FMO3調(diào)控犢牛原代肝細胞VLDL-TG的代謝

鄧清華，宋景旭，張 焱，劉 婷，張玉明，劉國文,

（1.內(nèi)蒙古民族大學動物科學技術學院，內(nèi)蒙古 通遼 028000；2.吉林省松原市前郭縣醫(yī)院，吉林 松原 138000；3.吉林大學動物醫(yī)學學院，吉林 長春 130062）

我國奶牛脂肪肝的發(fā)病率高于30%。脂肪肝影響奶牛的產(chǎn)奶量及乳品質(zhì)，且常誘發(fā)皺胃變位、胎衣不下及生產(chǎn)癱瘓等圍產(chǎn)期的其他疾病，給奶牛業(yè)帶來嚴重的經(jīng)濟損失[1]。圍產(chǎn)期奶牛的能量代謝特點是干物質(zhì)攝入減少而需求增加所導致的能量負平衡[2]。能量負平衡引發(fā)脂肪動員并引起血液中非酯化脂肪酸（Non-eserified fatty acid，NEFA）濃度增加[3]。NEFA 僅有20%能被乳腺組織吸收利用，其余大部分進入肝臟[4-5]。過多的NEFA 在肝臟中代謝生成甘油三酯（Triglyceride，TG），以極低密度脂蛋白（Very low density lipoprotein，VLDL）的形式轉(zhuǎn)運出肝臟，被外周組織利用[6]。NEFA增多不僅加強了促炎因子的活性，還加重胰島素抵抗，形成惡性循環(huán)，最終加劇脂肪肝的發(fā)生[7]。由于反芻動物肝臟缺乏足量的脂蛋白脂酶和肝脂酶，通過水解氧化以清除TG的途徑受到明顯限制，VLDL 的分泌就成為肝臟清除TG 的主要途徑。當脂肪動員產(chǎn)生過量的NEFA 被酯化生成TG 而缺乏足夠多的VLDL 時，TG 就會積累在肝臟中而引發(fā)脂肪肝[8]。VLDL 的組裝與分泌主要由載脂蛋白B（Apolipopro?tein B，ApoB）100、載脂蛋白E（Apolipoprotein E，ApoE）、微粒體甘油三酯轉(zhuǎn)運蛋白（Microsome tri?glyceride transfer protein，MTTP）等蛋白的參與[9]。

含黃素單加氧酶3（Flavin containing monooxy?genase 3，F(xiàn)MO3）作為肝臟中的一類微粒體酶，能參與外源性物質(zhì)的代謝，是動物肝臟中參與非營養(yǎng)物質(zhì)代謝和轉(zhuǎn)化的重要蛋白[10]。此外，F(xiàn)MO3可通過調(diào)節(jié)與肝臟脂肪生成和糖異生有關的多個基因來控制血脂的形成[11]。近年來，國外對于FMO3參與調(diào)控脂代謝研究較多。在敲除LDL 受體缺陷小鼠肝臟FMO3 基因后，可降低小鼠肝臟和血漿脂質(zhì)水平、膽汁酸的濃度以及肝臟TG分泌水平；而當PPARα被激活時，可通過其靶基因的反式激活增加FMO3的表達，促進脂肪酸氧化和糖異生[12]。研究表明，F(xiàn)MO3參與肝臟脂質(zhì)代謝的過程。因奶牛的代謝特征比較特殊，肝臟脂肪代謝的過程存在一定差異，目前尚無關于FMO3 與奶牛脂肪肝和對VLDL 組裝和分泌調(diào)節(jié)的相關文獻，所以對于FMO3在奶牛脂肪肝以及調(diào)節(jié)VLDL組裝和分泌方面的研究可為闡明疾病的發(fā)病機理及疾病的防治提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

1日齡健康荷斯坦犢牛。

1.2 主要試劑

Abcam 牛極低密度脂蛋白ELISA 測定試劑盒；Abcam 牛甘油三酯ELISA 測定試劑盒；天根2×TaqPCR Mastermix；碧云天細胞裂解液（PMSF）；TaKaRa DL2000 DNA Marker和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒；Roche熒光定量試劑。

1.3 試驗方法

1.3.1 肝細胞的分離與培養(yǎng)

