自然發(fā)酵分離乳酸菌發(fā)酵紅甜菜過程中品質(zhì)及抗氧化能力變化

李垚，郭瑞，閆明哲，王萍,2

（1.東北林業(yè)大學林學院，黑龍江哈爾濱 150040）

（2.黑龍江省森林食品資源利用重點實驗室，黑龍江哈爾濱 150040）

紅甜菜（Beta vulgarisL. subsp.vulgais），又名食用甜菜、紫菜頭、火焰菜，為藜科（Chenopodiaceae），甜菜屬（Beta），二年生草本植物，能夠形成肥大的肉質(zhì)根[1]。主要產(chǎn)于英國、北美、以及中美洲地區(qū)，多用于菜肴烹飪[2,3]。我國也有少量種植，多數(shù)用于園林觀賞植物和色素提取原料[4]。紅甜菜色澤鮮艷、肉質(zhì)脆嫩，且營養(yǎng)豐富。除富含礦物質(zhì)和糖類物質(zhì)外，還含有種類豐富的維生素和錳、銅、鉬、碘等微量元素以及皂角苷、甜菜苷等生物活性物質(zhì)[5]。同時，由于紅甜菜中富含酚類物質(zhì)和甜菜苷，因此，不僅有良好的抗氧化能力[6]，還具有保肝、抗衰老[7]、降血壓[8]、降血脂[9]、抗炎[10]、抗疲勞[11]等作用。具有良好的開發(fā)利用價值。另外，經(jīng)過發(fā)酵后，食品保質(zhì)期得到延長，營養(yǎng)價值得以改善，一些發(fā)酵原料含有抗營養(yǎng)因子和有毒物質(zhì)也可以顯著去除[12-14]。同時，發(fā)酵過程中可以賦予產(chǎn)品特殊的風味[15]。

作為一種傳統(tǒng)的食材，紅甜菜主要被加工成泡菜[16]、復合果蔬汁[17]等產(chǎn)品。另外，由于其含有豐富的甜菜紅素，因此在食品加工過程中作為天然色素。近年來，隨著微生物發(fā)酵技術(shù)的發(fā)展和廣泛應用，一些以紅甜菜作為原輔料的發(fā)酵產(chǎn)品也應運而生，如紅甜菜果醋[18]、紅甜菜酸乳[19]等。這些產(chǎn)品多數(shù)使用接種發(fā)酵方式，接種發(fā)酵使得發(fā)酵基質(zhì)更快的酸化并擁有穩(wěn)定、安全且已知的微生物群落，不但減少自然發(fā)酵過程所用的大量時間，減少不需要的微生物種群出現(xiàn)，降低生物毒性化合物污染發(fā)酵產(chǎn)品的風險[20,21]。由于接種發(fā)酵所用的發(fā)酵菌種或發(fā)酵劑來源的多樣性，很難滿足特定發(fā)酵基質(zhì)的發(fā)酵要求。為了保證發(fā)酵高效的進行，在接種前需要花費時間對菌種或發(fā)酵劑進行馴化培養(yǎng)。將自然發(fā)酵與人工接種發(fā)酵方法相結(jié)合，為解決該問題提供了一種可選方案。

本研究使用分離自紅甜菜自然發(fā)酵液中的菌種對不同形態(tài)的紅甜菜基質(zhì)進行發(fā)酵，并對發(fā)酵過程中pH與總酸、乳酸菌活菌數(shù)、活性物質(zhì)含量、抗氧化能力變化進行跟蹤研究。旨在了解接種自然發(fā)酵菌種的紅甜菜發(fā)酵液在發(fā)酵過程中化學和微生物指標、植物活性成分和體外抗氧化能力的變化，為促進紅甜菜資源的加工、新產(chǎn)品的開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紅甜菜，購自吉林省長春市。

植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸腸球菌（Enterococcus lactis），分離純化自紅甜菜自然發(fā)酵液，東北林業(yè)大學食品微生物實驗室保存。

福林酚、DPPH、TPTZ、瓊脂購自Sigma公司；ABTS購自Biotopped公司；牛肉膏、蛋白胨、酵母膏購自北京奧博星生物科技有限公司；其他藥品試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 主要儀器與設備

