多次流產患者血栓前狀態(tài)相關標志物的檢測與分析

劉寧，王超，劉羽，王瑞靜，張玉紅，張婷，田婷婷，劉梅梅

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院婦產科，哈爾濱 150086)

血栓前狀態(tài)(prethrombotic state，PTS)是多種因素引起的凝血和抗凝血系統(tǒng)、纖溶和抗纖溶系統(tǒng)功能失調或障礙的一種病理過程。PTS是血栓形成的風險因素，有研究表明凝血功能異常時子宮胎盤部位血流狀態(tài)發(fā)生改變，局部組織易形成微血栓，導致胎盤纖維沉著、梗死，最終引發(fā)流產等各種不良妊娠結局[1]。PTS的相關標志物大致可以分為基因標志物[主要包括凝血因子V(FV)、凝血酶原(FⅡ)、纖溶酶原激活物抑制劑-1(PAI-1)、亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成酶還原酶(MTRR)基因]和凝血相關指標[包括蛋白C(PC)、蛋白S(PS)及高同型半胱氨酸血癥(HHCY)等]。已有諸多研究報道PTS相關標志物的改變參與流產等不良妊娠結局的發(fā)生，Brenner[2]研究認為PC或PS缺陷、FV及FⅡ基因突變、HHCY均和流產具有顯著相關性；Mierla等[3]研究證實，MTHFR、MTRR、FV、FⅡ和PAI-1的基因多態(tài)性可促進血栓形成，進而誘發(fā)流產。因此，本研究通過觀察發(fā)生多次流產(發(fā)生2次及以上自然流產)的患者體內上述指標的變化，分析其對多次流產發(fā)生的影響，以期為多次流產發(fā)生機制的研究提供參考，為臨床工作中圍生期保健提供新的思路。

資料與方法

一、研究對象

回顧性分析2019年12月至2021年5月期間就診于我院婦產科門診的324例女性為研究對象。將發(fā)生2次及以上自然流產且計劃妊娠的女性納入病例組(193例)，無自然流產史且有過正常生育史、要求完善孕前相關檢查的女性納入對照組(131例)。所有入選者均為漢族且樣本采集時均為未孕狀態(tài)，就診前7日無抗凝、溶栓及避孕用藥史。病例組排除標準：存在夫妻一方或雙方染色體異常、女性生殖器官解剖異常、內分泌異常、自身免疫疾病、感染、糖尿病、高血壓、腎病和腫瘤等。

二、診療方法回顧

1.主要儀器與試劑：NP968全自動核酸提取儀(西安天隆)；G1000型PCR擴增儀(杭州博日)；NanoDrop One微量核酸定量儀(Thermo，美國)；3500DX XL測序儀(ABI，美國)；HCY試劑盒(Ortho-Clinical Diagnostics，美國)；PC和PS活性測定試劑盒(Stago，法國)。

2.樣本采集及檢測：采集病例組和對照組空腹外周靜脈血5 ml，血液樣本做好標注，室溫靜置15 min，收集上清液得血清標本，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩２捎醚h(huán)酶法檢測同型半胱氨酸(HCY)水平，發(fā)色底物法檢測PC活性，凝固法檢測PS活性；并提取DNA通過聚合酶鏈式反應(PCR)擴增后對PTS相關基因進行Sanger法測序，分析以下位點的基因表型：FV基因1691位點、FⅡ基因20210位點、PAI-1基因675位點、MTHFR基因677和1298位點、MTRR基因66位點。各指標檢測嚴格按照實驗操作流程完成。

3.觀察指標及判斷標準：記錄兩組患者的年齡、體質量指數(shù)(BMI)、HCY水平、PC及PS活性，F(xiàn)Ⅴ(1691)、FⅡ(20210)、PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTHFR(1298)及MTRR(66)位點的基因多態(tài)性。

參考新近文獻[4-5]中的相關標準，本研究將空腹HCY參考值范圍定為：5～15 μmol/L；HCY>15 μmol/L為HHCY。PC參考值：70%～140%；PC<70%為PC缺陷。PS參考值：59%～118%；PS<59%為PS缺陷。

