紅樹莓發(fā)酵果酒及其抗氧化活性

宮祥博 ，延海瑩，田迎櫻，王順濤，王百川，王鵬*

1. 中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院（青島 266003）；2. 中國農(nóng)業(yè)大學(xué)煙臺研究院（煙臺 264000）；3. 煙臺欣和企業(yè)食品有限公司（煙臺 264006）

紅樹莓（Rubus idaeusL.）又名覆盆子、托盤、馬林等，屬薔薇科懸鉤子屬，廣泛分布于溫帶地區(qū)。其果實多汁、酸甜可口，營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，被譽為“黃金水果”[1-2]。相關(guān)研究表明，紅樹莓中含有優(yōu)質(zhì)的黃酮類、酚酸類和萜類等生理活性物質(zhì)，能夠有效清除機體中的自由基，緩解細胞組織過氧化損傷，具有良好食用和藥用價值[3-4]。

果酒通常指以水果為主要原料釀造的飲料，酒精度較低，一般在10%～12%vol，在具備酒香特質(zhì)的同時，保留水果中的特色成分，較于傳統(tǒng)蒸餾酒品具有較高的營養(yǎng)價值。隨著生物技術(shù)的日新月異，多種營養(yǎng)價值豐富的水果得到開發(fā)利用，藍莓果酒[5]、柑橘果酒[6]、桑葚果酒[7]等產(chǎn)品逐漸進入日常生活。樹莓作為新興的第三代小漿果，含有豐富酚類小分子功能成分，逐漸成為果酒開發(fā)的優(yōu)質(zhì)潛在原料之一。

因此，以成熟期紅樹莓為主要原料，建立樹莓果酒的發(fā)酵工藝。對發(fā)酵過程中的特征性功能黃酮類因子進行定量測定，通過體外抗氧化和人臍靜脈內(nèi)皮細胞（HUVEC）氧化應(yīng)激損傷保護作用進行發(fā)酵效果的評估，以期確定最優(yōu)發(fā)酵工藝和紅樹莓果酒的陳釀狀態(tài)，為紅樹莓的加工利用及高值化產(chǎn)品的開發(fā)提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料和試劑

紅樹莓（煙臺康世緣樹莓合作社種植基地）；71B降酸型酵母（法國LAFFORT公司）；RV171型酵母（安琪酵母股份有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）；胎牛血清（杭州四季青公司）；多種抗氧化酶檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所）；葡萄糖、乙醇、蘆丁等（均為國產(chǎn)分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；UV-6000PC紫外可見分光光度計（上海元析儀器有限公司）；DL-CJ-1N型超凈工作臺（北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司）；BJ5060UV型CO2培養(yǎng)箱（德國Heraeus公司）；HWS-24型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 紅樹莓果酒制備工藝流程

紅樹莓→預(yù)處理→酶解→榨汁→成分調(diào)配→接種果酒酵母→主發(fā)酵→倒灌、陳釀→下膠、澄清→二次倒灌→過濾→灌裝→殺菌→產(chǎn)品

1.3.2 發(fā)酵工藝及組別設(shè)置

以調(diào)節(jié)糖度的紅樹莓果汁為主要發(fā)酵原料，輔以菌株生長的必需營養(yǎng)元素；將活化的酵母菌按體積分數(shù)5%接種量無菌接入發(fā)酵罐中發(fā)酵。在主發(fā)酵工藝設(shè)置方面，根據(jù)2種不同果酒酵母和3個適宜發(fā)酵溫度區(qū)間設(shè)置6組主發(fā)酵工藝，依次為1號（71B酵母，發(fā)酵溫度24～28 ℃）、2號（71B酵母，發(fā)酵溫度20～24℃）、3號（71B酵母，發(fā)酵溫度15～20 ℃）、4號（RV171酵母，發(fā)酵溫度24～28 ℃）、5號（RV171酵母，發(fā)酵溫度24～28 ℃）、6號（RV171酵母，發(fā)酵溫度15～20 ℃）。

1.3.3 理化指標的測定

參照國家標準GB/T 15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》對紅樹莓果酒樣品的酒精度、總糖含量和總酸含量進行測定[8]。

1.3.4 花色苷含量測定

采用pH比色示差法測定總花色苷的含量[9]。取2 mL待測樣品液，分別加入pH 1.0和pH 4.5緩沖液，定容至20 mL，振蕩混勻之后于4 ℃靜置2 h。分別于510 nm波長和700 nm波長處測定記錄吸光度?；ㄉ蘸康挠嬎惴椒ㄈ缡剑?）和（2）所示。