SW-CJ-2D雙人無菌操作臺，上海尚道儀器制造有限公司；PHS-3C型精密pH計，上海精密儀器有限公司；303-00A電熱恒溫培養(yǎng)箱，天津天泰儀器有限公司；PC722s分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；DK-S12電熱恒溫水浴鍋，上海森信試驗儀器有限公司；TDL-5臺式離心機，上?？婆d儀器有限公司；全波長酶標儀，美國伯騰儀器有限公司；5030-PVL高壓滅菌鍋，長春百奧生物儀器有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 發(fā)酵菌種的活化

將植物乳桿菌、乳酸腸球菌分別接種至MRS培養(yǎng)基中，置于37 ℃下培養(yǎng)24 h，進行菌種活化處理。

1.3.2 接種發(fā)酵紅甜菜樣品的制備

1.3.2.1 紅甜菜漿發(fā)酵樣品制備

將洗凈的紅甜菜與無菌水，按照料液比 1:4:5（m:m:m）打漿，量取100 mL紅甜菜漿置于150 mL具塞三角瓶中，按照10 g/100 mL加入紅糖，使用1 M NaHCO3將pH調(diào)至4.70±0.1。置于紫外燈下照射20 min。在無菌環(huán)境中分別按照6%接種量向紅甜菜漿中接入活化后的菌液（乳酸腸球菌和植物乳桿菌菌體量約為分別為6.21 log(cfu/mL)和6.18 log(cfu/mL)），密封后，置于37 ℃進行恒溫培養(yǎng)48 h，制備發(fā)酵紅甜菜漿。

1.3.2.2 紅甜菜片發(fā)酵樣品的制備

紅甜菜洗凈后去皮，切成將1 cm(H)×2 cm(W)×0.1 cm(TH)的薄片，將紅甜菜、紅糖、無菌水按照 2:1:7（m:m:m）比例加入150 mL具塞三角瓶中。使用1 M NaHCO3將pH調(diào)至4.70±0.1。置于紫外燈下照射20 min。在無菌環(huán)境中分別按照6 %接種量向紅甜菜漿中接入活化后的菌液（乳酸腸球菌和植物乳桿菌菌體量分別約為6.21 log(cfu/mL)和6.18 log(cfu/mL)），密封后，置于37 ℃進行恒溫培養(yǎng)48 h，制備紅甜菜片發(fā)酵液。

1.3.3 紅甜菜接種發(fā)酵過程指標測定

發(fā)酵過程中每間隔6 h，分別對接種植物乳桿菌和乳酸腸球菌的紅甜菜漿、紅甜菜片發(fā)酵液進行取樣，測定pH、總酸含量、乳酸菌活菌數(shù)。并對所取樣品進行5000 r/min，離心15 min，取上清液，測定總酚含量、黃酮含量、甜菜色素含量、總抗氧化能力、DPPH·清除能力、ABTS＋·清除能力。

1.4 測定方法

1.4.1 pH測定

使用pH計對樣品進行測定。

1.4.2 總酸的測定

參照《GB/T 12456-2008食品中總酸的測定》測定[22]，并參考文獻[23]，略有改動。使用電位滴定法進行測定。將5 mL紅甜菜發(fā)酵液稀釋至20 mL，通過用0.1 M NaOH溶液滴定至pH 8.2，測定樣品總酸，使用公式（1）進行計算，結(jié)果以乳酸計，每份樣品平行測定3次取平均值。

注：c-氫氧化鈉標準溶液濃度的準確數(shù)值；V1-滴定樣品時消耗的氫氧化鈉體積；V2-滴定空白組消耗氫氧化鈉體積；K-酸的換算系數(shù)（乳酸0.090）；F-樣品的稀釋倍數(shù)；m-樣品的質(zhì)量。

1.4.3 乳酸菌活菌數(shù)測定

發(fā)酵過程中，每間隔2 h進行一次取樣，并將取出的紅甜菜發(fā)酵液使用無菌生理鹽水梯度稀釋后，使用平板計數(shù)法在MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)48 h后進行觀察并計數(shù)[24]。

1.4.4 活性物質(zhì)含量的測定

1.4.4.1 總酚含量的測定

采用福林酚-肖卡法[25]測定樣品中的總酚，略有改動。將100 μL適當稀釋后的樣品加入到試管中，加水7 mL，混勻，再加入0.5 mL福林酚試劑，充分搖勻，1 min之后，加入20% Na2CO3溶液1.5 mL，混勻，最后加入0.9 mL蒸餾水。于25 ℃水浴條件下避光反應1 h。在765 nm波長測定吸光值，結(jié)果用沒食子酸當量表示。每份樣品測定3次取平均值。