三、統(tǒng)計學處理

結 果

一、兩組患者的一般資料比較

病例組患者年齡21～44歲，平均(31.66±4.42)歲；BMI 16.52～27.39 kg/m2，平均值(21.61±2.46)kg/m2；對照組年齡22～42歲，平均(31.00±4.57)歲；BMI 17.21～25.66 kg/m2，平均值(21.58±2.49)kg/m2；病例組HHCY發(fā)生率為32.1%，對照組HHCY發(fā)生率為25.2%。兩組間年齡、BMI和HHCY發(fā)生率比較均無顯著性差異(P>0.05)，組間具有可比性。兩組研究對象均未發(fā)現(xiàn)FⅤ(1691)、FⅡ(20210)位點的多態(tài)性突變，而PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTHFR(1298)及MTRR(66)位點均檢測到多態(tài)性突變。兩組PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTHFR(1298)和MTRR(66)位點基因型的理論數(shù)值和實際數(shù)值進行Hardy Weinberg定律檢驗，結果提示研究人群符合遺傳平衡定律，具有群體代表性。

二、相關資料的單因素分析

對兩組患者不同年齡及BMI分布情況、PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTHFR(1298)、MTRR(66)位點多態(tài)性、HHCY發(fā)生情況、PC和PS缺陷情況進行單因素分析，結果顯示BMI、PAI-1(675)、MTRR(66)位點多態(tài)性在兩組中有顯著性差異(P<0.05)，可能是發(fā)生多次流產的影響因素(表1)。

表1 相關參數(shù)的單因素分析[n(%)]

三、Logistic多因素分析

將單因素分析結果中有顯著性差異的因素[BMI、PAI-1(675)、MTRR(66)]作為多因素分析變量的第一梯隊；考慮到有些因素在單因素分析中雖無顯著性差異，但其真實的效應可能被低估或被掩蓋，故將納入標準放寬到P<0.1，再納入MTHFR(677)和PC缺陷兩個因素進行多因素分析。分別對BMI、PAI-1(675)、MTHFR(677)、MTRR(66)和PC缺陷進行賦值(表2)，經Logistic回歸分析顯示BMI>24 kg/m2、PAI-1(675)位點由5G突變?yōu)?G和MTHFR(677)位點由C突變?yōu)門可能是發(fā)生多次流產的獨立危險因素(P<0.05)(表3)。

表2 相關因素賦值表

表3 相關參數(shù)的Logistic多因素分析

四、Logistic回歸模型的評估

采用受試者工作特征曲線(ROC)對回歸模型進行評價，ROC曲線下面積(AUC)為0.664(圖1)，靈敏度為54.9%，特異度為70.2%，95%CI為60.5%～72.3%，標準偏差為0.030，說明該模型較為可信。

圖1 Logistic回歸分析的ROC曲線

討 論

近年來，凝血和纖溶系統(tǒng)失衡與流產等不良妊娠結局的相關性受到越來越多研究者的關注。PTS的相關標志物包括FV、FⅡ、PAI-1、MTHFR、MTRR基因、PC、PS及HHCY等。有研究報道，多次流產人群中相關抗凝蛋白異常主要與PC和PS缺陷相關[6]；機體中MTHFR、MTRR基因突變以及HCY水平的異常不僅會影響葉酸代謝過程，還與胎兒生長發(fā)育及母體凝血功能密切相關[7-8]。本研究以發(fā)生≥2次自然流產的患者為研究對象，比較病例組與對照組的一般資料及PTS相關標志物的變化，以期為多次流產發(fā)生的原因和具體機制尋找新的思路和依據(jù)。

有Meta分析顯示，F(xiàn)V基因突變可能是妊娠早期自然流產和胎死宮內的重要原因之一[9]。還有研究認為FV基因突變的妊娠女性早期流產發(fā)病率和一般孕婦大致相同[10]。但也有學者對甘肅928例RSA女性開展研究，結果顯示在這些女性中并沒有檢測到凝血因子FV和FⅡ的多態(tài)性突變[11]。本研究中亦沒有發(fā)現(xiàn)受檢女性存在FⅤ1691、FⅡ20210位點的多態(tài)性突變，尚不能證明FV和FⅡ基因突變在多次流產人群中的分布特征，而且這可能與不同種族、地域的群體中基因分布頻率的差異有關；另外，也可能與本研究納入人群數(shù)量有限、樣本來源單一有關。

PAI-1是血漿纖溶系統(tǒng)的主要拮抗物之一，其水平變化與PAI-1基因675位點4G/5G多態(tài)性密切相關，PAI-1水平過高可引起胎盤微血栓的形成、胎盤血流量降低、胎盤功能不良而導致流產發(fā)生[12]。本研究中多因素回歸分析提示PAI-1(675)位點多態(tài)性是多次流產的獨立危險因素(P<0.05，OR=1.508)，即控制其他影響因素后，當PAI-1(675)位點由5G突變?yōu)?G，多次流產的發(fā)生風險增加為原來的1.508倍，提示PAI-1(675)位點5G突變?yōu)?G可能增加多次流產的患病風險。

