徐翌斌,羅成龍,瞿 浩,計(jì) 堅(jiān),舒鼎銘
(畜禽育種國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省畜禽育種與營(yíng)養(yǎng)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物科學(xué)研究所,廣東廣州 510640)
蛋氨酸(Methionine,Met)作為家禽玉米-豆粕型日糧的第一限制性氨基酸,也是動(dòng)物體內(nèi)的必需氨基酸,對(duì)提高家禽的免疫功能、生長(zhǎng)性能和抗氧化性等方面至關(guān)重要[1]。當(dāng)日糧缺乏Met 時(shí),肉雞會(huì)出現(xiàn)食欲減退、生長(zhǎng)緩慢和免疫功能缺陷等癥狀[2]。Li 等[3]研究表明,Met 不僅能參與免疫分子(細(xì)胞因子、抗體、補(bǔ)體等)的合成,同時(shí)介導(dǎo)了免疫組織和器官的正常發(fā)育。同時(shí),Met 可通過(guò)提高機(jī)體內(nèi)血清溶菌酶活性、外周淋巴細(xì)胞活性和和白細(xì)胞的吞噬活性[4],積極參與調(diào)節(jié)機(jī)體的固有免疫和體液免疫[5-6]。
Met 是機(jī)體內(nèi)重要的甲基供體之一,參與眾多的DNA 甲基化過(guò)程[7]。DNA 甲基化在轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)控基因的表達(dá),高甲基化狀態(tài)會(huì)導(dǎo)致基因表達(dá)抑制,而低甲基化狀態(tài)會(huì)促進(jìn)基因表達(dá)。Wichnieski 等[8]研究發(fā)現(xiàn),DNA 甲基化與動(dòng)物機(jī)體炎癥和衰老等眾多生理疾病密切相關(guān)。用甲基化方式調(diào)控炎癥因子或炎癥信號(hào)通路的表達(dá)可以緩解炎癥反應(yīng)[9]。Arroyo-Jousse 等[10]研究表明半胱氨酸可提高TNF-α啟動(dòng)子區(qū)高甲基化水平從而緩解炎癥反應(yīng)。本課題組前期發(fā)現(xiàn)Met 能緩解脂多糖(LPS)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11],但其分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。因此,本研究從甲基化角度初步探究DNA甲基化與Met 抑制LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥中調(diào)控機(jī)制的相關(guān)性,進(jìn)而為Met 調(diào)控免疫功能提供一定的理論基礎(chǔ)。
1.1 細(xì)胞及試驗(yàn)相關(guān)試劑 本試驗(yàn)的小鼠巨噬細(xì)胞所用RAW264.7 細(xì)胞購(gòu)自美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC細(xì)胞庫(kù))。Dulbecco’s Modified Eagle Medium(DMEM)、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素/ 鏈霉素抗生素購(gòu)自Gibco 公司。蛋氨酸、脂多糖、二甲基亞砜購(gòu)自Sigma公司。磷酸緩沖溶液購(gòu)自上海生工生物公司。
1.2 巨噬細(xì)胞處理 將細(xì)胞鋪板至6 孔板中,接種密度為1×106個(gè)/mL,細(xì)胞置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中過(guò)夜培養(yǎng)。設(shè)置空白(Ctr)組、LPS 組和Met+LPS 組,每組3 個(gè)重復(fù)。Ctr 組細(xì)胞為正常培養(yǎng)基細(xì)胞(不添加LPS 和Met),LPS 組細(xì)胞為正常培養(yǎng)基培養(yǎng)后添加100 ng/mL 的LPS刺激3 h,Met+LPS 組細(xì)胞為含10 mmol/L 的Met 培養(yǎng)基培養(yǎng)12 h 后,用100 ng/mL 的LPS 刺激3 h。
1.3 全基因組甲基化測(cè)序 收集各組處理后的巨噬細(xì)胞(共3 組,每組3 個(gè)重復(fù))放置干冰,委托安諾優(yōu)達(dá)基因科技有限公司完成MeDIP-seq。操作步驟:提取并純化巨噬細(xì)胞全基因組 DNA;將基因組 DNA 打斷至100~500 bp;對(duì)全基因組 DNA 片段末端進(jìn)行修復(fù),在3'端加腺嘌呤,并連接測(cè)序接頭,雙鏈 DNA 單鏈化;采用 5-甲基胞嘧啶抗體對(duì)測(cè)序接頭DNA 進(jìn)行沉淀富集;Q-PCR 擴(kuò)增后跑膠,切膠純化并質(zhì)控產(chǎn)物;合格文庫(kù)用于上機(jī)測(cè)序。
