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    CD81、CCL26 基因在黔北麻羊不同性腺組織中的表達(dá)研究

    2021-01-20 08:08:56惠茂茂周志楠
    中國畜牧雜志 2021年1期
    關(guān)鍵詞:黔北性腺下丘腦

    惠茂茂,周志楠,敖 葉,唐 文,洪 磊,陳 祥*

    (1.貴州大學(xué)高原山地動物遺傳育種與繁殖教育部重點實驗室,貴州省動物遺傳育種與繁殖重點實驗室,貴州貴陽 550025;2.貴州大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院,貴州貴陽 550025)

    黔北麻羊是貴州三大地方山羊品種之一[1],屬短毛皮肉兼用品種,具有適應(yīng)性強(qiáng)、繁殖率高、產(chǎn)肉性能良好等優(yōu)點[2]。四跨膜蛋白超家族(TM4ST)是一組分子量在20~50 ku 的細(xì)胞膜蛋白[3]。CD81S屬于四跨膜蛋白超家族,是細(xì)胞內(nèi)外信號傳遞的重要橋梁。根據(jù)自身具有的黏附效應(yīng),CD81在卵母細(xì)胞發(fā)育過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。聶青和[4]研究發(fā)現(xiàn)在不同孕期胎盤絨毛組織中CD81基因的表達(dá)量不相同。據(jù)相關(guān)研究發(fā)現(xiàn),CD81基因參與卵泡發(fā)育及排卵的調(diào)控過程[5]。此外,CD81基因也在大腦發(fā)育[6]、神經(jīng)視網(wǎng)膜細(xì)胞的介導(dǎo)[7]、丙型肝炎病毒(HCV)感染[8]等方面也發(fā)揮相當(dāng)大的作用。

    趨化因子是一類目前為止數(shù)量最多、具有趨化吸引性的蛋白分子,在腫瘤的發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著重要作用[9]。CCL26基因是趨化因子中的一類,在嗜酸性粒細(xì)胞表面表達(dá)量最高[10-11]。有研究表明,趨化因子CCL26基因與結(jié)腸癌的轉(zhuǎn)移有重要關(guān)聯(lián)[12]。趨化因子對妊娠也影響甚大。在子宮內(nèi)膜被侵入滋養(yǎng)細(xì)胞過程中趨化因子可促血管生成因子,直接影響胎盤發(fā)育[13]。目前CCL26基因與動物繁殖性能的相關(guān)研究較少。本實驗旨在探究趨化因子對動物性腺細(xì)胞的直接或間接影響表達(dá),以單、多羔黔北麻羊為研究對象,通過檢測CD81、CCL26基因在組織中的差異表達(dá)量,為進(jìn)一步探討2 個基因?qū)ι窖蚍敝车挠绊懱峁┗A(chǔ)。

    1 材料與方法

    1.1 實驗動物 由貴州省習(xí)水縣富興畜牧業(yè)開發(fā)有限公司提供6 只健康單、多羔黔北麻羊母羊,進(jìn)行屠宰后分別采取下丘腦、垂體、子宮、輸卵管和卵巢5 個部分性腺組織,液氮保存運(yùn)回實驗室備用。

    1.2 實驗試劑 TRIzol@Reagent 試劑盒購自貴州綠盟英創(chuàng)生物科技有限公司;熒光定量試劑q-PCR Mix 購自擎科生物科技有限公司;逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

    1.3 主要儀器 移液槍:德國Eppendprf 公司;紫外可見分光光度計,購自美國Thermo Fisher 有限公司;電泳儀(DYY-2C 型),購自北京市六一儀器廠;PCR 擴(kuò)增儀(C1000 TouchTM)、實時熒光定量PCR 儀(型號為CFX96 Real-Time System)、凝膠成像系統(tǒng)(Universal Hood Ⅱ),均購自美國BIO-RAD 有限公司。

    1.4 實驗方法

    1.4.1 引物設(shè)計 根據(jù)GenBank 公布的山羊CD81基因序列(登錄號: NM_001285676.1);CCL26基因序列(登錄號:XM_005697796.3)利用Primer Premier 5.0 軟件進(jìn)行引物設(shè)計,將β-actin作為內(nèi)參基因。設(shè)計引物后交上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)股份有限公司合成。引物基本信息見表1。

    表1 黔北麻羊CD81、CCL26 引物信息

    1.4.2 RNA 的提取 根據(jù)TRIzol@Reagent 試劑盒說明書分別提取下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢5 個組織中RNA。并用超微量分光光度計測定其濃度和純度,將峰圖單一、曲線平滑、OD260/OD280比值在1.8~2.0 的RNA 保存于-80℃冰箱,用于后續(xù)逆轉(zhuǎn)錄實驗。

