茶皂素的提取及其熱穩(wěn)定性分析

譚登峰，龐錦英，胡華林，孫超

1. 貴州醫(yī)科大學(xué)，省部共建藥物植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（貴陽 550014）；2. 南寧師范大學(xué)化學(xué)與材料科學(xué)學(xué)院（南寧 530001）

茶皂素（Tea saponin）是山茶科（Theaceae）山茶屬（Camellia）植物皂素的統(tǒng)稱[1]，是一類三萜類皂苷混合物[2]，由疏水性的配基、親水性的糖體和有機(jī)酸組成[3-4]。茶皂素具有性溫和、可降解、無毒害等特點(diǎn)，是一種生物活性能和表面活性能優(yōu)異的生物質(zhì)原料，市場價(jià)格較高，純度60%的茶皂素售價(jià)達(dá)5 000萬元/t，在醫(yī)藥、洗滌、紡織、阻燃等領(lǐng)域應(yīng)用廣泛[5-9]。

茶皂素的提取方法主要分為水浸法和有機(jī)溶劑法以及在此基礎(chǔ)上衍生的微波或超聲波輔助提取法[10-11]，其工藝大多以茶皂素提取率或純度中的一種為優(yōu)化對(duì)象，同時(shí)考慮以提取率及純度為優(yōu)化對(duì)象的研究較少，并且多數(shù)醇提或水提后便直接濃縮，缺少后續(xù)的純化步驟，造成提取率及純度都不高。因此，有必要對(duì)茶皂素的提取工藝做進(jìn)一步深入研究。

熱重分析儀（TGA）是利用熱重法來檢測物質(zhì)質(zhì)量隨溫度變化的一種儀器，被廣泛運(yùn)用于天然產(chǎn)物及其改性物的熱穩(wěn)定性研究[12-14]。茶皂素的研究主要集中在提取、分離、生物活性等方面，而對(duì)其材料本身的表征研究較少，特別是在茶皂素的熱穩(wěn)定性方面。鑒于此，試驗(yàn)同時(shí)考慮以提取率及純度為優(yōu)化對(duì)象，采用Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法從廉價(jià)的油茶餅粕中提取高純度的天然茶皂素，確定最優(yōu)提取工藝，進(jìn)而利用熱重分析儀來分析不同純度的茶皂素?zé)岱€(wěn)定性能，以期為油茶餅粕中茶皂素的提取及其在表面活性劑領(lǐng)域中的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑及儀器

油茶餅粕（茶枯，貴州石阡佛頂山野生油茶油業(yè)有限公司）；石油醚、無水乙醇、丙酮、明礬、氧化鈣、鹽酸、碳酸氫銨等（分析純）。

XFB-500型高速中藥粉碎機(jī)（吉首市中湘制藥機(jī)械廠）；AL204-IC型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；DLSB-5/20型低溫冷卻液循環(huán)泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；98-1-B型電子調(diào)溫電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）；N-1000S-WA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（東京理化器械株式會(huì)社）；OSB-2100型油浴鍋（東京理化器械株式會(huì)社）；PC 101NT型化學(xué)隔膜泵（德國vacuubrand公司）；Discovery型熱重分析儀（美國TA公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在前期文獻(xiàn)調(diào)研及單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，選取對(duì)茶皂素提取影響較大的乙醇體積分?jǐn)?shù)、液固比、浸提溫度、浸提時(shí)間等因素進(jìn)行Box-Behnken試驗(yàn)，以茶皂素提取率及純度為指標(biāo)，采用Design-Expert軟件中的Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)法優(yōu)化茶皂素的提取工藝，其因素和水平數(shù)值見表1。

1.2.2 提取方法

取一定量經(jīng)粉碎的冷榨油茶餅粕，用5倍量的石油醚50 ℃回流1 h，去茶油，過濾，殘?jiān)猛瑯拥姆椒ń嵋淮芜^濾，揮發(fā)石油醚得脫脂油茶餅粕；將20 g脫脂油茶餅粕添加到500 mL圓底燒瓶中，用電熱套進(jìn)行加熱浸提，各提取條件按Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法來進(jìn)行，趁熱過濾，并用同一浸提溶劑洗滌殘?jiān)?次，合并濾液；待濾液濃縮成漿狀時(shí)，停止加熱，加入漿狀濾液質(zhì)量10%明礬，充分?jǐn)嚢?5 min，靜置1 h后分離沉淀劑，即得漿狀茶皂素粗品，干燥后記為CZS-1。茶皂素提取率計(jì)算方法見式（1）。

1.2.3 純化方法

將漿狀茶皂素粗品加入圓底燒瓶，并加入質(zhì)量5%氧化鈣，充分?jǐn)嚢?5 min，靜置1 h，過濾分離；將碳酸氫銨加入沉淀物中，使茶皂素轉(zhuǎn)化成液體，過濾，得茶皂素液體，干燥后記為CZS-2。