1.4 全基因組甲基化測(cè)序的生物信息學(xué)分析 對(duì)下機(jī)數(shù)據(jù)序列進(jìn)行去污染和去低質(zhì)量處理,將篩選后的reads 與參考基因組(mm10)進(jìn)行定位對(duì)比并統(tǒng)計(jì)信息,每條read最多允許3 個(gè)堿基錯(cuò)配?;贛ACS 軟件對(duì)全基因組處理后的序列進(jìn)行甲基化峰(peak)掃描,得到每組樣品的peak 區(qū)域信息結(jié)果,并統(tǒng)計(jì)在基因元件(upstream2k、5'UTR、CDS、Intron、3'UTR、downstream2k)上的分布,并進(jìn)行對(duì)比分析。根據(jù)差異的read 數(shù)量,將差異的基因分為高甲基化基因和低甲基化基因。例如,樣品1 vs.樣品2,同一個(gè)peak 區(qū)域內(nèi)樣品2 的reads 數(shù)量高于樣品1 的基因?yàn)楦呒谆颍粗疄榈图谆颍êY選條件:P<0.01,兩樣本在相同基因元件內(nèi)都有覆蓋,且覆蓋度的差異在2 倍以上),并統(tǒng)計(jì)在基因組不同區(qū)域上差異甲基化基因的分布。最后,將兩樣品間的差異基因進(jìn)行GO 功能富集分析和KEGG 功能分析。
2.1 全基因組測(cè)序數(shù)據(jù)處理 如表1 所示,在Ctr 組、LPS組 和LPS+Met 組分別得到177 730 085、176 089 330、163 741 744 個(gè)比對(duì)reads 數(shù)和151 460 128、151 069 422、140 320 769 個(gè)唯一比對(duì)reads 數(shù),比對(duì)率達(dá)分別達(dá)53.04 %、56.38 %和54.04 %,唯一比對(duì)率分別達(dá)45.2 %、48.37 %和46.31 %,并且LPS 組的比對(duì)率和唯一比對(duì)率均高于Ctr 組,而LPS+Met 組的比對(duì)率和唯一比對(duì)率均低于LPS 組。
表1 MeDIP-seq 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果
2.2 統(tǒng)計(jì)MeDIP-Seq 的甲基化峰(Peak)信息 基于MACS 軟件對(duì)各組細(xì)胞的MeDIP-seq 數(shù)據(jù)進(jìn)行peak 掃描并統(tǒng)計(jì)信息。如表2 所示,LPS 組的peak 數(shù)量、總長(zhǎng)度和覆蓋率均高于Ctr 組,而LPS+Met 組的peak 數(shù)量、總長(zhǎng)度和覆蓋比例均低于LPS 組。
表2 Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組中peak 區(qū)域信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果
2.3 統(tǒng)計(jì)富集區(qū)域在基因不同區(qū)域上的分布 運(yùn)用MACS 軟件定位peak 的位置相關(guān)信息,對(duì)peak 位置進(jìn)行基因功能分類(lèi)(upstream2k:轉(zhuǎn)錄上游2 000 bp 區(qū);5'UTR:5' 端非翻譯區(qū);CDS:編碼序列區(qū);Intron:內(nèi)含子區(qū);3'UTR:3'端非翻譯區(qū);downstream2k:轉(zhuǎn)錄下游2 000 bp 區(qū))。如圖1 所示,多數(shù)的peak 分布在Intron 區(qū)(約51%)。
2.4 統(tǒng)計(jì)兩組間差異甲基化基因數(shù) 根據(jù)差異的reads數(shù)量,將差異的基因分為高甲基化基因和低甲基化基因,并定位到基因元件上。如圖2 可見(jiàn),在Ctr 組和LPS 組不同基因元件上共鑒定出217 個(gè)低甲基化基因和506 個(gè)高甲基化基因,其中在LPS 組每個(gè)不同基因功能元件上高甲基化基因數(shù)都多于低甲基化基因數(shù)。而在LPS組和LPS+Met 組共鑒定出459 個(gè)低甲基化基因和122個(gè)高甲基化基因,其中在LPS+Met 組每個(gè)不同基因功能元件上高甲基化基因數(shù)都低于低甲基化基因數(shù)。
2.5 差異甲基化基因的GO 富集分析 基于本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),Met 能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11]。以下研究重點(diǎn)分析LPS 組和LPS+Met 組中巨噬細(xì)胞差異甲基化基因。如圖3 所示,GO 富集分析包括生物學(xué)進(jìn)程、分子功能和細(xì)胞成分3 大類(lèi)。生物學(xué)進(jìn)程中主要富集在單一生物過(guò)程(Single-Organism Process)和細(xì)胞過(guò)程(Cellular Process),細(xì)胞成分主要富集在細(xì)胞(Cell)和細(xì)胞部分(Cell Part),分子功能主要富集在結(jié)合(Binding)上。生物進(jìn)程上共富集有419 個(gè)高甲基化基因和1 576 個(gè)低甲基化基因,有517 個(gè)高甲基化基因和397 個(gè)低甲基化基因富集在分子功能,有1 277 個(gè)高甲基化基因和3 129 個(gè)低甲基化基因富集細(xì)胞組成。在3 大類(lèi)GO 富集功能上總的低甲基化基因數(shù)(3 129 個(gè))明顯多于總高甲基化基因(862 個(gè))。