1.4.4.2 黃酮含量的測定

根據(jù)Veronica等人的方法[26]，略有改動。取0.5 mL待測樣品，加入30%乙醇溶液至5 mL，加入0.3 mL 5%的NaNO2溶液，混勻，6 min后，加入10 % Al(NO3)3溶液0.3 mL，靜置6 min，加入4 mL 1 M NaOH溶液，反應15 min后于510 nm下測定吸光值，結(jié)果用蘆丁當量表示。每組樣品平行測定3次，取其平均值。

1.4.4.3 甜菜色素含量的測定

根據(jù)Kumar等人的方法[27]，略有改動，測定樣品中的紅甜菜色素，將樣品以5000 r/min離心15 min，取上清液進行測定。將1 mL樣品加入30 mL蒸餾水中稀釋，振蕩10 s使其混勻。使用UV/VIS分光光度計在476 nm和538 nm讀取數(shù)值，分別用來分析甜菜黃素和甜菜紅素。另外，使用600 nm波長校正可能存在的雜質(zhì)。使用以公式（2）進行計算：

注：A-在476 nm或538 nm處的吸光度讀數(shù)與600 nm處讀數(shù)的差值；FD-稀釋因子；I-為比色皿光路長度；MM-色素分子量，甜菜紅素550 g/mol，甜菜黃素308 g/mol；?-摩爾吸光系數(shù)甜菜紅素 60000 L/(mol·cm)，甜菜黃素 48000 L/(mol·cm)。

1.4.5 抗氧化能力的測定

1.4.5.1 DPPH·清除能力測定

參考楊玲的方法[28]，并稍有改動。移取樣品50 μL加入0.1 mM的DPPH·-乙醇溶液4 mL，避光反應30 min，以去離子水為參比，在517 nm波長下測定吸光值；對照組用4 mL無水乙醇代替0.1 mM DPPH·，空白組用50 μL無水乙醇代替樣品，測定吸光值，根據(jù)公式（3）計算清除率，每組樣品平行測定3次取平均值。

注：A1-樣品組吸光值；A2-對照組吸光值；A3-空白組吸光值。

1.4.5.2 總抗氧化能力的測定

采用鐵離子還原能力測定法（FRAP）[29]測定樣品的總抗氧化能力。FRAP工作液的配制：取2.5 mL TPTZ溶液（用40 mM HCl配置成濃度為10 mM的TPTZ-HCl溶液），25 mL醋酸（100 mM，pH 3.6），2.5 mL FeSO4·6H2O（20 mM），充分混勻。

總抗氧化能力的測定：取 20 μL樣品，180 μL FRAP工作液加入96孔板中，以200 μL蒸餾水為空白對照，在37 ℃下水浴5 min，于593 nm波長下測定樣品吸光值。每組樣品平行測定3次取平均值。根據(jù)標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力。

1.4.5.3 ABTS＋·清除能力測定

根據(jù)G A Garzón[30]等人的方法，略有改動。向試管中加入0.2 mL樣品液，4.0 mL ABTS＋·工作液（7.4 mmol/L ABTS＋·溶液與 2.6 mmol/L K2S2O8溶液按照1:1（V:V）混合得到，黑暗處反應12 h，使用pH 7.4磷酸緩沖溶液稀釋 40～50倍，使 A734=0.7±0.02）。充分搖勻后，靜置6 min，在734 nm下測得吸光度A，空白對照為A0，按公式（4）計算：

1.5 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與討論

2.1 紅甜菜發(fā)酵過程中的pH變化

圖1 紅甜菜發(fā)酵過程中pH變化Fig.1 Change of pH in the red beetroot fermentation

由圖1可以看出，隨著發(fā)酵時間的延長，所有發(fā)酵物的pH均呈現(xiàn)先快速下降，隨后下降速度放緩的趨勢?？傮w來看，乳酸腸球菌和植物乳桿菌pH下降程度相當，但相比之下，乳酸腸球菌pH下降更加迅速，而植物乳桿菌pH下降略顯平緩，同樣是下降至pH 4.4左右，使用植物乳桿菌發(fā)酵需要24 h，而乳酸腸球菌僅需6 h。在0～48 h的發(fā)酵過程中，乳酸腸球菌發(fā)酵紅甜菜漿、乳酸腸球菌紅甜菜片發(fā)酵液、植物乳桿菌發(fā)酵紅甜菜漿、植物乳桿菌紅甜菜片發(fā)酵液pH由5.39分別降至3.95、4.21、4.25和4.08。結(jié)合發(fā)酵基質(zhì)的狀態(tài)進行比較能夠看出，乳酸腸球菌發(fā)酵漿的pH下降幅度最大、下降速度最快；而植物乳桿菌發(fā)酵液則呈現(xiàn)相反的情況。這可能由于不同的微生物對于發(fā)酵基質(zhì)狀態(tài)的適應程度不同，進而導致了這種情況的發(fā)生。