式中：A為吸光度；V為提取液總體積，mL；m為取樣品質(zhì)量，g；26 900為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)；449.2為矢車菊素-3-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量。

1.3.5 總黃酮含量測定

采用硝酸鋁-亞硝酸鈉的方法測定總黃酮的含量[10]。以參考文獻方法繪制標準曲線。在樣品測定方面，取適量待測液，加入30%乙醇補充至5.0 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液混合均勻，靜置6 min后，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，繼續(xù)靜置6 min后，加入4 mL 1 mol/L NaOH溶液及0.4 mL超純水，搖勻后靜置15 min，于510 nm處測吸光度，代入標準曲線計算出總黃酮含量。

1.3.6 體外抗氧化評價

使用Fenton反應(yīng)體系測定·OH清除能力[11]。反應(yīng)體系包括1 mL水楊酸-乙醇溶液、FeSO4溶液和不同濃度的樣品液，加入1 mL的H2O2開始反應(yīng)，在37 ℃保溫30 min后，在510 nm處測定吸光度A1?？紤]到多糖本身的吸光度，以蒸餾水代替H2O2，測定多糖的本底吸光度A2。按文獻[11]方法計算·OH清除率。

1.3.7 HUVEC氧化應(yīng)激損傷的保護作用

HUVEC損傷細胞存活率測定，使用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。培養(yǎng)24 h細胞貼壁后，分別加入不同的果酒凍干粉，質(zhì)量濃度梯度為25，50，200和400 μg/mL，設(shè)置4個復(fù)孔，每孔加樣200 μL。孵育24 h之后，將培養(yǎng)基吸出，每孔加入300 μmol/L叔丁基過氧化氫（t-BHP）繼續(xù)培養(yǎng)4 h。同時設(shè)置空白對照組、模型組（只添加t-BHP）和紅樹莓果酒凍干粉組作為對照。使用MTT法檢測細胞存活率。

細胞抗氧化酶的測定參照南京建成生物工程研究所購買的抗氧化酶檢測試劑盒的操作方法，分別對乳酸脫氫酶（LDH）和谷胱甘肽過氧化物酶（GSHPX）的含量進行測定。

1.4 統(tǒng)計分析

利用Excel軟件和SPSS 22.0軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析和處理，每組試驗均重復(fù)3次。

2 結(jié)果和討論

2.1 紅樹莓發(fā)酵果酒指標檢測

2.1.1 酒精度測定

在發(fā)酵過程中，酵母菌可將紅樹莓中的天然糖類成分轉(zhuǎn)化為乙醇，并累積于果酒中，使得果酒具有一定酒精度。酒精度不僅能夠反映酒品中酒精的產(chǎn)生情況，也是體現(xiàn)果酒發(fā)酵進程的重要指標[6]。在紅樹莓果酒的發(fā)酵過程中，6種不同發(fā)酵條件酒精度如表1所示。在起始糖濃度相同的條件下，發(fā)酵終點時刻的酒精度均在12.0%vol左右。

表1 6種樣品的酒精度分析

2.1.2 發(fā)酵果酒樣品營養(yǎng)成分分析

發(fā)酵前后不同工藝制備的紅樹莓果酒營養(yǎng)成分解析結(jié)果如表2所示。發(fā)酵后期總糖濃度顯著下降，主要因為其作為酵母菌生長的碳源被分解利用?；ㄉ赵诎l(fā)酵前后含量變化不顯著。發(fā)酵后期總黃酮濃度顯著升高，表明菌體在生長過程中，將大分子物質(zhì)分解為黃酮類小分子物質(zhì)。對比不同發(fā)酵工藝制備的果酒樣品可知，4號樣品中總酸濃度較低，特征性營養(yǎng)成分花色苷和總黃酮濃度分別為11.49和49.78 mg/100 mL，均高于其他果酒樣品，效果最佳。

表2 不同樣品的營養(yǎng)組分分析

2.2 紅樹莓果酒體外抗氧化評價

2.2.1 羥自由基（·OH）清除

圖1 不同樣品的自由基清除能力

羥自由基可通過電子轉(zhuǎn)移、脫氫或者加成的方法同體內(nèi)的多種分子進行作用，從而造成人體營養(yǎng)物質(zhì)的氧化，結(jié)果導(dǎo)致細胞突變或者壞死[13]。不同紅樹莓果酒對體外羥自由基的清除效果如圖1（A）所示。結(jié)果表明，發(fā)酵后樣品較于原料樹莓汁·OH清除效果較好。4號樣品清除效果最優(yōu)，主要是由于其中含有較高的花色苷、黃酮類抗氧化物質(zhì)[14]。