圖1 Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組中peak在不同基因功能元件上的分布Ctr vs LPS
圖2 基于不同基因元件上Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組間差異甲基化基因的分布
2.6 差異甲基化基因的KEGG 功能分析 KEGG Pathway是分析peak 區(qū)域相關(guān)基因所涉及到的細(xì)胞信號(hào)通路,選擇基因富集最顯著的20 個(gè)通路來(lái)進(jìn)行分析。如圖4 所示,Q 值越小,甲基化基因富集越顯著,其中最富集的通路是Hippo 信號(hào)通路(Hippo Signaling Pathway),隨后是細(xì)胞粘附分子(Cell Adhesion Molecules)、谷氨酸能突觸(Glutamatergic Synapse)、軸突傳導(dǎo)(Axon Guidance)、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控(Regulation of Actin Cytoskeleton)、磷酸肌醇代謝(Inositol Phosphate Metabolism)等通路。
Met 作為家禽第一限制性氨基酸,又是動(dòng)物機(jī)體內(nèi)重要的甲基供體之一,在DNA 轉(zhuǎn)移酶(Dnmts)的作用下參與DNA 甲基化,在調(diào)控動(dòng)物機(jī)體免疫功能等方面發(fā)揮重要作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)Met 能緩解LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)[11],但其分子調(diào)控機(jī)制尚不明確。首先,本研究利用MeDIP-seq 技術(shù)分析Met 影響巨噬細(xì)胞炎癥中全基因組DNA 甲基化變化特征,其次,確定差異甲基化基因與生物學(xué)功能之間的關(guān)系,并初步探究Met 抑炎的分子機(jī)制。本研究結(jié)果表明,Met 能緩解LPS 誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的高甲基化水平,差異甲基化基因主要富集在Hippo 信號(hào)通路。
圖3 LPS 組與 LPS+Met 組的差異甲基化基因GO 富集結(jié)果
圖4 LPS 組與 LPS+Met 組的差異甲基化基因KEGG 富集散點(diǎn)圖
MeDIP-seq 是基于抗體富集原理進(jìn)行全基因組甲基化測(cè)序的一種高通量測(cè)序技術(shù),可以統(tǒng)計(jì)整個(gè)基因組DNA 甲基化譜的分布,并能夠高效率地檢測(cè)出全基因組中甲基化差異的區(qū)域,是目前比較不同細(xì)胞、組織或疾病個(gè)體樣本間的全基因組DNA 甲基化差異的檢測(cè)技術(shù)[12]。本研究測(cè)序結(jié)果表明,Ctr 組、LPS 組和LPS+Met 組分別 產(chǎn)生了177 730 085、176 089 330、163 741 744 個(gè)唯一比對(duì)read 數(shù),在此基礎(chǔ)上利用MACS軟件進(jìn)一步分別鑒定出160 467、169 253、163 576 個(gè)甲基化峰(peak)區(qū)域,大多數(shù)的peak 定位在基因Intron 區(qū),分析發(fā)現(xiàn)LPS 組中鑒定出的peak 數(shù)量和覆蓋比例均大于Ctr 組,而Met+LPS 組的peak 數(shù)量和覆蓋比例均小于LPS 組。結(jié)果表明LPS 組的甲基化程度高于Ctr 組,Met+LPS 組的甲基化程度低于LPS 組,添加Met 后能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞炎癥高甲基化水平。
