高通量測序技術(shù)在纖毛蟲研究中的應用

夏萍

（重慶師范大學 生命科學學院，重慶 401331）

纖毛蟲隸屬于原生生物界，是一類形態(tài)多樣、數(shù)量眾多、分布極為廣泛的單細胞真核生物。經(jīng)歷了漫長的演化形成了其獨特的接合生殖方式、雙態(tài)核型及多樣性的形態(tài)結(jié)構(gòu)，成為細胞生物學、生理學等多個學科的模型生物[1]。同時，纖毛蟲在微生物食物網(wǎng)中也扮演著重要的角色，在物質(zhì)循環(huán)、能量流動中發(fā)揮了樞紐作用；此外，營寄生或棲生的纖毛蟲常對水產(chǎn)養(yǎng)殖造成危害，且某些水體中纖毛蟲大量繁殖可能危害水環(huán)境[2]。因此，纖毛蟲的相關(guān)研究一直是國際基礎(chǔ)生物學研究的焦點。但纖毛蟲因個體微小、多數(shù)類群難以培養(yǎng)和單體難以分離等特點，阻礙了研究者們進一步對其多樣性的充分認識。

當前高通量測序技術(shù)方興未艾，其具有測序數(shù)據(jù)量大、準確度高等特點，已經(jīng)逐漸運用到環(huán)境纖毛蟲多樣性的研究中，包括不同深度的海水、沉積物、土壤和宿主等環(huán)境。本文對高通量測序技術(shù)進行概述，并綜述了目前高通量測序技術(shù)在纖毛蟲研究中的應用，以期促進纖毛蟲多樣性研究的進一步發(fā)展。

1 高通量測序技術(shù)概述

1977 年，Sanger 測序誕生并得到廣泛運用，隨后由于研究者們對大規(guī)模測序需求的逐漸增加，基因測序技術(shù)得到不斷發(fā)展。2005 年開始，基于焦磷酸測序原理的GS FLX Titanium 測序平臺、基于邊合成邊測序原理的Illμmina 測序和ABI 公司的SOLiD 測序等相繼出現(xiàn)，拉開了第二代測序技術(shù)的帷幕，即高通量測序技術(shù)。相比于傳統(tǒng)測序，高通量測序技術(shù)顯著降低了多樣本、大規(guī)模測序的測序成本，且可以直接反饋樣本中各OTU（Operational Taxonomic Unit）的豐度，但較短的測序長度一直是二代測序的痛點[3]。此后，單分子實時測序的出現(xiàn)，標志著第三代測序技術(shù)時代的開始。相比于前兩代測序技術(shù)，測序速度和序列長度都有了較大的提升，同時也避免了PCR 擴增所產(chǎn)生的偏差，但有研究顯示其目前存在較高的錯誤率。因此，目前二代測序技術(shù)仍是大規(guī)模測序的主流。

2 高通量測序技術(shù)在水域生態(tài)系統(tǒng)纖毛蟲研究中的應用

地球水資源豐富，其表面2/3 被水所覆蓋，其中包括江河湖泊等淡水資源，也包括大洋和海水等咸水資源。廣闊的水環(huán)境養(yǎng)育了多種多樣的生物，其中纖毛蟲是水域生態(tài)系統(tǒng)的重要組成部分。目前，對纖毛蟲多樣性的研究主要集中在海洋生態(tài)系統(tǒng)中。研究表明，不同海洋生態(tài)系統(tǒng)中存在較高的真核生物多樣性，而纖毛蟲是其中的主要類群[4]。近年來，高通量測序技術(shù)的介入，極大地提高了人們對水域生態(tài)系統(tǒng)中纖毛蟲多樣性的認識。2016 年，Gimmler 等[5]在真光層水體中篩選得到1 274 個纖毛蟲的OTU，其中存在許多未被描述的纖毛蟲物種，多樣性遠高于傳統(tǒng)形態(tài)學研究及第一代測序所獲得的纖毛蟲物種數(shù)。研究表明，在海水水域和南海南部淺海海域中的浮游纖毛蟲中，舞毛亞綱和寡毛亞綱物種豐度占據(jù)絕對優(yōu)勢[6]。臺灣海峽中，旋毛綱是浮游纖毛蟲的優(yōu)勢類群；纖毛蟲多樣性與海水的營養(yǎng)程度呈正相關(guān)，營養(yǎng)程度越高的海水具有更高的纖毛蟲多樣性，淺層海水中纖毛蟲多樣性高于深層，淺層海水中纖毛蟲的多樣性隨著深度的增加呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢，且不同深度纖毛蟲的群落組成存在顯著差異。底棲纖毛蟲中前口綱等為優(yōu)勢類群；在沉積物中，形態(tài)學研究表明前口綱和裂口綱為優(yōu)勢類群，但高通量測序結(jié)果顯示浮游類纖毛蟲占據(jù)優(yōu)勢，后有研究表明這可能是沉積物中富集了水體中的浮游纖毛蟲的DNA，且沉積物中的纖毛蟲多樣性高于自然水體[7]，因此沉積物中纖毛蟲的物種組成及多樣性分析還有待進一步的研究。