    1.4.3 cDNA 的合成 采用Transcriptor First Strand cDNA Synthesis Kit 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將提取的RNA 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 第一鏈。反轉(zhuǎn)錄體系的體積為20 μL:dNTP mix(2.5 mmol/L Each) 4 μL,Primer mix 2 μL,RNA 模板2 μL,5×RT Buffer 4 μL,DTT(0.1 mol/L) 2 μL,HiFi Script 1 μL,RNase-Free ddH2O 5 μL。PCR 反應(yīng)條 件為42℃孵育50 min,85℃孵育5 min 于-20℃冰箱保存。

    1.4.4 實時熒光定量q-PCR 10 μL 反應(yīng)體系:cDNA 模板1 μL,SYBR Premix Ex Taq TM 酶(2×)5.5 μL,上、下游引物(10μmol/μL)各0.5 μL,ddH2O 2.5 μL。q-PCR程序:95℃預(yù)變性 1 min,95℃變性15 s,退火15 s,60℃延伸32 s,39 個循環(huán),熔解曲線由機(jī)器自動設(shè)置,每個實驗設(shè)計3 個重復(fù)并設(shè)置陰性對照。

    1.4.5 統(tǒng)計分析利用2-ΔΔCt相對定量法[14]計算目的基因的相對表達(dá)量。使用SPSS 23.0 軟件中One-Way ANOVA 進(jìn)行單因素方差分析,使用LSD 法進(jìn)行差異顯著性檢驗,試驗結(jié)果采用平均值± 標(biāo)準(zhǔn)差來表示,P<0.05 為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn),以P<0.01 作為差異極顯著性的判斷標(biāo)準(zhǔn)。

    2 結(jié)果

    2.1CD81、CCL26基因的擴(kuò)增黔北麻羊CD81、CCL26基因擴(kuò)增結(jié)果如圖1 所示。經(jīng)過PCR 擴(kuò)增,CD81基因大小為129 bp,CCL26基因大小為167 bp。與預(yù)測片段大小一致,且條帶清晰、單一,無非特異性擴(kuò)增,證明目的基因CD81、CCL26熒光定量引物特異性良好,可做下一步實驗研究。

    圖1 CD81(A)、CCL26(B)基因擴(kuò)增圖像

    2.2CD81、CCL26基因在黔北麻羊單、多羔不同性腺中表達(dá)分析

    2.2.1CD81基因在黔北麻羊單、多羔不同組織的表達(dá)分析 如圖2 所示,CD81基因在黔北麻羊單、多羔5 個組織中均有不同程度表達(dá)。在單羔組內(nèi),CD81基因在卵巢中的表達(dá)量最高,其次為輸卵管、垂體、下丘腦,在子宮中的表達(dá)量最低;在卵巢中的表達(dá)量極顯著高于其他組織;垂體、輸卵管表達(dá)量極顯著高于下丘腦、子宮。在多羔組內(nèi),CD81基因在卵巢中的表達(dá)量最高,其次為垂體、子宮、輸卵管,在下丘腦中的表達(dá)量最低;卵巢表達(dá)量極顯著高于其他組織;垂體與輸卵管、下丘腦表達(dá)量差異極顯著。CD81基因mRNA 在子宮多羔組中的表達(dá)量顯著高于單羔組,其余組間無顯著差異。

    圖2 CD81 基因在黔北麻羊單、多羔不同組織中的表達(dá)

    2.2.2CCL26基因在黔北麻羊、多單羔不同組織的表達(dá)分析 如圖3 所示,CCL26基因在黔北麻羊單、多羔不同組織的表達(dá)量各不同。單、多羔組均在卵巢組織表達(dá)量最高,下丘腦表達(dá)量最低;單羔中各組織的表達(dá)量普遍高于多羔。單羔組內(nèi),CCL26基因在卵巢、輸卵管和子宮的表達(dá)量極顯著高于下丘腦和垂體表達(dá)量。多羔組內(nèi),CCL26基因在卵巢、輸卵管組織表達(dá)量極顯著高于下丘腦、垂體、子宮,在垂體、下丘腦、子宮間差異不顯著。CCL26基因在單羔組子宮的表達(dá)量極顯著高于多羔組;在單羔組輸卵管和卵巢的表達(dá)量顯著高于多羔組。

    3 討 論

    圖3 CCL26 基因在黔北麻羊單、多羔不同組織中的表達(dá)