根據(jù)peak 內(nèi)read 數(shù)量在不同基因功能元件上挖掘分析各組間的差異甲基化基因。分析結(jié)果發(fā)現(xiàn),相較于Ctr 組,LPS 組每個(gè)不同基因功能元件上的高甲基化基因數(shù)均多于低甲基化基因數(shù),而相較于LPS 組,LPS+Met 組每個(gè)不同基因功能元件上的高甲基化基因數(shù)均低于低甲基化基因數(shù)。此結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)甲基供體Met 的補(bǔ)充能夠緩解LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中基因組高甲基化水平,這與前期研究結(jié)果一致。Osorio 等[13]發(fā)現(xiàn)飼喂添加Met 飼料的荷斯坦奶牛中全基因組DNA甲基化水平程度較低。Yang 等[14]發(fā)現(xiàn)在飼糧中添加Met 的小鼠中FABP4啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平有所降低。另外一項(xiàng)相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn),給母體或斷奶后小鼠補(bǔ)充葉酸(甲基供體)飼養(yǎng),其全基因組DNA 甲基化程度降低[15]。導(dǎo)致這一類(lèi)現(xiàn)象的原因或許與DNA 甲基化轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)有關(guān)。動(dòng)物機(jī)體內(nèi)Dnmts 分為Dnmt1、Dnmt2 和Dnmt3 3 類(lèi),其 中Dnmt3 包 括3 個(gè)亞類(lèi):Dnmt3a、Dnmt3b 和Dnmt3l。Dnmt1 是維持甲基化轉(zhuǎn)移酶,Dnmt2 的甲基轉(zhuǎn)移酶活性尚不明確,Dnmt3a 和Dnmt3b 是從頭合成甲基化轉(zhuǎn)移酶,Dnmt3l 缺乏甲基化酶活性,但可以與Dnmt3a 和Dnmt3b 相互作用[16-18]。Li 等[19]研究發(fā)現(xiàn),補(bǔ)充葉酸能通過(guò)下調(diào)Dnmt1和Dnmt3a的表達(dá)而誘導(dǎo)高脂飼糧小鼠中肥胖相關(guān)基因低甲基化。另外,Kohno 等[20]研究發(fā)現(xiàn)Dnmt3a在動(dòng)物體內(nèi)調(diào)控能量代謝穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重大作用。Dnmt1和Dnmt3b基因可介導(dǎo)炎癥反應(yīng)中炎癥基因的表達(dá)[21-23]。探索各類(lèi)甲基轉(zhuǎn)移酶在Met 介導(dǎo)DNA 甲基化調(diào)控炎癥反應(yīng)的影響值得進(jìn)一步深入研究。
本研究通過(guò)GO 富集和KEGG 對(duì)LPS 組與Met+LPS組之間的差異甲基化基因進(jìn)行分析。GO 富集分析發(fā)現(xiàn)在生物學(xué)過(guò)程(Biological Process)中差異甲基化基因主要富集在單一生物過(guò)程(Single-Organism Process)和細(xì)胞過(guò)程(Cellular Process)。GO 富集的每個(gè)生物學(xué)分類(lèi)上的高甲基化基因數(shù)均少于低甲基化基因數(shù),進(jìn)一步證實(shí)Met 能夠降低LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中基因組高甲基化水平。通過(guò)KEGG 分析發(fā)現(xiàn),甲基化基因主要富集在Hippo 信號(hào)通路上。Hippo 信號(hào)通路最早發(fā)現(xiàn)于果蠅研究中,主要是調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng),組織器官的大小以及抑制癌癥等[24]。同時(shí),Zhou 等[25]研究表明Hippo 信號(hào)通路在調(diào)節(jié)免疫功能和維持免疫穩(wěn)態(tài)方面發(fā)揮重大作用。在抑制果蠅的Hippo 信號(hào)通路情況下,果蠅會(huì)更容易被革蘭氏陽(yáng)性菌感染,致死率提高[26]。Wang 等[27]研究表明不同的血流模式可通過(guò)調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的Hippo 信號(hào)通路來(lái)抑制炎癥并緩解動(dòng)脈粥樣硬化的形成。IL-4/IL-13 誘導(dǎo)M2 巨噬細(xì)胞極化和LPS/IFN-γ誘導(dǎo)的M1 巨噬細(xì)胞極化可以通過(guò)Hippo 信號(hào)來(lái)調(diào)節(jié)[28]。抑制Hippo 信號(hào)通路,能增強(qiáng)LPS/TLR4 介導(dǎo)NF-κB 信號(hào)通路的活化,增加促炎因子IL-6 和TNF-α的表達(dá)[29]。Hippo 通路還參與腫瘤免疫反應(yīng),其關(guān)鍵蛋白Yap 活化有助于腫瘤細(xì)胞逃脫免疫系統(tǒng)的清除[30]。
本研究運(yùn)用MeDIP-seq 技術(shù)發(fā)現(xiàn),Met 能緩解LPS 誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞DNA 高甲基化水平,差異甲基化基因主要富集在Hippo 信號(hào)通路。通過(guò)本研究分析有助于初步理解Met 抑炎的分子調(diào)控機(jī)制,在畜禽生產(chǎn)中為Met 調(diào)控機(jī)體免疫功能提供一定的理論基礎(chǔ)。