2.2 紅甜菜發(fā)酵過程中總酸的變化

圖2 紅甜菜發(fā)酵過程中總酸含量的變化Fig.2 Titratacble acidity content of fermented red beetroot

通過圖2可以看出，乳酸腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵液中的總酸含量均顯著增加（p＜0.05），乳酸腸球菌發(fā)酵的樣品中總酸含量快速增加的時間段主要在發(fā)酵周期的前6 h，而植物乳桿菌在發(fā)酵周期的前18 h。這可能與原料中大量的有機酸溶出以及乳酸菌代謝消耗糖產(chǎn)生了有機酸有關(guān)[31,32]。通過圖2可以看出，相比植物乳桿菌發(fā)酵液，乳酸腸球菌發(fā)酵液中總酸含量較高，最高達16.78±0.43 g/kg，這與pH變化的趨勢是相符的。對比未發(fā)酵時樣品中總酸含量，經(jīng)48 h發(fā)酵過后，發(fā)酵液中總酸含量分別增加263%、249.33%、123%以及138.16%。由此可見，使用乳酸腸球菌發(fā)酵的紅甜菜漿總酸增加量最高。所有樣品中的總酸含量在發(fā)酵周期中均為波動式上升，這與發(fā)酵基質(zhì)中保持動態(tài)變化的發(fā)酵微生物數(shù)量以及代謝途徑的變化有著密切的關(guān)系。

2.3 紅甜菜發(fā)酵過程中活菌數(shù)的變化

由圖3可以看出，乳酸腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵的活菌數(shù)分別在發(fā)酵周期的18 h與24 h達到最高值。所有樣品中的活菌數(shù)均呈現(xiàn)在發(fā)酵周期前半段顯著快速增加（p＜0.05），發(fā)酵后半段活菌數(shù)變化較小，趨于穩(wěn)定甚至有降低的趨勢。馮雋野[33]等人在研究野生藍靛果接種發(fā)酵過程中也發(fā)現(xiàn)了乳酸菌活菌數(shù)類似的變化趨勢。這是由于微生物在更換培養(yǎng)環(huán)境時，有一個短暫的延滯期，隨后在適應生長環(huán)境后就會進入對數(shù)增長期，但隨著活菌數(shù)的增加，發(fā)酵基質(zhì)中乳酸菌之間會由于爭搶碳源或其他營養(yǎng)物質(zhì)，導致菌種被抑制生長，微生物之間達到一個動態(tài)平衡的狀態(tài)，稱為穩(wěn)定期，但隨后就會發(fā)生活菌數(shù)下降的情況，便進入了衰亡期[34]。0 h到48 h，乳酸腸球菌紅甜菜漿發(fā)酵液活菌數(shù)由6.21 log(cfu/mL)（0 h）升至7.17 log(cfu/mL)（18 h），發(fā)酵結(jié)束時降至6.76 log(cfu/mL)（48 h）；乳酸腸球菌甜菜片發(fā)酵液活菌數(shù)6.21 log(cfu/mL)（0 h）升至6.95 log(cfu/mL)（18 h），發(fā)酵結(jié)束波動降至6.69 log(cfu/mL)（48 h）。植物乳桿菌紅甜菜漿發(fā)酵液活菌數(shù)由6.18 log(cfu/mL)（0 h）上升至6.79 log(cfu/mL)（24 h）隨后波動降至6.67 log(cfu/mL)（48 h）；植物乳桿菌紅甜菜片發(fā)酵液4（48 h），通過對比可以發(fā)現(xiàn)，兩種發(fā)酵菌所發(fā)酵的紅甜菜漿分別獲得了最高的活菌數(shù)，這可能是由于發(fā)酵基質(zhì)的狀態(tài)而決定的，相比紅甜菜片，紅甜菜漿由于被破碎得更加完全，使得大量營養(yǎng)物質(zhì)釋放，以供給微生物生長繁殖。

