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    不同毛色綿羊皮膚組織中MC1R、Agouti 及TYR 基因差異表達研究

    2021-01-20 08:08:56薛麗娜羅惠娣周勝花毛楊毅
    中國畜牧雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:毛色黑素黑色素

    薛麗娜,羅惠娣,周勝花,王 曦,毛楊毅

    (山西農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,山西太谷 030032)

    動物毛色是由2 種黑色素(真黑素和褐黑素)的比例和分布不同造成并顯示多樣性,其中約有150 個基因通過不同信號通路形成錯綜復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控這一過程[1-2]。目前,對黑色素合成的研究主要集中在α-MSH 誘導(dǎo)信號通路,即促黑色素細胞激素(α-MSH)和腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)與黑色素細胞膜上的黑素皮質(zhì)激素受體1(MC1R)結(jié)合,激活環(huán)磷酸腺苷(cAMP)系統(tǒng),經(jīng)過一系列級聯(lián)反應(yīng)活化酪氨酸酶(TYR),催化酪氨酸合成真黑素。當TYR 活性弱時,產(chǎn)生褐黑素[3-4]。在該信號通路中,Agouti基因編碼的鼠灰信號蛋白(ASIP)與α-MSH 競爭結(jié)合MC1R,抑制cAMP 系統(tǒng)激活,從而導(dǎo)致真黑色素合成減少,褐黑色素相對含量增加[5]。前人已對該信號通路中MC1R、Agouti及TYR基因發(fā)揮的重要作用開展了深入探索,但關(guān)于其互作關(guān)系的研究鮮有報道。

    動物毛色是品種鑒定的重要依據(jù)[6],也是一種重要的經(jīng)濟性狀,研究毛色機制有助于培育出符合市場需求的新品種[7]。在綿羊中,全黑被毛綿羊較為少見,本實驗以特定雜交模式產(chǎn)生的黑色綿羊為模型,以該群體中白色綿羊為對照,建立qRT-RCR 反應(yīng)體系,系統(tǒng)分析綿羊MC1R、Agouti及TYR基因mRNA 在不同毛色綿羊皮膚組織的差異表達情況,旨在闡明該雜交模式下黑色綿羊皮膚中黑色素形成的內(nèi)在調(diào)控機理,為更加科學(xué)利用綿羊毛色提供理論依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料 前期關(guān)于雜交改良本地綿羊肉品質(zhì)的研究中[8],發(fā)現(xiàn)以黑頭杜泊(公)與本地白色綿羊(母)雜交產(chǎn)生的花臉羊為母本,以薩??藶楦副?,雜交產(chǎn)生的后代中有一小部分是全黑色被毛綿羊,本研究隨機選取黑色綿羊和該群體中白色被毛綿羊各4 只作為供試綿羊(圖1)。

    為消除非遺傳因素(年齡、飼喂、季節(jié))對毛色的影響[9],實驗于2019 年10 月在山西省廣靈縣同羊農(nóng)牧有限公司羊場進行,隨機選取同一年齡供試綿羊,背部皮膚凈毛后,用梳齒鑷夾起皮膚同時用手術(shù)刀割取長寬約1 cm 皮膚組織,完全浸入無酶管中的RNAwait 樣本保存液,4℃過夜保存,然后從RNAwait 中取出皮膚組織塊,-80℃長期保存,用于RNA 提取實驗。

    圖1 不同被毛顏色綿羊

    1.2 主要試劑 RNAwait(非凍型組織RNA 保存液)(Solarbio,北京)、Eastep?Super Total RNA Extraction Kit(Promega,上海)、PCR MasterMix (中科瑞泰生物科技有限公司,北京)、50×TAE 緩沖液(Solarbio,北京)、D2000 DNA Ladder(中科瑞泰生物科技有限公司,北京)、GoScriptTMReverse Transcription System(Promega,上海)、QuantiNova SYBR Green PCR Kit(QIAGEN,德國)。

    1.3 實驗方法

    1.3.1 總RNA 的提取 將-80℃保存的皮膚組織液氮研磨,提取總RNA 的皮膚組織的重量、所加試劑的體積及提取步驟參見Eastep?Super 總RNA 提取試劑盒說明。用核酸蛋白測定儀檢測RNA 的濃度和純度,用1%瓊脂糖凝膠在室溫恒壓180 V 電泳 5~10 min,檢測總RNA 的完整性。