3 高通量測序技術(shù)在土壤生態(tài)系統(tǒng)纖毛蟲研究中的應用

通過檢測土壤中纖毛蟲等原生生物的群落變化，可以監(jiān)測人類土地利用活動對土地的影響，從而促進生態(tài)系統(tǒng)的可持續(xù)發(fā)展。纖毛蟲也被認為是理想的土地利用變化和土壤環(huán)境壓力的生物指標。1913 年，Martin 等[8]證明了原生動物在土壤生態(tài)系統(tǒng)中是一個較為獨立的結(jié)構(gòu)，隨后，土壤中纖毛蟲的研究逐漸受到研究者們的重視，并主要通過形態(tài)學特征及分子系統(tǒng)發(fā)育等對纖毛蟲個體進行研究。目前，中歐地區(qū)的土壤類群是基于形態(tài)學研究中描述最為全面的，有研究者對中歐某些地區(qū)采樣并進行高通量測序，結(jié)果表明能精確匹配的OTUs 較少，且形態(tài)學數(shù)據(jù)庫與分子數(shù)據(jù)庫存在明顯的差異[9]。國內(nèi)也逐漸將高通量測序技術(shù)應用于土壤纖毛蟲的研究中，有研究通過研究土壤中纖毛蟲的群落變化評估退耕還林、退牧還草、施加化肥等對土壤質(zhì)量的影響，從而判斷上述措施的可行性；也有研究對西藏那曲、西藏拉薩、甘肅慶陽、甘肅蘭州等地區(qū)的纖毛蟲群落特征進行描述，表明土壤中纖毛蟲的物種組成、群落構(gòu)成能夠客觀地描述不同生境的特征，顯示了高通量測序技術(shù)在群落結(jié)構(gòu)變化研究中的優(yōu)勢。

4 高通量測序技術(shù)在寄生或共棲生纖毛蟲研究中的應用

許多生物的消化道棲息著大量微生物，包括原蟲、細菌和真菌等，其中原蟲主要是纖毛蟲。纖毛蟲的群落構(gòu)成受宿主的食物種類、分布地區(qū)和年齡等因素的影響。研究消化道內(nèi)纖毛蟲的物種組成變化及其與宿主之間復雜的關(guān)系也是營養(yǎng)學、病害學等的研究熱點之一。有部分研究通過高通量測序技術(shù)對黑山羊瘤胃中的纖毛蟲種群結(jié)構(gòu)進行分析，同時分析不同的飼糧、飼料添加劑等對瘤胃內(nèi)纖毛蟲群落的影響[10]。此外，通過高通量測序技術(shù)對不同中性洗滌纖維（NDF）飼糧水平下塔里木馬鹿的瘤胃內(nèi)的原蟲進行研究，結(jié)果顯示內(nèi)毛屬和多甲屬是其消化道內(nèi)的主要屬，原蟲的活力與數(shù)量會受到飼糧水平的影響，但對原蟲多樣性無顯著影響。Kittelmann 等[11]發(fā)現(xiàn)反芻動物瘤胃內(nèi)的原蟲與某些厭氧真菌呈現(xiàn)明顯的負相關(guān)關(guān)系。除上述研究以外，國內(nèi)外還通過高通量測序技術(shù)對山羊、奶牛、湖羊、綿羊以及駝鹿等動物進行研究，涉及瘤胃內(nèi)原蟲與其宿主的種屬、飼糧、瘤胃內(nèi)容物的關(guān)系，原蟲與腸道菌群的相關(guān)性等，其應用極為廣泛。將分子生物學的技術(shù)手段與動物營養(yǎng)學相結(jié)合，有助于增加對動物整體的認識，為消化道內(nèi)原蟲的研究提供新的思路。

5 結(jié)語

高通量測序技術(shù)在微生物領(lǐng)域應用廣泛，但在纖毛蟲等原生動物研究中應用較少。已有的研究顯出示高通量測序技術(shù)在纖毛蟲的研究中具有巨大的潛力，但目前的研究主要針對水域生態(tài)系統(tǒng)相關(guān)類群，罕有對寄生或棲生的纖毛蟲和土壤中自由生活的纖毛蟲的多樣性進行研究，同時也極少有研究者研究纖毛蟲物種組成與其影響因素。因此，采用高通量測序技術(shù)對更多生境類群進行研究，將有助于進一步增加對纖毛蟲的認識。此外，目前仍存在大量的纖毛蟲物種未被描述，形態(tài)學數(shù)據(jù)庫與分子數(shù)據(jù)庫并不匹配，增加形態(tài)數(shù)據(jù)、深入挖掘已有的高通量測序所得的短序列信息也可能是纖毛蟲研究發(fā)展的一個方向。