圖3 紅甜菜發(fā)酵過程中活菌數(shù)的變化Fig.3 Viable counts of bacteria of fermented red beetroot

2.4 紅甜菜發(fā)酵過程中活性物質(zhì)含量的變化

2.4.1 紅甜菜發(fā)酵過程中總酚含量的變化

由圖4可知，隨著發(fā)酵的進行，乳酸腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵的紅甜菜樣品中總酚的含量均顯著增加（p＜0.05），并呈現(xiàn)先增加后下降的整體趨勢。且總酚含量的最大值均出現(xiàn)在30 h。采用乳酸腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵的樣品中，紅甜菜漿發(fā)酵液中總酚含量最大，分別為755.30 mg/L和670.56 mg/L，相對未發(fā)酵樣品分別提高了 72.55%和51.42%，由此可見，乳酸腸球菌發(fā)酵的紅甜菜漿總酚含量增加量最大，且在30 h含量最高。發(fā)酵過程中，微生物將大分子酚類轉(zhuǎn)化成小分子物質(zhì)可能使酚類含量增加，并且乳酸菌所產(chǎn)生的酶類與有機酸可以使發(fā)酵基質(zhì)中酚類物質(zhì)大量的溶出，并呈現(xiàn)游離態(tài)，也會對酚類物質(zhì)的含量產(chǎn)生影響[35,36]。另外，通過對比發(fā)酵過程的后半段可以發(fā)現(xiàn)，乳酸腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵的紅甜菜片發(fā)酵液的總酚含量下降速度相比紅甜菜漿發(fā)酵液較為緩慢，可能由于是發(fā)酵基質(zhì)的形態(tài)阻止了一部分酚類物質(zhì)與其他物質(zhì)相結(jié)合，進而使得總酚含量下降速度放緩。

圖4 紅甜菜發(fā)酵過程中總酚含量的變化Fig.4 Total phenols content contents of fermented red beetroot

2.4.2 紅甜菜發(fā)酵過程中黃酮含量的變化

圖5 紅甜菜發(fā)酵過程中黃酮含量的變化Fig.5 Flavonoid contents of fermented red beetroot

如圖5所示，紅甜菜發(fā)酵液中的黃酮含量隨著發(fā)酵時間的增加，呈現(xiàn)先增加隨后波動下降的趨勢。乳酸腸球菌發(fā)酵的紅甜菜漿和片樣品在24 h時黃酮含量達到最大值，分別為0.89 mg/L和0.67 mg/L，增加34.84%和42.55%；植物乳桿菌發(fā)酵的紅甜菜漿和片樣品中黃酮含量在6 h后達到最大值，分別為0.76mg/L和0.92 mg/L，增加20.63%和113.95%。由此可見，使用植物乳桿菌發(fā)酵的紅甜菜片發(fā)酵液的黃酮含量最高。冉玉兵[37]等人在研究乳酸菌發(fā)酵龍眼漿時，也發(fā)現(xiàn)了黃酮含量隨發(fā)酵進行增加的情況。

2.4.3 紅甜菜發(fā)酵過程中甜菜色素的變化

2.4.3.1 甜菜紅素含量變化

如圖6所示，由不同菌種發(fā)酵的相同發(fā)酵基質(zhì)形態(tài)的樣品中甜菜紅素含量，在發(fā)酵周期中的變化趨勢基本一致：紅甜菜漿發(fā)酵液中紅素含量均呈先下降隨后動態(tài)穩(wěn)定的趨勢；紅甜菜片發(fā)酵液甜菜紅素含量呈現(xiàn)先快速上升，隨后下降的趨勢。乳酸腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵的紅甜菜漿樣品，在48 h內(nèi)甜菜紅素含量由9.37 mg/100 mL分別下降至6.01 mg/100 mL和6.33 mg/100 mL，下降38.10%和36.07%，這可能是由于在將紅甜菜制作成漿液時，其組織被機械破壞，在加速甜菜色素以及其他活性物質(zhì)的溶出時，同時破碎的紅甜菜組織增大了與發(fā)酵液的接觸面積，更容易受到微生代謝產(chǎn)物等外界影響，甜菜紅素更容易被分解或轉(zhuǎn)化。Swaicki[38]等人在研究紅甜菜自然發(fā)酵過程甜菜紅素含量變化時也觀察到發(fā)酵過程中其含量有30%～50%左右的下降。