    1.3.2 cDNA 的合成 將所提取的RNA 濃度均稀釋成10 μL 總體積含1 μg RNA。按 照GoScriptTMReverse Transcription System 說明建立反轉(zhuǎn)錄體系20 μL:gDNA GoScriptTMReaction Buffer Oligo(dT) (0.5 μg/reaction) 4 μL、Nuclease-Free Water 4 μL、GoScriptTMEnzyme Mix 2 μL、上述 RNA 稀釋液10 μL,混勻后置于PCR 儀中,反應(yīng)條件:退火25℃ 5 min;延伸42℃6 min;失活70℃ 15 min。cDNA 在-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

    1.3.3 引物設(shè)計與合成 根據(jù)NCBI 查找的MC1R、Agouti、TYR及GAPDH基因mRNA 序列,參照孟浩浩[9]和李洪濤[10]等用Primer5.0 軟件設(shè)計引物,所有引物退火溫度均為60℃,由上海生工生物工程有限公司合成,引物信息如表1 所示。

    1.3.4 熒光定量PCR 引物特異性驗證 以cDNA 為模板,根據(jù)2×Taq PCR MasterMix 的說明,建立50 μL 的反應(yīng)體系:上下游引物(10 μmol/μL)各1 μL,2×MasterMix 25 μL,cDNA 2 μL,RNase Free dH2O 21 μL。反應(yīng)條件:94℃ 5 min(預(yù)變性階段);94℃ 30 s,60℃ 30 s,72℃30 s,共35 個循環(huán)(PCR 反應(yīng)階段);72℃ 5 min。擴增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠在室溫恒壓120 V 電泳 30 min。

    1.3.5 qRT-PCR 檢測 以cDNA 為模板,根據(jù)QuantiNova SYBR Green PCR Kit 試劑盒說明,建立20 μL 的反應(yīng)體系:擴增基因的上下游引物(10 μmol/μL)各0.4 μL,2×SYBR Green PCR Master Mix 10 μL,cDNA 模板2 μL,RNase-Free water 7.2 μL。反應(yīng)條 件:95 ℃ 3 min(預(yù)變性階段);95℃ 5 s,60℃ 20 s,共35 個循環(huán)(PCR反應(yīng)階段);熔解階段溫度從50℃至95℃,每5 s 升高1℃。

    1.4 統(tǒng)計分析 qRT-PCR 實驗為每組4 個樣本,每個樣本重復(fù)3 次,所得CT 值經(jīng)GAPDH 校正,按照2-ΔΔCT的計算方法算出目的基因mRNA 的相對表達量,所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標準差表示。采用單因素方差分析和顯著性檢驗的方法,利用SPSS 18.0 軟件對數(shù)據(jù)進行分析,運用GraphPad Prism 8 軟件繪制柱形圖。P<0.01表示差異極顯著,P<0.05 表示差異顯著,P>0.05 表示差異不顯著。

    2 結(jié)果

    2.1 總RNA 質(zhì)量檢測 核酸蛋白濃度儀檢測結(jié)果顯示,樣本總RNA 濃度均大于100 ng/μL,A260/A280都是1.9~2.1,說明提取RNA 濃度和純度較高。提取產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測,從圖2 可以看出8 個樣本提取RNA 質(zhì)量較好,符合后續(xù)實驗要求。

    2.2 熒光定量PCR 引物特異性驗證凝膠電泳檢測 由圖3可知,MC1R、Agouti、TYR、GAPDH基因在退火溫度60℃條件下,擴增效果良好,沒有非特異性擴增,可進行后續(xù)實時熒光定量PCR 實驗。

    表1 熒光定量PCR 引物序列

    圖2 綿羊皮膚組織總RNA 瓊脂糖凝膠電泳圖

    圖3 4 個基因PCR 產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳圖

    2.3MC1R、Agouti、TYR及內(nèi)參基因GAPDH的qRTPCR 擴增曲線及熔解曲線 采用qRT-PCR 對MC1R、Agouti、TYR及GAPDH基因進行擴增,熔解及擴增曲線如圖4 所示,所有熔解曲線溶解溫度在80~90℃且均為單一峰,表明引物特異性較好,無引物二聚體和非特異擴增。各引物的擴增曲線拐點平滑,擴增效果良好,說明本實驗結(jié)果可靠。

    圖4 4 個基因熔解曲線圖及擴增曲線圖

    2.4 不同毛色綿羊皮膚中MC1R、Agouti、TYR基因相對表達量 qRT-PCR 結(jié)果表明,不同毛色綿羊皮膚中MC1R、Agouti及TYR基因mRNA 均有表達(圖5)。MC1R基因mRNA 在黑色綿羊皮膚中表達量高于白色綿羊(P>0.05)。Agouti基因mRNA 在白色綿羊皮膚中的表達量顯著高于黑色綿羊皮膚(P<0.05)。TYR基因mRNA 在黑色綿羊皮膚中表達量是白色綿羊皮膚的34 倍(P<0.01)。