1日齡的禁食犢牛以無菌方法取出肝臟尾狀突。用兩步灌流法分離犢牛原代肝細胞[13]。將分離的肝細胞按每孔1×106個細胞放入6 孔細胞培養(yǎng)板，在37 ℃，5%CO2下進行培養(yǎng)。待細胞貼壁后更換培養(yǎng)液，培養(yǎng)72 h后進行后續(xù)操作。

1.3.2 腺病毒載體的構(gòu)建及感染肝細胞

根據(jù)GenBank 中牛FMO3基因的編碼序列，設計篩選有效的shRNA 并且合成FMO3 基因全序列，構(gòu)建FMO3基因的低表達和過表達腺病毒并攜帶綠色熒光蛋白，培養(yǎng)HEK293細胞進行病毒包裝、擴增和純化，所得重組腺病毒測定其滴度，并達到109PFU·mL-1開始收集病毒。將體外培養(yǎng)的肝細胞貼壁培養(yǎng)72 h后用低表達、過表達和空腺病毒載體感染，設空白對照組（Control），低表達FMO3腺病毒載體組（LOW），過表達FMO3 組（OVER）和陰性對照組（NC，腺病毒空載體），每組6 個重復孔，病毒感染復數(shù)（MOI）設為100[5]，繼續(xù)培養(yǎng)48 h 后收集細胞及上清液置于-80 ℃。

1.3.3 實時熒光定量PCR

細胞感染48 h 后用Trizol 收集細胞，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。根據(jù)Genbank 中牛的FMO3，ApoB100，MTTP，ApoE，β-actin基因序列，用Primer5軟件設計引物，引物序列見表1。用StepOnePlus 熒光定量PCR 檢測FMO3、ApoB100、ApoE和MTTP的mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR相關引物

1.3.4 VLDL和TG的收集與檢測

VLDL 收集：細胞培養(yǎng)48 h后，將細胞培養(yǎng)液收集到無菌離心管中，1000 g離心20 min，取上清液，用于后續(xù)的測定。

TG 提取：細胞培養(yǎng)48 h 后，用細胞刮收集于離心管中，按照碧云天細胞裂解液說明書加入細胞裂解液150 μL，待細胞充分裂解后14000 g離心5 min，取上清液用于檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 細胞培養(yǎng)及感染腺病毒結(jié)果

犢牛原代肝細胞分離培養(yǎng)72 h 后，狀態(tài)良好，適合感染腺病毒（見圖1A）。感染病毒后用熒光共聚焦顯微鏡觀察感染率，研究表明，當MOI=100時，感染效率>80%（見圖1B和1C）。

圖1 犢牛原代肝細胞和重組腺病毒感染犢牛原代肝細胞熒光共聚焦結(jié)果(400×)

2.2 FMO3、ApoB100、MTTP和ApoE基因的mRNA表達量

犢牛原代肝細胞感染低表達、過表達和空載體48 h后用qRT-PCR檢測FMO3，ApoB100，ApoE和MTTP基因的mRNA 表達量結(jié)果見圖3A～D。其中，Control 為空白對照組，LOW 為低表達FMO3腺病毒組，OVER為過表達FMO3腺病毒組，NC為腺病毒空載體組，陰性對照。數(shù)值用“平均值±標準誤”表示（n=6），不同字母代表差異顯著（P<0.01）；相同字母代表差異不顯著（P>0.05）。

圖2 犢牛原代肝細胞感染低表達、過表達和空載體48 h后用qRT-PCR檢測FMO3、ApoB100、ApoE和MTTP基因的mRNA表達量

由圖2可知，當細胞感染FMO3 低表達腺病毒時，F(xiàn)MO3、ApoB100 和ApoE的mRNA 水平顯著降低（P<0.01），MTTP基因的表達量與空白對照組相比差異不顯著（P>0.05）；當細胞感染FMO3過表達腺病毒時，F(xiàn)MO3、ApoB100、ApoE和MTTP基因的mRNA 水平顯著增加（P<0.01），NC 組與Control組相比，各基因mRNA水平差異不顯著（P>0.05）。