圖6 紅甜菜發(fā)酵過程中甜菜紅素含量Fig.6 Betacyanincontent of fermentation red beetroot broth

另外，發(fā)酵后期的紅素含量出現(xiàn)的平穩(wěn)趨勢，可能受到了 pH的影響，葉麗君[39]等人的研究，發(fā)現(xiàn)當甜菜紅素所處環(huán)境pH為2.0～9.0間屬于一級降解動力學反應，而pH為4左右時甜菜紅素具有更長的半衰期，因此更加穩(wěn)定。紅甜菜片發(fā)酵液中甜菜紅素分別由3.47 mg/100 mL增加至7.94 mg/100 mL和8.23±0.3 mg/100 mL，增加128.81%和137.17%，是由于甜菜色素為水溶性色素，在液體中浸泡和微生物代謝作用均能夠促進其溶出，但發(fā)酵周期的后半段由于色素溶出量低于降解與轉(zhuǎn)換量，因此甜菜紅素含量發(fā)生下降，但含量仍高于未發(fā)酵樣品。

2.4.3.2 甜菜黃素含量變化

如圖7所示，使用兩種菌種發(fā)酵的發(fā)酵液中甜菜黃素含量的變化趨勢基本一致，均呈現(xiàn)先增加，隨后降低并保持動態(tài)平衡趨勢。乳酸腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵的各種發(fā)酵基質(zhì)類型的樣品中甜菜黃素含量均在發(fā)酵前半段顯著提高（p＜0.05），分別提高87.64%（乳酸腸球菌-漿）、78.88%（乳酸腸球菌-片）、58.05%（植物乳桿菌-漿）和 12.42%（植物乳桿菌-片）。這與Swaicki[38]等人發(fā)現(xiàn)的甜菜黃素含量在發(fā)酵過程前期發(fā)生增長，隨后波動下降的變化趨勢相符。研究表明甜菜黃素的增加主要有兩種來源：首先，甜菜色素為水溶性色素，隨著發(fā)酵的進行，發(fā)酵基質(zhì)由于微生物的分解代謝其中的甜菜黃素發(fā)生溶出，會導致樣品中甜菜黃素含量增加；其次，紅甜菜中所含的甜菜醛氨酸與胺和氨基酸分子可以縮合成甜菜黃素[40]，而植物中胺與氨基酸含量豐富，為甜菜黃素的生成提供了條件。通過對比發(fā)酵液中甜菜紅素與黃素含量的差別發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液中紅素的含量高于黃素含量。紅甜菜中含有的多巴胺成分通過酶催化成環(huán)多巴，相比氨基酸，環(huán)多巴更容易與甜菜醛氨酸生成甜菜苷配基，進而被糖基化為甜菜苷，甜菜苷為甜菜紅素的主要成分[41]。

圖7 紅甜菜發(fā)酵過程中甜菜黃素含量Fig.7 Betaxanthincontent of fermentation red beetroot broth

2.5 紅甜菜發(fā)酵過程中抗氧化能力的變化

2.5.1 紅甜菜發(fā)酵國過程中DPPH·清除能力的變化

圖8 發(fā)酵紅甜菜液DPPH?清除能力Fig.8 DPPH radical scanveging of fermented beetroot

通過圖8可以看出，乳酸腸球菌和植物乳桿菌所發(fā)酵的紅甜菜漿樣品的 DPPH·清除能力在發(fā)酵周期中的部分時間段內(nèi)升高不顯著（p＞0.05），紅甜菜片樣品顯著升高（p＜0.05）。發(fā)酵紅甜菜漿樣品和紅甜菜片樣品分別在30 h（46.63%和47.01%）以及24 h（55.32%和48.12%）達到最大值，與未發(fā)酵樣品相比，DPPH·清除能力分別提高了7.81%（乳酸腸球菌-漿）、13.9%（植物乳桿菌-漿）、47.80%（乳酸腸球菌-片）和 28.11%（植物乳桿菌-片）。由此可見，紅甜菜片發(fā)酵液的DPPH·清除能力高于甜菜漿發(fā)酵樣品，其中乳酸腸球菌清除能力最強。通過對比甜菜紅素含量的變化趨勢和相關(guān)性分析可以看出清除能力的變化與其相關(guān)（R2=0.701）。研究表明，甜菜紅素中主要成分甜菜苷具有良好的抗氧化能力[42]，發(fā)酵液中甜菜紅素含量的變化與其他活性物質(zhì)一同影響 DPPH·清除能力的變化。黃梅華[43]等人研究發(fā)現(xiàn)乳酸菌火龍果皮發(fā)酵液的DPPH·清除能力在經(jīng)過發(fā)酵后顯著提高，達到97.52%。

