天津地區(qū)黃瓜多主棒孢對啶酰菌胺的敏感性研究

高葦 楊利娟 王勇 馬建芳 劉亞全

摘要：為明確黃瓜多主棒孢（Corynespora cassiicola）對生產(chǎn)上常用防治藥劑啶酰菌胺的敏感性水平，采用平板生長速率測定法，檢測來自天津6個(gè)區(qū)縣的102株黃瓜多主棒孢對煙酰胺類殺菌劑啶酰菌胺的敏感性。結(jié)果表明，天津地區(qū)黃瓜多主棒孢對啶酰菌胺的藥劑敏感性存在較大差異，EC50最小值為0.29μg/mL，最大值為773.33μg/mL；對啶酰菌胺的抗性頻率為78.43%，其中高抗頻率為4.9%。天津地區(qū)黃瓜生產(chǎn)中啶酰菌胺使用頻率較高，啶酰菌胺具有中度抗性風(fēng)險(xiǎn)，該藥劑在天津地區(qū)不適宜用于黃瓜棒孢葉斑病防治。

關(guān)鍵詞：黃瓜；多主棒孢；啶酰菌胺；敏感性；抗性水平

中圖分類號：S482.2文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A論文編號：cjas2020-0042

Sensitivity of Corynespora cassiicola Causing Cucumber Corynespora Spot to Boscalid in Tianjin

Gao Wei1， Yang Lijuan1， Wang Yong1， Ma Jianfang2， Liu Yaquan2

（1Institute of Plant Protection， Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300384， China；

2Agricultural Technology Extension and Service Center in Xiqing District of Tianjin， Tianjin 300381， China）

Abstract： To investigate the sensitivity level of Corynespora cassiicola to boscalid， a new carboxamide， 102 isolates of C. cassiicola in Tianjin were evaluated by mycelial growth rate method. The results showed that there existed significant difference in the sensitivity of C. cassiicola. The minimum value of EC50 was 0.29μg/mL， and the maximum value was 773.33μg/mL. The total resistance frequency of the 102 strains to boscalid was 78.43%， and the high resistance frequency was 4.9%. The application frequency of boscalid in cucumber production in Tianjin is relatively high， and it has moderate resistance risk， which is not suitable for the control of Corynespora leaf spot in Tianjin.

Keywords： Cucumber； Corynespora cassiicola； Boscalid； Sensitivity； Resistance Level

0引言

黃瓜由多主棒孢（Corynespora cassiicola）侵染造成的黃瓜棒孢葉斑病，又叫黃瓜靶斑病，是國內(nèi)黃瓜生產(chǎn)上危害較為嚴(yán)重的病害，在天津、河北、山東等17個(gè)省市嚴(yán)重發(fā)生，田間發(fā)病率10%～25%，嚴(yán)重時(shí)超過60%，甚至導(dǎo)致全棚絕產(chǎn)[1-3]。病原菌多主棒孢寄主范圍廣泛、侵染力強(qiáng)、傳播擴(kuò)散快、極易變異，造成病害一旦發(fā)生難于控制[4-6]。由于缺乏有效的抗病品種，生產(chǎn)上仍以化學(xué)藥劑防治為主。目前，對多主棒孢引起的棒孢葉斑病有效的化學(xué)藥劑主要有啶酰菌胺、氟吡菌酰胺、嘧菌酯、苯醚甲環(huán)唑、咪鮮胺、戊唑醇等[6-9]，國內(nèi)2014年開始才有用于防治黃瓜棒孢葉斑病的化學(xué)藥劑登記[10]，因此，導(dǎo)致農(nóng)民生產(chǎn)上長期存在藥劑使用盲區(qū)，無法及時(shí)選擇有效的藥劑控制其危害。

啶酰菌胺（boscalid）是煙酰胺類內(nèi)吸性殺菌劑，屬于琥珀酸脫氫酶抑制劑（SDHIs），具有抑制病原菌呼吸作用的機(jī)制，被用于多種植物真菌病害的防治[11-12]，2006年在日本登記用來防治黃瓜棒孢葉斑病并取得較好的防效[13- 14]，但隨后又陸續(xù)有抗藥性產(chǎn)生的報(bào)道[15-16]。2008年起開始在國內(nèi)登記用于防治黃瓜灰霉病，同時(shí)發(fā)現(xiàn)其對多種病原靶標(biāo)具有較好的防效，因此成為田間常用的蔬菜真菌病害的廣譜性防治藥劑[17]。由于缺乏黃瓜棒孢葉斑病推薦藥劑，國內(nèi)生產(chǎn)上也常將啶酰菌胺用于黃瓜棒孢葉斑病的防治。2018年朱發(fā)娣等[18]研究發(fā)現(xiàn)，啶酰菌胺對多主棒孢敏感種群毒力高、防效好，但在環(huán)渤海周邊省市多主棒孢種群中發(fā)現(xiàn)了大量抗性菌株，這也是這些地區(qū)黃瓜棒孢葉斑病發(fā)生嚴(yán)重未能及時(shí)防控的主要原因。各省區(qū)開展多主棒孢對啶酰菌胺田間抗性監(jiān)測對黃瓜棒孢葉斑病的有效防控具有重要的意義。本研究采用菌絲生長速率法測定來自天津6個(gè)區(qū)縣的102株黃瓜棒孢葉斑病病原菌對啶酰菌胺的敏感性，分析不同地區(qū)菌株間的敏感性差異和抗藥性水平，旨在為其抗藥性風(fēng)險(xiǎn)評估及合理化學(xué)防治策略制定提供理論依據(jù)，從而保障啶酰菌胺在天津地區(qū)合理應(yīng)用。

