-8]。已有研究表明，心房顫動動物IL-17高表達，IL-17可促進T細胞激活并刺激上皮細胞、內(nèi)皮細胞、成纖維細胞產(chǎn)生多種細胞因子如IL-6、IL-8、粒細胞-巨噬細胞刺激因子、化學增活素及細胞黏附分子1(cellular adhesion molecule 1，CAM-1)，從而導致炎癥發(fā)生[9]。IL-17是T細胞誘導炎癥反應(yīng)的早期啟動因子，通過促進釋放前炎性細胞因子放大炎癥反應(yīng)，并參與心房纖維化[10]。但IL-17是否來源于Th17細胞，如何促進心房顫動纖維化過程尚無報道。本研究擬證實Th17細胞在心房顫動動物模型中高表達，且通過分泌IL-17調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子κB(nuclearfactorκB，NF-κB)而促進心房纖維化過程，從而為心房顫動治療提供新靶點。

1 材料與方法

1.2 構(gòu)建SD大鼠心房顫動模型 按隨機數(shù)字表法將40只雄性SD大鼠(體重250～300 g)分為對照組(20只)和心房顫動組(20只)。實驗時兩組大鼠均應(yīng)用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉并氣管插管，連接心電監(jiān)護。心房顫動組使用食道電極經(jīng)口送入食管比鄰心房處，電極連接電生理儀，設(shè)置電生理儀參數(shù)(電壓20 V，電流4 mA，脈寬6 ms)，通過電生理儀發(fā)放脈沖波快速起搏心房，每次刺激30 s，間隔5 min，待恢復竇性心律再次刺激，每日5次，通過心電監(jiān)護確認心房顫動發(fā)作以明確心房顫動模型構(gòu)建成功。記錄心臟心電圖詳細情況，心房顫動發(fā)生時間以P波消失并出現(xiàn)典型心房顫動波為標志，以恢復竇性心律作為心房顫動終止，期間即為SD大鼠造模后心房顫動持續(xù)時間。對照組僅在麻醉后給予氣管插管和心電監(jiān)護，不進行食道心房刺激。

1.3 SD大鼠標本采集

1.3.1 心房顫動血液標本收集 兩組大鼠在實驗開始前、實驗第5天和第10天經(jīng)鼠尾靜脈取血1 mL，立即注入EDTA抗凝管并充分搖勻，以2 000 r/min離心20 min后分離血漿與血細胞，將血漿分裝于-80 ℃低溫冰箱保存。

1.3.2 組織標本收集 于實驗第10天以1%戊巴比妥鈉腹腔深度麻醉后將SD大鼠前胸壁打開，快速取出心臟，置于生理鹽水中去除血液，取50 mg左右心房組織置于4%多聚甲醛容器內(nèi)保存，剩余心房組織放置于-80 ℃冰箱保存。

1.4 血漿IL-17含量 使用大鼠 IL-17 ELISA試劑盒檢測兩組大鼠血漿IL-17蛋白水平表達。所有血漿樣品檢測均重復進行，以確保變異系數(shù)(CV)<10%，具體操作步驟按照說明書進行。

1.5 實時定量聚合酶鏈式反應(yīng)(Real-Time PCR)檢測心房組織IL-17表達 應(yīng)用Real-Time PCR檢測心房組織IL-17基因水平表達，具體步驟包括Trizol提取總RNA、瓊脂糖電泳檢測其完整性、分光光度計測定純度和濃度。按照試劑盒說明書進行，檢測心肌組織IL-17表達情況。以β-actin為內(nèi)參照，分析基因相對表達量。具體引物序列，SD大鼠 IL-17：正向引物5′-TCGTAACGTACCAGACG-3′，反向引物5′-CCGTGTACAGTCATGG-3′；SD大鼠β-actin：正向引物5′-ACTGATCGCCACCGCAG-3′，反向引物5′-ACCACAGTGTGCCGATCTGG-3′。