2.5.2 紅甜菜發(fā)酵過程中總抗氧化能力的變化

圖9 發(fā)酵紅甜菜液總抗氧化能力Fig.9 Total antioxidant activity of fermented beetroot

如圖9所示，相同發(fā)酵菌種使用不同發(fā)酵基質(zhì)類型的樣品表現(xiàn)出不同的總抗氧化能力變化趨勢：紅甜菜漿發(fā)酵液呈現(xiàn)波動下降的趨勢，紅甜菜片發(fā)酵液呈先增加，隨后下降并保持動態(tài)平衡的趨勢。在48 h中，使用乳酸腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵的紅甜菜漿樣品的總抗氧化能力顯著下降（p＜0.05），分別下降 41.91%和27.78%；紅甜菜片發(fā)酵樣品中總抗氧化能力均經(jīng)歷顯著上升階段（p＜0.05），最高值為1.11 mmol/L和1.14 mmol/L，分別上升37.03%和34.12%。由此可見植物乳桿菌發(fā)酵的紅甜菜片樣品的總抗氧化能力優(yōu)于其它樣品。樊秋元[44]在研究植物乳桿菌發(fā)酵黑加侖酵素時，也發(fā)現(xiàn)其總抗氧化能力在發(fā)酵周期24 h左右達到最大值后，發(fā)生下降的趨勢。

2.5.3 紅甜菜發(fā)酵過程中ABTS+·

通過圖10可以看出，使用乳酸腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵的樣品的ABTS+·清除能力變化趨勢基本相同，均為先顯著增加（p＜0.05），隨后保持動態(tài)平衡的趨勢。通過對比數(shù)據(jù)可以得出，兩種菌種發(fā)酵的紅甜菜片發(fā)酵樣品，相比 0 h均得到提升，分別達到 69.62%和69.69%，各自提升了132.29%和144.52%。相比之下，發(fā)酵紅甜菜漿的樣品僅在各自發(fā)酵周期的6 h，分別有62.00%和37.25%的增幅。在其他抗氧化指標出現(xiàn)下降時，由于甜菜發(fā)酵液中可能通過發(fā)酵釋放出的甜菜醛氨酸，這是一種就清除ABTS+·而言，相比Trolox有更好清除率的物質(zhì)[45]，并且即使甜菜苷發(fā)生了氧化，其衍生物，例如2-脫羧甜菜苷、新甜菜苷等，依然具有良好的清除能力，隨著發(fā)酵基質(zhì)成分的平穩(wěn)，這也使得ABTS·+清除能力變化趨勢相對穩(wěn)定。

圖10 發(fā)酵紅甜菜液ABTS+·清除能力Fig.10 ABTS+· radical scanveging of fermented beetroot

3 結(jié)論

使用自然發(fā)酵分離、純化出的植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）、乳酸腸球菌（Enterococcus lactis）分別對紅甜菜漿和紅甜菜片進行發(fā)酵，各樣品總酸含量隨pH下降而增加；乳酸菌活菌數(shù)呈現(xiàn)先顯著上升（p＜0.05），后降低的趨勢；活性物質(zhì)中，總酚和黃酮的含量均呈現(xiàn)先增加后減少趨勢；發(fā)酵紅甜菜漿樣品中甜菜紅素含量隨發(fā)酵進行而下降，紅甜菜片發(fā)酵樣品先顯著增加（p＜0.05）再下降趨于穩(wěn)定，乳酸腸球菌紅甜菜發(fā)酵液中甜菜紅素含量最高，為7.94 mg/100 mL，另外所有樣品中甜菜黃素含量均在發(fā)酵前半段發(fā)生了增加，后半段下降并趨于平緩；乳腸球菌和植物乳桿菌發(fā)酵的紅甜菜片樣品，具有更高的體外抗氧化能力。綜上，使用植物乳桿菌和乳酸腸球菌發(fā)酵可以提高紅甜菜片和紅甜菜漿的品質(zhì)，為后續(xù)研究、開發(fā)紅甜菜乳酸發(fā)酵制品提供了基礎數(shù)據(jù)與理論依據(jù)。