1材料與方法

1.1供試菌株

2017—2018年從天津各區(qū)縣黃瓜種植區(qū)采集了黃瓜棒孢葉斑病發(fā)病葉片，對其進(jìn)行組織分離和純化后獲得102株黃瓜多主棒孢，于4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

試驗(yàn)于2017年3月—2018年12月在天津市植物保護(hù)研究所種苗病害研究室進(jìn)行。

1.2試驗(yàn)藥劑

95%啶酰菌胺原藥由北京燕化永樂農(nóng)藥有限公司生產(chǎn)。將該原藥溶于適量丙酮溶劑中，配成濃度為105μg/mL藥劑母液。

1.3黃瓜多主棒孢對啶酰菌胺的敏感性測定

采用菌絲生長速率法。將供試菌株在PDA平板上活化培養(yǎng)，25℃培養(yǎng)5天后，用滅菌的打孔器在菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌餅，將其菌絲面朝下接種于啶酰菌胺濃度為104、103、102、10、1、0.1μg/mL的含藥平板上，放入25℃恒溫箱中培養(yǎng)5天，每個(gè)藥劑濃度處理3次重復(fù)，以加入無菌水的培養(yǎng)基為對照，試驗(yàn)重復(fù)2次。5天后采用十字交叉法測量各處理菌絲塊擴(kuò)展直徑，抑菌率計(jì)算如式（1）。

1.4數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用DPS統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行藥劑濃度與防效之間的線性回歸分析，求出藥劑對每一個(gè)菌株的毒力回歸方程及有效抑制中濃度（EC50）。啶酰菌胺抗性水平標(biāo)準(zhǔn)參照Zhu等[19]的報(bào)道，以啶酰菌胺對黃瓜多主棒孢群體的敏感性基線EC50=0.95±0.51μg/mL為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算抗性水平值（RF），如式（2）。RF≤9.5為敏感菌株（S），9.595為高抗菌株（HR）。依據(jù)抗性菌株在整個(gè)群體中出現(xiàn)的頻率計(jì)算抗性菌株頻率。

2結(jié)果與分析

2.1黃瓜多主棒孢對啶酰菌胺的敏感性

采用菌絲生長速率法測定天津地區(qū)102株黃瓜多主棒孢菌對啶酰菌胺的敏感性，其敏感性分布結(jié)果見圖1。102個(gè)菌株對啶酰菌胺敏感性差異較大，EC50最低為0.29μg/mL，最高為773.33μg/mL，兩者相差2630倍。其中，啶酰菌胺EC50值在0～20μg/mL范圍內(nèi)的菌株數(shù)量最多，有47株，分離頻率46.08%；有5株菌株的EC50值大于100μg/mL，分離頻率4.90%。從EC50值分布圖可以看出，對啶酰菌胺的敏感性不同菌株的出現(xiàn)頻率未呈現(xiàn)出正態(tài)分布，說明天津地區(qū)黃瓜多主棒孢對啶酰菌胺已存在普遍抗性，形成抗啶酰菌胺的穩(wěn)定種群。

2.2不同區(qū)縣黃瓜多主棒孢對啶酰菌胺敏感性差異

采集的102株黃瓜多主棒孢來自天津6個(gè)區(qū)縣的黃瓜種植基地，其對啶酰菌胺的敏感性測定結(jié)果（表1）表明，來源于西青區(qū)病原菌對啶酰菌胺的敏感性最低，其18個(gè)菌株的平均EC50值為（69.99±177.42）μg/mL；來源于寧河區(qū)的菌株對啶酰菌胺的敏感性最高，其6個(gè)菌株的平均EC50值為（18.07±23.73）μg/mL。同一區(qū)縣采集的黃瓜多主棒孢對啶酰菌胺的敏感性差異較大，其中靜海區(qū)多主棒孢菌株間的EC50值差異最大，最大值和最小值相差830倍；北辰區(qū)和寧河區(qū)菌株間EC50值差異較小，最大值和最小值相差17和18倍。