2.3 細胞上清VLDL和細胞內(nèi)TG濃度測定結(jié)果

根據(jù)Abcam 牛VLDL 和TG ELISA 試劑盒檢測細胞上清VLDL 和細胞內(nèi)TG 的濃度。結(jié)果表明，F(xiàn)MO3 低表達組（LOW）VLDL 的濃度顯著低于空白對照組（P<0.01），高表達組（OVER）顯著高于空白對照組（P<0.01），陰性對照組（NC）也顯著高于空白對照組（P<0.01，見表2）。低表達組與空白對照組相比細胞內(nèi)TG 含量明顯降低（P<0.01），過表達組顯著高于空白對照組（P<0.01），陰性對照組與空白對照組相比無顯著差異（P>0.05，見表3）。

表2 各組VLDL濃度

表3 細胞中甘油三酯濃度

3 討 論

脂肪肝是圍產(chǎn)期奶牛常見多發(fā)的營養(yǎng)代謝性疾病，是能量負平衡而導致的肝臟脂質(zhì)沉積，對奶牛養(yǎng)殖業(yè)的危害較大[14]。能量代謝主要在肝臟進行，肝臟參與脂質(zhì)代謝的多個重要環(huán)節(jié)，包括脂肪酸的攝取與合成，脂質(zhì)的加工、貯存、氧化分解及輸出等[15]。FMO有多個基因型，基因產(chǎn)物多分布于肝組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中[16]。人肝臟中含有3 種FMO，在成人肝臟至少有兩類FMO，其中最主要的是FMO3[17]。FMO3 是近年來發(fā)現(xiàn)的與脂代謝相關的調(diào)節(jié)因子[18]。牛的代謝特征與人和鼠的不同，且奶牛脂肪肝的發(fā)病率高于單胃動物，F(xiàn)MO3與牛的脂代謝是否有關系至今尚未見研究。

VLDL 是肝細胞內(nèi)TG 運出外周組織的唯一因子。VLDL 主要在肝臟合成，其功能是將肝內(nèi)TG以VLDL 的形式從肝臟轉(zhuǎn)移至外周儲存利用[19]。當肝臟內(nèi)脂肪酸顯著升高時，肝臟VLDL輸出總量增加，但并不能減弱脂肪沉積。ApoB100、ApoE 是VLDL 的重要組成部分，ApoB100 是VLDL 中的TG結(jié)合部分，ApoE 是VLDL 由新生到成熟的重要蛋白[9]。有研究表明，過表達ApoE 能恢復小鼠原代肝細胞中VLDL-TG 的代謝，Patatin 樣磷脂酶結(jié)構(gòu)域蛋白7（Patatin-like phospholipase domain contain?ing protein 7，PNPLA7）能通過與ApoE的相互作用調(diào)節(jié)ApoE 的穩(wěn)定性從而調(diào)節(jié)肝臟VLDL 的分泌。MTTP 是VLDL 合成過程中重要的調(diào)節(jié)蛋白，主要功能是將肝細胞中游離的TG 轉(zhuǎn)移到VLDL 上，使TG 隨VLDL 的分泌排出[20]。廣藿香醇可通過增加ApoB100 的分泌和MTTP 的活性來恢復VLDL 的合成和輸出[21-22]。

研究表明，在高脂血癥小鼠體內(nèi)過表達FMO3會增加肝臟和血漿中的脂質(zhì)[12]。本試驗中，F(xiàn)MO3低表達時ApoB100 和ApoE基因的mRNA 表達量顯著低于對照組，表明FMO3低表達會減弱ApoB100和ApoE基因的mRNA 表達水平，過表達FMO3 時ApoB100 和ApoE的mRNA 表達量則顯著升高。MTTP 在FMO3 低表達時與空白對照沒有顯著性差異，但是過表達FMO3 時則顯著升高。而VLDL和TG 在低表達FMO3 組顯著降低，過表達時顯著升高。這些結(jié)果說明了FMO3低表達時，通過抑制ApoB100和ApoE的表達，降低了VLDL的組裝與分泌以及TG 的合成；FMO3 過表達時，通過增加ApoB100、ApoE基因和MTTP的表達增加了VLDL的組裝與分泌及TG 的合成。研究表明，F(xiàn)MO3 過度表達時能增加肝細胞中TG 的沉積，在體內(nèi)可引發(fā)脂肪肝；而FMO3 低表達可降低肝細胞TG 的積聚，從而降低體內(nèi)TG 的含量，減少脂肪肝的發(fā)生，本研究為奶牛脂肪肝的發(fā)生機理和治療奠定理論基礎。