    3.1 各組織中CD81基因表達(dá)量的變化情況CD81是機(jī)體內(nèi)分布廣泛、參與各種生理應(yīng)答的跨膜蛋白分子,在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗原呈遞、細(xì)胞融合等機(jī)制中發(fā)揮重要作用,目前對于這一基因的研究越來越廣泛[15]。有研究證明慢性肝病的發(fā)生是由于丙型肝炎病毒(HCV)感染導(dǎo)致的,其中CD81基因直接或間接參與了整個病毒感染機(jī)制的發(fā)生[16]。Rubinstein 等[17]研究發(fā)現(xiàn),在小鼠卵母細(xì)胞表面,CD81基因與富含跨膜蛋白的膜相關(guān)聯(lián),缺乏CD81基因會導(dǎo)致小鼠雌性的生育能力缺陷。湯繼順等[18]對小尾寒羊和蘇尼特羊進(jìn)行實驗時發(fā)現(xiàn),CD81基因在14 種組織中均有高表達(dá),小尾寒羊性腺組織中下丘腦表達(dá)量最高,蘇尼特羊卵巢表達(dá)量最高,在精卵質(zhì)膜融合過程中起重要作用。何柳等[19]實驗發(fā)現(xiàn),CD81基因除了在性腺組織中高表達(dá)外,還在以獼猴為模型的肝臟、脾臟淋巴結(jié)等組織中顯著表達(dá)。Ohnami 等[20]通過小鼠免疫細(xì)胞化學(xué)分析表明,CD81廣泛分布在卵母細(xì)胞細(xì)胞膜外,參與精子卵母細(xì)胞的融合。Jankovicova 等[21]在比較豬和牛卵母細(xì)胞中CD81的定位過程中發(fā)現(xiàn),此基因在卵母細(xì)胞成熟和胚胎早期發(fā)育過程能夠高度表達(dá)。本實驗發(fā)現(xiàn),CD81基因在黔北麻羊單多羔中都有表達(dá),CD81基因在單多羔卵巢組織表達(dá)量最高,且均極顯著高于其他組織,這與相關(guān)實驗結(jié)果[17-18,20]一致。據(jù)相關(guān)研究證明,CD81基因的過表達(dá)可提高小鼠的受精率[22]。因此可以推斷,山羊的繁殖力與CD81基因有著重要關(guān)聯(lián),尤其是卵巢組織中。CD81基因參與山羊精卵融合相關(guān)的機(jī)制推測還需進(jìn)一步證實。

    3.2 各組織中CCL26基因表達(dá)量的變化情況CCL26作為嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子,通過CCR3受體發(fā)出信號[23],而CCR3除了在嗜酸性粒細(xì)胞表達(dá)外,還在絨毛滋養(yǎng)細(xì)胞、合胞體滋養(yǎng)細(xì)胞和EVT 等表達(dá)[24]。由此猜測CCL26對于滋養(yǎng)層細(xì)胞有作用。Chau Simon 等[25]證明了CCL26在子宮中高表達(dá),調(diào)節(jié)子宮蛻膜螺旋小動脈的重塑過程,影響妊娠過程。Dominguez 等[26]從原代上皮子宮內(nèi)膜細(xì)胞收集的條件培養(yǎng)基中發(fā)現(xiàn)CCL26的存在,表達(dá)量極高。

    EoE 患者的活檢物中CCL26表達(dá)顯著增加,并且單核苷酸多態(tài)性與疾病發(fā)病率增加相關(guān)[27]。Caselli 等[28]在女性原發(fā)特異性不孕的實驗中發(fā)現(xiàn)子宮內(nèi)膜細(xì)胞上CCL26基因表達(dá)量升高。還有實驗證明CCL26基因在發(fā)情周期的第0、3、7 天在子宮內(nèi)膜中表達(dá)且第0天表達(dá)量最高[29]。本實驗發(fā)現(xiàn),在黔北麻羊性腺組織中CCL26的表達(dá)量不同,在卵巢中表達(dá)量最高,下丘腦表達(dá)量最低,垂體、子宮、卵巢表達(dá)量居中。目前CCL26基因引發(fā)炎癥反應(yīng)的研究居多,而在性腺組織的相關(guān)性研究較少,尤其是在動物為模型的相關(guān)實驗。本實驗CCL26基因子宮也在山羊中高表達(dá),與Chau Simon 等[25]、Dominguez 等[26]研究結(jié)果一致。通過CCL26在性腺組織中的表達(dá)量高低推測CCL26可能調(diào)控山羊的繁殖,但具體機(jī)理有待進(jìn)一步研究。

    4 結(jié) 論

    通過對黔北麻羊下丘腦、垂體、子宮、輸卵管、卵巢5 個組織CD81和CCL26基因的熒光定量分析,表明2 種基因在山羊單多羔中都有不同表達(dá),在卵巢中表達(dá)量最高;CD81在單羔下丘腦組織、雙羔下丘腦組織表達(dá)量最低,CCL26在單多羔下丘腦組織表達(dá)量最低。CCL26基因在單羔組子宮的表達(dá)量極顯著高于多羔組。結(jié)果證明2 種基因可能影響性腺發(fā)育,參與山羊繁殖調(diào)控,為進(jìn)一步研究基因功能提供依據(jù)。

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