天津地區(qū)黃瓜多主棒孢菌對啶酰菌胺產(chǎn)生了不同程度的抗性，其敏感性菌株頻率僅為21.57%，抗性頻率達(dá)到78.43%；寧河區(qū)菌株以敏感性表型為主，武清區(qū)菌株以中抗菌株為主，其余區(qū)縣黃瓜多主棒孢菌均以低抗水平為主，西青、靜海、武清和寶坻4個(gè)區(qū)縣均出現(xiàn)1～2株高抗菌株。6個(gè)不同區(qū)縣黃瓜多主棒孢抗性菌株頻率統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，其抗性頻率為50.00%～ 85.17%。其中，寧河區(qū)菌株抗性頻率最低，武清區(qū)黃瓜抗性水平最高。

3結(jié)論

本研究采用菌絲生長速率法對天津地區(qū)采集的102株黃瓜多主棒孢菌對煙酰胺類殺菌劑琥珀酸脫氫酶抑制劑啶酰菌胺的敏感性進(jìn)行測定。試驗(yàn)結(jié)果表明，該地區(qū)菌株對啶酰菌胺產(chǎn)生了明顯的抗藥性，且抗性水平差異較大，EC50最低和最高菌株間相差2630倍；不同區(qū)縣獲得菌株抗性水平存在顯著差異，寧河區(qū)以敏感性菌群為主，武清區(qū)抗性菌株分離頻率最高。殺菌劑對病原菌的選擇壓力增大是抗性頻率變高的主要原因，因此殺菌劑的抗藥性監(jiān)測結(jié)果，可指導(dǎo)農(nóng)戶因地制宜合理使用不同作用機(jī)制的農(nóng)藥，抑制抗性種群的發(fā)展，延長藥劑使用壽命，為農(nóng)藥的減量使用提供理論依據(jù)。

4討論

黃瓜棒孢葉斑病是黃瓜生產(chǎn)中的主要病害之一，設(shè)施栽培長期的高溫高濕環(huán)境，為病原的累積和病害的暴發(fā)提供較好的環(huán)境條件[19-20]，造成黃瓜棒孢葉斑病的危害日益嚴(yán)重?；瘜W(xué)防治是目前生產(chǎn)上最直接有效的控制手段，但國內(nèi)對該病害登記藥劑較少，導(dǎo)致農(nóng)民對防治藥劑的選擇存在很大程度的盲目性[21]。啶酰菌胺于2006年在日本登記用于黃瓜棒孢葉斑病的防治，取得了較好的防控效果[22]。2009年發(fā)現(xiàn)使用過啶酰菌胺棚室分離到的多主棒孢藥劑敏感性顯著下降，田間出現(xiàn)抗性群體，因此加強(qiáng)田間抗性水平監(jiān)測對該藥劑的田間應(yīng)用具有重要意義[17-20]。

本研究對2017—2018年采集的天津6個(gè)區(qū)縣的黃瓜多主棒孢進(jìn)行啶酰菌胺的敏感性分析，發(fā)現(xiàn)其對啶酰菌胺的敏感性顯著下降，抗性菌株頻率高達(dá)78.43%，高于Zhu等[19]2019年報(bào)道的抗性頻率66.7%。由于啶酰菌胺近年來在天津地區(qū)被廣泛用于設(shè)施蔬菜灰霉病、菌核病的防治、棒孢葉斑病的防治中，該地區(qū)菌株出現(xiàn)了普遍抗性，敏感性野生菌株分布極少，檢測獲得敏感性較高的菌株大部分來自露地首次種植地塊。因此，天津地區(qū)黃瓜棒孢葉斑病的防治應(yīng)適當(dāng)調(diào)整用藥方法，減少啶酰菌胺及同類型的琥珀酸脫氫酶類殺菌劑的使用頻率和使用量，采用多種類型藥劑交替使用，控制抗藥群體的發(fā)生和蔓延。加強(qiáng)田間病原菌的抗藥性監(jiān)測，及時(shí)控制抗藥群體出現(xiàn)[23-24]。

啶酰菌胺屬于琥珀酸脫氫酶類抑制劑（SDHIs），其抗性主要由病原真菌線粒體復(fù)合物II B/C/D亞基編碼蛋白的核苷酸序列點(diǎn)突變導(dǎo)致，且不同突變位點(diǎn)代表了不同的抗藥水平。下一步研究可以結(jié)合不同抗性水平菌株的靶標(biāo)位點(diǎn)基因檢測，分析該菌株抗藥性產(chǎn)生的機(jī)制，明確是否存在新的突變類型。

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