1.2.4 茶皂素含量測定

參照SN/T 1852—2006法[15]，并略有修改。精密稱取約1.5 g粉狀試樣置于三角燒瓶中，加10 mL去離子水溶解后加12 mL 36%鹽酸，接蛇形冷凝管置通風(fēng)櫥中100 ℃回流2 h，取出冷卻至室溫，沉淀過濾洗滌至中性；將沉淀和濾紙置于85 ℃真空干燥箱中烘干，用濾紙包好置于索氏提取器內(nèi)，用丙酮作溶劑，于75 ℃抽提2 h，回收丙酮至干，接收瓶和提取物放入110±2℃烘箱中干燥2 h，取出，放入干燥器中冷卻0.5 h后稱其質(zhì)量，重復(fù)上述步驟，至前后2次質(zhì)量之差不超過2 mg，即為恒質(zhì)量。茶皂素含量計(jì)算方法見式（2）。

式中：W為茶皂素含量，%；m0為空白殘留物質(zhì)量，g；m1為樣品質(zhì)量，g；m2為接收瓶質(zhì)量，g；m3為恒質(zhì)量后接收瓶和抽提物質(zhì)量，g。

1.2.5 熱穩(wěn)定性分析

分別稱取約5 mg茶皂素樣品CZS-1和CZS-2，采用熱重分析儀以20 ℃/min升溫速率，從40 ℃升溫到750℃，N2為測試氣氛，氣體流速10 mL/min。

2 結(jié)果與討論

2.1 茶皂素的提取

2.1.1 模型及回歸方程的建立

Box-Behnken的四因素三水平試驗(yàn)結(jié)果見表2，共29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)。其中，試驗(yàn)號(hào)10，14，17，19和27為中心試驗(yàn)，其余為析因試驗(yàn)。29個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)又可分為零點(diǎn)和析因點(diǎn)，其中零點(diǎn)為效應(yīng)面的中心點(diǎn)，試驗(yàn)重復(fù)5次，用于評(píng)估試驗(yàn)誤差[16]；析因點(diǎn)為自變量值A(chǔ)、B、C、D所構(gòu)成的四維頂點(diǎn)。茶皂素提取率及純度試驗(yàn)值見表2。

表2 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

選用模型Quadratic回歸方程分析法分析，可得各因素對(duì)茶皂素提取率及純度影響的多元回歸預(yù)測模型方程，如表3所示。

表3 響應(yīng)指標(biāo)的預(yù)測模型

2.1.2 方差分析

表4 提取率方差分析

表5 純度方差分析

由表4可知，以茶皂素提取率為響應(yīng)值，模型p＜0.000 1，說明該模型極顯著，失擬項(xiàng)p=0.156 9＞0.100 0，表明該數(shù)學(xué)模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合較好，可用于推測試驗(yàn)結(jié)果。多元方程相關(guān)系數(shù)為R2=0.903 1，可說明90.31%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋。校正判定系數(shù)0.806 1，說明該數(shù)學(xué)模型能較好地預(yù)測提取條件與提取率之間的關(guān)系。由F值大小還可知，各因素對(duì)茶皂素提取率影響的主次順序?yàn)椋篈＞D＞B＞C，即乙醇質(zhì)量分?jǐn)?shù)＞液固比＞浸提溫度＞浸提時(shí)間。

由表5可知，以茶皂素純度為響應(yīng)值，模型p＜0.000 1，說明模型極顯著，失擬項(xiàng)p=0.089 4＞0.100 0，表明該數(shù)學(xué)模型與試驗(yàn)結(jié)果擬合較好，可用于推測試驗(yàn)結(jié)果。多元方程相關(guān)系數(shù)R2=0.916 2，可說明91.61%的數(shù)據(jù)可用此方程解釋。校正判定系數(shù)0.832 3，說明該數(shù)學(xué)模型能較好地預(yù)測提取條件與提取率之間的關(guān)系。由表5可知，AD、BC的交互影響差異顯著，其他因素交互影響差異不顯著。