1.6 流式細胞術(shù)分選心房組織浸潤的淋巴細胞 為明確IL-17來源，取病變區(qū)的心肌組織，眼科剪刀剪碎，采用胰酶和膠原酶反復消化，待組織徹底裂解為單個細胞后，用400目的尼龍網(wǎng)去掉上清液中團塊，再應(yīng)用紅細胞裂解液去除紅細胞，用PBS洗滌后制成單細胞懸液。所得細胞以佛波醇酯類多克隆刺激劑(PMA) 50 ng/mL，鈣離子載體(Ionomycin) 1 μg/mL刺激，同時加入蛋白轉(zhuǎn)運抑制劑(Monensin) 1 μg/mL，置于37 ℃、5%CO2中培養(yǎng)4 h。收集細胞后依次進行表面抗原染色PE-抗大鼠CD3單抗和APC-標記抗大鼠CD4單抗，流式細胞儀上應(yīng)用活細胞分選技術(shù)分選CD4+細胞(輔助T淋巴細胞)和CD3+其他成熟T淋巴細胞，應(yīng)用流式軟件FlowJo VX10統(tǒng)計輔助T淋巴細胞占所有成熟T淋巴細胞比例。將流式分選后CD3+/CD4+細胞(輔助T淋巴細胞)和CD3+/CD4-的其他成熟T淋巴細胞收集并培養(yǎng)，校準細胞數(shù)量后，培養(yǎng)24 h后應(yīng)用ELISA試劑盒檢測上清液IL-17蛋白水平。

（5）數(shù)據(jù)分析、處理功能，平臺能夠通過對各個經(jīng)銷商的經(jīng)營數(shù)據(jù)進行分析處理，為生產(chǎn)廠商提供精細化的營銷運營方案；

1.7 IL-17單克隆抗體干預(yù)SD心房顫動大鼠 按隨機數(shù)字表法將60只雄性SD大鼠(體重250～300 g)分為對照組(20只)、心房顫動組(20只)和心房顫動干預(yù)組(20只)。實驗時3組大鼠均采用1%戊巴比妥鈉腹腔麻醉并氣管插管，連接心電監(jiān)護。構(gòu)建大鼠心房顫動模型。心房顫動干預(yù)組除上述處理外每48 h經(jīng)腹腔注射大鼠IL-17單克隆抗體100 μg。詳細記錄心臟心電圖情況。

1.8 SD大鼠心房顫動參數(shù) 在SD大鼠離體心臟的心尖和右心房處分別連接電極，利用Langendorff離體心臟灌流系統(tǒng)灌注離體SD大鼠心臟，同時測量生物電。生物電刺激由固定在心房壁上的電極發(fā)放，每8個S1刺激后給予一個S2刺激，且不斷縮短S1、S2刺激間期間隔，最終S2刺激落在1個S1刺激的心房肌有效不應(yīng)期內(nèi)，從而S2刺激不能產(chǎn)生心跳，這個時間間隔即心房肌有效不應(yīng)期。測定3組SD大鼠心房肌有效不應(yīng)期，同時統(tǒng)計3組大鼠動作電位時程。

1.9 大鼠心臟組織Masson染色 心臟組織切片經(jīng)二甲苯及不同濃度乙醇水化至蒸餾水，Masson染色液中媒染1 h，Weigert氏鐵蘇木素染20 min，自來水清洗，0.5%鹽酸乙醇分化30 s，麗春紅-品紅液染色10 min，充分水洗，脫水、透明、封片。

1.10 Western Blotting檢測 應(yīng)用RIPA裂解心臟組織，組織破碎儀震蕩，以12 000 r/min離心20 min，去上清進行蛋白濃度測定，再用6 X上樣緩沖液制樣。上樣90 V恒壓電泳，之后以400 mA恒流將蛋白電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，用含5%脫脂奶粉的TBST溶液封閉PVDF膜1 h。封閉結(jié)束后，在含5%BSA的TBST中抗體4℃過夜，二抗室溫結(jié)合2h，加入顯影液曝光顯影。

2 結(jié) 果

2.1 對照組和心房顫動組血漿IL-17含量比較 心房顫動組SD大鼠血漿IL-17含量高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P=0.009)。詳見圖1。