    圖5 MC1R、Agouti 及TYR 基因mRNA 在不同毛色綿羊皮膚中的相對表達量

    3 討 論

    綿羊毛色是一個重要的生產(chǎn)性狀[11]。綿羊毛色主要有白色、黑色、褐色和斑塊狀雜色[12]。在白色羊毛中不含或含少量褐黑素,褐色和黑色羊毛則含有黑色素或2 種色素的混合,完全黑色的綿羊較為少見。山西地方品種綿羊一般為白色,前期研究發(fā)現(xiàn)在與外來品種雜交后部分為黑色[8]。

    MC1R基因編碼的蛋白屬于G 蛋白耦合受體家族,多表達于黑色素細胞膜上。大多數(shù)動物MC1RR基因的差異表達能夠引起毛色改變,如雞、牦牛、兔、羊駝和山羊等[13-17]。前人在綿羊及哈薩克羊中的研究也顯示,MC1R基因在黑羊皮膚中表達量極顯著高于白羊皮膚[18,10],其機制可能是MC1R 能激活TYR 而保持較高活性,最終合成更多的真黑素,產(chǎn)生深色被毛[19]。曹俊婷等[20]在略陽雞皮膚組織中發(fā)現(xiàn),MC1RR基因差異表達與白色和烏色不相關(guān),而韓吉龍[11]認為藏羊皮膚中MC1RR基因在白色被毛皮膚中表達量顯著高于純黑被毛皮膚。本研究發(fā)現(xiàn)MC1RR基因在黑色綿羊中表達量略高于白羊,但與毛色不相關(guān),這與曹俊婷等[19]的研究結(jié)果一致,說明MC1RR基因不是調(diào)控毛色的基因。綜上所述,在不同物種及不同品種中調(diào)控毛色的基因可能有所不同。

    Agouti基因2、3、4 外顯子編碼的ASIP 蛋白為分泌蛋白,可通過競爭性結(jié)合黑色素細胞膜上MC1R 受體而使其合成更多的褐黑素,使動物表現(xiàn)為淺色被毛[21]。張?zhí)斓萚22]研究表明,山羊Agouti基因在白色毛色皮膚中表達量最高。Royo 等[23]研究認為白色被毛西班牙Xalda 綿羊皮膚Agouti基因表達量顯著高于黑色被毛。本研究發(fā)現(xiàn),Agouti基因在白色綿羊中的表達量顯著高于黑色綿羊,說明Agouti為調(diào)控毛色的基因,這與前人研究結(jié)果一致。

    TYR 為色素合成過程中的限速酶,與黑色素合成相關(guān)[11]。當MC1R 功能喪失或MC1R 受到與其拮抗的ASIP 抑制時,TYR 不能被激活而保持較低活性,使得真黑素含量下降,動物表現(xiàn)為淺色被毛[24]。這在越背花毛蒙古馬[25]、斑嘴野鴨[26]中得到了證實。本研究中,TYR基因mRNA 在黑色綿羊皮膚中表達量極顯著高于白色綿羊,這與前人研究結(jié)果一致。結(jié)合其上游基因Agouti的表達情況推測,造成綿羊黑色毛色性狀可能是由于在黑色綿羊中Agouti基因的低表達,而使TYR 被激活而有較高活性,導(dǎo)致真黑素含量較高。同時本研究發(fā)現(xiàn)2 種綿羊毛色中TYR基因表達量相差34 倍,而黑線倉鼠皮膚中的TYR基因相對表達量僅為白化突變系皮膚組織中的2.5 倍[27],這說明可能還有其他因素導(dǎo)致TYR基因表達上調(diào)。黑色素合成是一個復(fù)雜而精密的調(diào)節(jié)過程,有多種基因參與其中,而每個基因又會受到DNA 堿基突變、轉(zhuǎn)錄因子、非編碼RNA、表觀遺傳調(diào)節(jié)因子等作用[28-30],因此,造成TYR基因表達量相差如此之大的具體分子機制還有待后續(xù)研究。

    4 結(jié) 論

    本研究結(jié)果顯示,MC1R基因在黑色綿羊皮膚中表達量高于白色綿羊,Agouti基因在白色綿羊皮膚組織中的表達量顯著高于黑色綿羊,TYR基因在黑色綿羊皮膚中表達量極顯著高于白色綿羊。結(jié)合這3 個基因的相互關(guān)系推測,特定雜交模式下產(chǎn)生的黑色綿羊可能是由于Agouti基因表達量低而使α-MSH 誘導(dǎo)信號通路處于激活狀態(tài),上調(diào)了TYR基因表達量,導(dǎo)致真黑素含量上升,出現(xiàn)黑色毛色性狀。

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