2.1.3 交互因子的響應(yīng)面分析

等高線形狀可以反映各因素交互作用大小，其排列密集程度可表明各因素對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響程度；響應(yīng)曲面圖能直觀反映各因素對(duì)響應(yīng)指標(biāo)影響的整體趨勢[17]。根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果和回歸方程，各因素對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的影響可用等高線圖及響應(yīng)面圖表示，在試驗(yàn)中，乙醇體積分?jǐn)?shù)、浸提溫度、浸提時(shí)間和液固比交互因子對(duì)響應(yīng)指標(biāo)的等高線圖和響應(yīng)面圖如圖1和圖2所示。由圖1可知，在浸提溫度和浸提時(shí)間不變的情況下，響應(yīng)面圖為一坡度較大曲面，說明各混料因子之間交互作用明顯。固定液固比，響應(yīng)指標(biāo)提取率先升后降，且有最大值，表明乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)茶皂素提取率影響較大，這與提取率方差分析結(jié)果一致。圖2描述各因素對(duì)茶皂素純度的影響作用，在浸提溫度和浸提時(shí)間不變的情況下，響應(yīng)面圖為一坡度較大曲面，說明各因素之間交互作用明顯。固定乙醇體積分?jǐn)?shù)，響應(yīng)指標(biāo)純度先升后降，且有最大值，表明液固比對(duì)茶皂素純度影響較大；由等高線圖可知，乙醇體積分?jǐn)?shù)與液固比的交互作用顯著，這與純度方差分析結(jié)果一致。

2.1.4 驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)結(jié)果和回歸方程得到最優(yōu)預(yù)測提取工藝，即乙醇體積分?jǐn)?shù)83.73%、浸提溫度79.56 ℃、浸提時(shí)間3.10 h和液固比10.38∶1（mL/g）。在該工藝下，模型預(yù)測茶皂素提取率和純度分別為13.80%和63.86%?？紤]試驗(yàn)操作便利，優(yōu)選工藝為：乙醇體積分?jǐn)?shù)84%、浸提溫度80 ℃、浸提時(shí)間3 h和液固比10∶1（mL/g）。依據(jù)優(yōu)選工藝進(jìn)行茶皂素的提取，重復(fù)3次取平均值，茶皂素粗品（CZS-1）的提取率和純度分別為13.52%和63.92%，與預(yù)測值基本相符，表明優(yōu)選工藝可用于茶皂素的提取。

圖1 交互因子對(duì)提取率影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

圖2 交互因子對(duì)純度影響的等高線圖和響應(yīng)面圖

2.2 熱穩(wěn)定性分析

為考察不同純度茶皂素?zé)岱€(wěn)定性能，將茶皂素粗品（CZS-1）按1.2.3的純化方法，可得精制茶皂素（CZS-2），其純度為86.24%。不同純度茶皂素?zé)峤到庑袨橐妶D3和表6。由圖3可知，2個(gè)不同純度茶皂素的熱穩(wěn)定性分別在低溫區(qū)和高溫區(qū)展示出不同的變化規(guī)律。分解溫度低于430 ℃，兩者的降解行為相似，但純度越高，茶皂素在低溫區(qū)的熱穩(wěn)定性越差。這可能的原因是茶皂素純度越大，如—O—、—OH、—COO—、—COOH等強(qiáng)電負(fù)性的含氧親水基團(tuán)含量也增大，在體系中更容易吸潮，且生成受熱容易降解的氫鍵。當(dāng)分解溫度高于430 ℃時(shí)，兩者關(guān)系正好相反。由表2可知，茶皂素純度越高，其低溫區(qū)第一和第二階段最大分解溫度也隨之降低，該階段與水分的增加有關(guān)，說明茶皂素純度越高，體系越易吸潮，生成易降解的氫鍵。分解溫度700 ℃時(shí)，CZS-1和CZS-2的殘?zhí)柯史謩e為2.3%和21.5%。結(jié)果表明茶皂素純度越高，其高溫殘?zhí)柯试礁摺７治銎湓蚩赡苁羌兌仍礁?，體系中容易結(jié)碳的C—C五環(huán)結(jié)構(gòu)比例就越大，促進(jìn)材料在高溫區(qū)快速成碳，體系的感溫穩(wěn)定性提高。

圖3 CZS-1和CZS-2的熱降解曲線

表6 CZS-1和CZS-2的熱降解數(shù)據(jù)

3 結(jié)論

在前期文獻(xiàn)調(diào)研及預(yù)試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過Box-Behnken試驗(yàn)優(yōu)化，獲得茶皂素提取的最佳工藝：乙醇體積分?jǐn)?shù)84%、浸提溫度80 ℃、浸提時(shí)間3 h和液固比10∶1（mL/g）。在該工藝下，模型預(yù)測茶皂素提取率和純度分別為13.52%和63.92%。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果與預(yù)測值基本相符，試驗(yàn)?zāi)Ｐ蛢?yōu)化工藝與預(yù)測值可信度高，可用作茶皂素的提取工藝。

在相同升溫速率下，當(dāng)分解溫度＜430 ℃時(shí)，茶皂素純度越高，其熱穩(wěn)定性越差；當(dāng)分解溫度＞430℃時(shí)，兩者關(guān)系正好相反。當(dāng)分解溫度為700 ℃時(shí)，茶皂素純度越高，其高溫殘?zhí)夹阅茉胶谩?/p>