與對照組比較，*P<0.01。圖1 對照組和心房顫動組血漿IL-17含量比較

2.2 對照組和心房顫動組IL-17基因表達比較 心房顫動組心房組織IL-17基因表達高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。詳見圖2。

與對照組比較，*P<0.001。圖2 對照組和心房顫動組IL-17基因表達比較

2.3 對照組和心房顫動組SD大鼠心臟組織輔助T淋巴細胞比例比較 運用流式細胞術(shù)分選心房組織浸潤的淋巴細胞，篩選并統(tǒng)計CD3+/CD4+輔助T淋巴細胞占成熟T淋巴細胞比例。對照組輔助T淋巴細胞占成熟T淋巴細胞比例為(13.27±1.73)%，心房顫動組輔助T淋巴細胞占成熟T淋巴細胞比例為(50.12±4.56)%，兩組比較差異有統(tǒng)計學意義(P=0.007)。詳見圖3。

圖3 對照組和心房顫動組SD大鼠心臟組織輔助T淋巴細胞比例比較

2.4 對照組和心房顫動組SD大鼠T淋巴細胞亞群IL-17水平比較 對照組CD3+/CD4-成熟T淋巴細胞上清液IL-17水平較低，為(0.11±0.03)ng/L，心房顫動組為(0.19±0.06)ng/L，CD3+/CD4+細胞(輔助T淋巴細胞)培養(yǎng)上清液IL-17水平升高，為(0.39±0.04)ng/L，表明心房顫動組血清高水平IL-17主要來源于CD3+/CD4+輔助T淋巴細胞。詳見圖4。

組內(nèi)比較，*P<0.05；組間比較，#P<0.01。圖4 對照組和心房顫動組T淋巴細胞亞群IL-17水平比較

2.5 3組SD大鼠心電圖相關(guān)參數(shù)比較 刺激期心房顫動組20只SD大鼠均發(fā)生心房顫動，心房顫動發(fā)生率為100%，心房顫動波持續(xù)時間為(48.80±1.54)s，表明心房顫動模型構(gòu)建成功。心房顫動干預(yù)組20只SD大鼠僅16只發(fā)生心房顫動，心房顫動發(fā)生率80%。心房顫動組平均心率高于對照組(P<0.05)；而給予IL-17抗體干預(yù)后SD大鼠平均心率顯著降低，與心房顫動組比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。心房顫動組SD大鼠房性期前收縮、房性二聯(lián)律、房性三聯(lián)律刺激間歇期頻發(fā)出現(xiàn)；給予IL-17抗體干預(yù)后SD大鼠刺激間歇期房性期前收縮、房性二聯(lián)律、房性三聯(lián)律較心房顫動組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表1。

表1 3組SD大鼠心電圖相關(guān)參數(shù)比較

2.6 3組SD大鼠心房不應(yīng)期和動作電位時程比較 心房顫動組SD大鼠心房不應(yīng)期較對照組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而給予IL-17抗體干預(yù)后SD大鼠心房不應(yīng)期較心房顫動組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。心房顫動組SD大鼠心房動作電位時程較對照組顯著降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而給予IL-17抗體干預(yù)后SD大鼠動作電位時程較心房顫動組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 3組心房不應(yīng)期和動作電位時程比較(±s) 單位：ms

2.7 3組SD大鼠心房組織間質(zhì)纖維化比較 利用Masson染色檢測心房纖維化水平，結(jié)果顯示：對照組SD大鼠心房組織間質(zhì)纖維化較少，而心房顫動組SD大鼠心房組織間質(zhì)纖維化較對照組增加，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)；給予IL-17抗體干預(yù)后SD大鼠心房組織間質(zhì)纖維化水平較心房顫動組降低，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.01)。詳見圖5、圖6。

圖5 3組心房纖維化Masson染色結(jié)果

與心房顫動組比較，*P<0.01。圖6 3組SD大鼠心房組織間質(zhì)纖維化比較

2.8 3組SD大鼠心房組織纖維化相關(guān)蛋白水平 Western Blotting結(jié)果顯示：心房顫動組TGF-β1、α-SMA、MMP-9表達水平顯著增加，表明心房顫動時心房組織纖維化程度增加。給予IL-17抗體干預(yù)后SD大鼠心房組織纖維化相關(guān)蛋白TGF-β1、α-SMA、MMP-9表達水平較心房顫動組顯著降低，表明抑制IL-17介導的炎癥可改善心房組織纖維化及心房顫動發(fā)生。詳見圖7。