超氧陰離子是由酶系統(tǒng)自氧化與無酶系統(tǒng)電子轉(zhuǎn)移而產(chǎn)生的，通常與羥基進行結(jié)合，產(chǎn)物對機體DNA有損傷效果，從而破壞機體功能[4]。如圖1（B）所示，不同發(fā)酵條件的紅樹莓果酒對超氧自由基的清除效果也不盡相同。與羥自由基清除效果相似，發(fā)酵后樣品的超氧自由基清除效果顯著提高，且4號樣品清除效果最佳，即采用RV171酵母發(fā)酵，溫區(qū)24～28 ℃發(fā)酵制備的果酒樣品，超氧自由基清除效果可達61.09%。

2.3 紅樹莓果酒對HUVEC氧化應(yīng)激損傷的保護效果評價

2.3.1 細胞損傷修復(fù)效果評價

在細胞水平試驗方面，建立t-BHP損傷的HUVEC模型，并進行4號樣品濃度梯度探究。試驗結(jié)果如圖2所示，通過空白對照組與模型組對比，t-BHP處理后HUVEC細胞存活率降為63.57%（p＜0.01），表明t-BHP造成顯著細胞氧化損傷。通過模型組與試驗組對比，受試物可以顯著提高細胞存活率。發(fā)酵9 d組的細胞存活率效果最好，且相較模型組均顯著提高，表明隨著發(fā)酵進程進行，紅樹莓果酒發(fā)酵液可有效改善HUVEC被t-BHP造成的氧化損傷。

圖2 不同發(fā)酵天數(shù)紅樹莓果酒凍干粉對t-BHP導(dǎo)致的HUVEC細胞存活率的影響

2.3.2 對LDH的影響評價

細胞受到氧化損傷或死亡時，細胞膜結(jié)構(gòu)會被破壞，LDH會被大量釋放到上清培養(yǎng)液中，所以測定上清中LDH水平可以一定程度反映細胞損傷程度[14]。試驗結(jié)果如圖3（A）所示，通過正常組與模型組對比，經(jīng)t-BHP處理細胞后，上清液中的LDH釋放量增加401.39%（p＜0.01），表明t-BHP造成細胞膜破壞。發(fā)酵1，5和9 d的紅樹莓果酒樣品均能顯著降低上清液中的LDH釋放量，發(fā)酵9 d果酒樣品效果最佳。結(jié)果表明，隨著發(fā)酵時間延長，紅樹莓果酒對細胞具有更好的氧化應(yīng)激保護作用，能夠保護細胞膜的結(jié)構(gòu)及完整性。

圖3 紅樹莓果酒凍干粉對t-BHP導(dǎo)致的HUVEC氧化損傷保護作用

2.3.3 對GSH-PX的影響評價

GSH-PX是機體中廣泛存在的一種重要的過氧化物分解酶，是研究細胞抗氧化能力的一種重要指標[15]。不同發(fā)酵時間紅樹莓果酒對GSH-PX的影響效果如圖3（B）所示，通過模型組與正常組對比，t-BHP導(dǎo)致GSH-PX降低44.06%（p＜0.01），表明模型組構(gòu)建成功。隨著發(fā)酵時間延長，細胞內(nèi)GSH-PX濃度逐漸提高，發(fā)酵9 d的紅樹莓果酒樣品處理的細胞，其GSHPX濃度與正常組濃度相似，表明紅樹莓果酒有利于細胞抗氧化系統(tǒng)恢復(fù)。

3 結(jié)論

在試驗過程中，以紅樹莓為主要原料進行發(fā)酵果酒的制備，建立最優(yōu)發(fā)酵工藝，通過體外自由基清除試驗與細胞損傷保護試驗進行果酒抗氧化效果評價。研究發(fā)現(xiàn)，RV171型酵母在24～28 ℃控溫條件下，發(fā)酵效果良好，且在羥自由基（·OH）和超氧自由基（O2-·）清除試驗中效果顯著。最適條件下發(fā)酵9 d的果酒樣品具有更好的細胞損傷保護效果，與模型組相比，試驗組能顯著降低細胞上清液中LDH含量，并顯著升高GSH-PX含量，說明紅樹莓發(fā)酵果酒具有良好抗氧化效果。與此同時，也為紅樹莓相關(guān)功能性健康食品的研發(fā)提供借鑒。