PC缺陷與PS缺陷在亞洲或非洲裔女性中較為常見，PS是PC活化后抗凝的關鍵輔助因子之一[13]。有研究證實，當PS和PC缺陷時，機體抗凝機制異常，胎盤血栓形成風險顯著增加[14]。此外，有研究表明妊娠期PC和PS的水平波動較大，因此非孕期檢測PC與PS水平的結果更為可靠[15]。本研究中經χ2檢驗結果提示，PC缺陷和PS缺陷對多次流產的發(fā)生沒有明顯影響(P>0.05)，但病例組PS缺陷陽性率(21.8%)有高于對照組(14.5%)的趨勢，不能排除納入樣本量有限以及入組病例人群單一的影響，后續(xù)需要進一步開展多中心多地區(qū)的大樣本研究加以驗證。

MTHFR基因677位點和1298位點突變會增加自然流產風險[16]。MTHFR(677)位點突變C→T的核苷酸變化，可能使妊娠期胚胎丟失或胎兒死亡的風險增加4倍[17]。本研究結果提示MTHFR基因677位點由C突變?yōu)門可能是多次流產發(fā)生的獨立危險因素(P<0.05)，但未發(fā)現(xiàn)MTHFR(1298)位點多態(tài)性對多次流產的發(fā)生存在顯著影響(P>0.05)。這可能與本研究樣本量少且來源單一有關，還可能與MTHFR基因多態(tài)性存在人種差異和地區(qū)差異等[18]有關。

MTRR基因66位點突變同樣可引起HCY水平升高，增加血栓形成及流產等不良妊娠結局的發(fā)生風險[19]。應用葉酸干預可降低流產發(fā)生率，改善不良妊娠狀態(tài)。本研究結果并未發(fā)現(xiàn)MTRR(66)位點多態(tài)性對多次流產的發(fā)生存在顯著影響(P>0.05)。

HCY水平異常和不良妊娠結局密切相關[20]。有研究發(fā)現(xiàn)流產患者血漿HCY水平明顯高于正常妊娠女性[5]；孕婦發(fā)生胎盤病變的情況與HHCY密切相關[21]。但本研究結果并未提示HHCY與多次流產的發(fā)生存在明顯關聯(lián)，這可能與國家惠民政策免費發(fā)放葉酸及葉酸補充的宣傳力度增強有關，本地區(qū)育齡期婦女孕前保健意識提高，大部分育齡婦女孕前攝入葉酸足夠。

高齡是導致妊娠期女性流產發(fā)生的主要原因之一[22]。有研究表明高齡女性流產的發(fā)生風險遠大于適齡孕產婦[23]。隨著生育政策的調整及高齡孕產婦的增加，應高度重視高齡導致的妊娠率下降、胚胎丟失率增高等不良妊娠結局。本研究結果中，尚未發(fā)現(xiàn)年齡在對照組與病例組存在顯著差異(P>0.05)，但仍不能排除年齡對流產發(fā)生的影響。這可能與本研究的樣本量不足有關，未來需要擴大樣本量進一步研究探討。

有研究認為BMI的升高與自然流產的風險增加有關[24]，其具體機制可能是肥胖引起的炎癥產物增加使卵巢血流灌注減少，卵泡膜細胞攝入膽固醇的減少導致類固醇激素合成的前體物質減少，孕酮合成下降，可能導致流產的發(fā)生[25]。本研究中Logistic回歸分析結果顯示BMI的OR值為3.264，即控制其他因素后，BMI每增加1 kg/m2，多次流產的發(fā)生風險增加為原來的3.264倍，因此，合理控制BMI可能減少多次流產的發(fā)生風險。

本研究仍存在一些不足之處：首先，研究對象僅為黑龍江省部分地區(qū)的漢族女性，在樣本多樣性方面存在局限性；其次，本研究為回顧性病例對照研究，納入樣本量較小，研究結論可能存在一定偏倚，未來還需進行大樣本、多中心的研究加以驗證；最后，因考慮到數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性及盡可能排除混雜因素，本研究未納入D-二聚體、凝血酶時間及凝血酶原時間等常規(guī)參數(shù)，僅對病例組和對照組中PTS相關標志物的變化進行了比較，但未對其與流產發(fā)生的關系進行深入分析，后續(xù)應增加動物實驗加以探討，以期得出更可靠的結論。

綜上所述，BMI>24 kg/m2、PAI-1(675)、MTHFR(677)基因位點多態(tài)性可能是發(fā)生多次流產的獨立危險因素。這些指標可能有益于自然流產的盡早診斷及未來的精準干預，但它們參與自然流產發(fā)生的具體機制與影響尚不清楚，有待后續(xù)更深入的研究加以探討。