圖7 3組心房組織纖維化相關(guān)蛋白水平比較

3 討 論

心房顫動是常見的持續(xù)性心律失常，也是心房電重構(gòu)的結(jié)果，而心肌纖維化導致心房電重構(gòu)，心臟電活動發(fā)生和傳導異常是促進心房顫動發(fā)生的重要原因[11-12]。本研究通過SD大鼠心房顫動模型確定心房顫動發(fā)生時IL-17高表達，且通過流式分選技術(shù)確定輔助T淋巴細胞 IL-17的主要來源。IL-17家族包括6個成員配體(IL-17A～IL-17F)和5個受體[13]，有研究發(fā)現(xiàn)，IL-17和IL-17受體結(jié)合后，通過MAPK途徑和NF-κB途徑發(fā)揮生物學作用[14-15]。

給予心房顫動SD大鼠抗IL-17中和抗體后，發(fā)現(xiàn)心房顫動大鼠心房不應(yīng)期延長，且心間質(zhì)纖維化減輕，表明降低心房組織炎癥可改善心房間質(zhì)纖維化，且分子水平結(jié)果顯示心房組織纖維化相關(guān)蛋白TGF-β1、α-SMA、MMP-9表達水平較心房顫動組顯著降低，本研究結(jié)果揭示輔助性T細胞17分泌的IL-17在心房收縮功能障礙、心肌細胞重構(gòu)和疾病進展中發(fā)揮重要作用，提示抗炎可能是心房顫動的治療途徑之一。

初始CD4+T細胞接受抗原刺激后，不同條件下可分化為不同亞型T細胞，發(fā)揮不同功能，其分化方向受抗原性質(zhì)、局部環(huán)境激素及細胞因子等多種因素調(diào)控[15]，其中細胞因子種類和細胞因子之間平衡對T淋巴細胞的分化具有重要的調(diào)節(jié)作用[16]。TGF-β1和IL-6共同誘導分化T淋巴細胞為輔助T淋巴細胞Th17，分泌IL-6和IL-17，參與炎癥反應(yīng)和自身免疫性疾病[17]。本研究結(jié)果顯示：Th17參與心房顫動等心律失常疾病。在此過程中，T細胞相關(guān)受體分子及轉(zhuǎn)錄子均發(fā)揮重要作用。許多轉(zhuǎn)錄因子如Foxp3可特異性調(diào)控Th17細胞活化[18]，因此，通過調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子表達及加入炎性因子可中和抗體抑制T細胞的增殖活化，是改善心房顫動的重要途徑。

近期研究發(fā)現(xiàn)，CD4+、CD25+調(diào)節(jié)T細胞可抑制T淋巴細胞產(chǎn)生IL-2和γ干擾素(IFN-γ)，明顯促進IL-17產(chǎn)生[19]，當加入抗轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)中和性抗體時，可抑制IL-17產(chǎn)生[20]。本研究結(jié)果表明，加入抗IL-17中和性抗體心房組織纖維化顯著改善，今后將進一步分析TGF-β中和性抗體在心房組織纖維化中的作用，明確炎癥在誘導心房顫動發(fā)生中的作用。

綜上所述，實驗性大鼠心房顫動模型中，心房組織IL-17基因水平和蛋白質(zhì)水平均升高，且輔助T淋巴細胞Th17是心房顫動時高水平 IL-17的主要來源，IL-17與心房顫動發(fā)生和發(fā)展有關(guān)。IL-17是一種具有強大的聚集中性粒細胞的前炎性細胞因子，可促進多種細胞釋放炎性因子，在心房組織重塑及心房間質(zhì)纖維化過程中發(fā)揮重要作用，是調(diào)節(jié)心房顫動發(fā)生的重要靶點。