八角茴香提取液的抑菌效果及穩(wěn)定性探討

孫長花 ，王征遠，劉俊，王晟

1. 揚州市職業(yè)大學(xué)生物與化工工程學(xué)院（揚州 225009）；2. 揚州大學(xué)江蘇省動物遺傳繁育與分子設(shè)計重點實驗室（揚州 225009）

隨著社會經(jīng)濟發(fā)展和生活水平不斷提高，食品安全成為消費者和食品工業(yè)共同關(guān)心的熱點問題。化學(xué)防腐劑殘留問題凸顯，對天然防腐劑需求不斷增加，天然植物源食品防腐劑由于其安全高效的特點受到廣泛關(guān)注[1]。其中，天然食用香辛料因具有抑菌[2]、抗氧化[3-4]作用，對其防腐保鮮的研究成為熱點。

八角茴香（Illicium verum），又稱八角、大茴香等，是木蘭科八角屬植物八角樹的果實，其性溫、味辛，是我國重要的“藥食同源”植物材料[5]。八角的主要成分是八角揮發(fā)油（茴香油），主要成分為反式茴香腦，另含有少量的反式肉桂醛和甲基丁香酚等[6-7]，具有抑菌作用[8-9]。關(guān)于八角茴香中抑菌成分研究主要集中于提取方法和工藝[10-13]，以及在食品防腐保鮮的應(yīng)用[14-15]，而未見其抑菌穩(wěn)定性的研究報道。試驗旨在對八角茴香提取液的抑菌作用、最小抑菌濃度及影響抑菌穩(wěn)定性的因素進行研究，以期為八角茴香作為天然防腐劑原料在食品防腐保鮮中的運用提供理論參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

八角（產(chǎn)地廣西，揚州眾成堂大藥房）；大腸桿菌、表皮葡萄球菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌（揚州市職業(yè)大學(xué)微生物實驗室提供）；平板計數(shù)瓊脂培養(yǎng)基；無水乙醇、丙酸、氫氧化鈉、濃鹽酸、氯化鈉、氯化鈣、氯化鉀、硫酸亞鐵、氯化鐵（均為分析純）。

1.2 儀器與設(shè)備

JA2003N電子天平（上海精密儀器有限公司）；多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）；JY92-IIDN超聲波細胞粉碎機（寧波新芝生物科技股份有限公司）；SHB-III循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海賢德實驗儀器有限公司）；LDZX-50KB立式壓力蒸汽滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；SW-CJ-2FD型雙人單面凈化工作臺（蘇州凈化設(shè)備廠）；HPX-80生化培養(yǎng)箱（上海躍進醫(yī)療器械有限公司）；DHG-9003電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 八角茴香提取液的制備

八角茴香粉碎，過孔徑0.180 mm篩。準(zhǔn)確稱取一定量粉末，按照料液比1∶10（g/mL）加入95%乙醇溶液，置于超聲波破碎儀中浸提50 min。采用真空泵抽濾，收集濾液，真空低溫旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，制得八角茴香提取液。

1.3.2 菌懸液的制備

將實驗室提供的菌種進行活化，并用平板稀釋法測定菌落總數(shù)。用無菌生理鹽水將活化后的細菌稀釋為含菌數(shù)5×108CFU/mL的菌懸液。

1.3.3 抑菌圈的測定——牛津杯法

取各種供試菌懸液100 μL于平板上，均勻涂布。用鑷子將3只無菌的牛津杯放入培養(yǎng)皿中，輕輕按壓，使牛津杯和培養(yǎng)基表面接觸緊實。吸取250 μL八角茴香提取液至牛津杯中。將培養(yǎng)皿正置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后觀察，用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈直徑。每組重復(fù)3次，取平均值[16]。設(shè)置無菌水作陰性對照，并以0.5%山梨酸鉀溶液的抑菌試驗作陽性對照。

1.3.4 最低抑菌濃度

采用二倍稀釋法[17]，將八角茴香提取液（1 g/mL）用無菌水稀釋為原溶液的100%，50%，25%，12.5%，6.25%，3.125%，1.563%和0.782%等8個濃度（即提取液濃度分別為1.000 0，0.500 0，0.250 0，0.125 0，0.062 5，0.031 2和0.015 6 g/mL），分別吸取1 mL不同稀釋度的提取液至無菌平皿中，加15 mL培養(yǎng)基，充分混合均勻。待培養(yǎng)基冷卻凝固后，取100 μL供試菌懸液于平板上，均勻涂布。將培養(yǎng)皿倒置于培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下培養(yǎng)24 h，觀察供試菌生長狀況，每組重復(fù)3次。

1.3.5 熱處理對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

將八角茴香提取液分別在65，80，100和121 ℃下處理30 min，以未處理過的提取液作對照，分別對供試菌進行抑菌試驗，測定抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

1.3.6 pH對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

用丙酸或NaOH溶液將八角茴香提取液分別調(diào)至pH 2，4，8和10，以未處理過的提取液（pH 6）作對照，分別對供試菌進行抑菌試驗，測定抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

1.3.7 紫外線照射對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

將八角茴香提取液分別在紫外燈下照射10，20，30和40 min，以未處理過的提取液作對照，分別對供試菌進行抑菌試驗，測定抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

1.3.8 金屬離子對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

八角茴香提取液中分別加入1 mol/L K+、Na+、Ca+、Fe2+、Fe3+等，以未處理過的提取液作對照，分別對供試菌進行抑菌試驗，測定抑菌圈直徑，每組重復(fù)3次。

1.3.9 數(shù)據(jù)處理與分析

采用Graphpad Prism 7.0進行數(shù)據(jù)處理與分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 八角茴香提取液的抑菌效果

采用牛津杯法，研究八角茴香提取液對常見致病細菌的抑菌效果，結(jié)果見圖1。

從圖1可以看出，八角茴香提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌抑菌作用明顯，形成明顯的抑菌圈，且抑菌圈的直徑明顯比同等條件下0.5%山梨酸鉀的抑菌圈直徑大。通過抑菌圈直徑測量可知，八角茴香提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為29.6，30.2，33.5和34.8 mm；山梨酸鉀溶液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為13.6，12.8，12.2和17.1 mm。因此，八角茴香提取液對食品中常見的細菌具有良好抑菌效果。

圖1 八角茴香提取液對常見細菌的抑菌效果

2.2 八角茴香提取液的最低抑菌濃度

采用二倍稀釋法，進行八角茴香提取液最低抑菌濃度試驗，確定八角茴香提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度。結(jié)果如表1所示。

由表1可知，八角茴香提取液對不同細菌的最低抑菌濃度不同。八角茴香提取液濃度0.031 2 g/mL時，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌出現(xiàn)菌落，則八角茴香提取液對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度0.062 5 g/mL；八角茴香提取液濃度稀釋到0.015 6 g/mL時，枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌有菌落出現(xiàn)，表明八角茴香提取液對二者的最低抑菌濃度為0.031 2 g/mL。

表1 八角茴香提取液的最低抑菌濃度

2.3 熱處理對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

在食品的加工過程中，熱處理是常用工序，探究對八角茴香提取液進行不同條件的熱處理，并進行抑菌試驗，確定其熱穩(wěn)定性，結(jié)果見圖2。

由圖2可以看出，隨著熱處理溫度提高，八角茴香提取液對4種供試菌的抑菌效果呈下降趨勢。經(jīng)過65 ℃和80 ℃加熱處理，提取液對4種供試菌的抑菌圈直徑小幅減小，抑菌效果略有下降，但仍然保持明顯抑菌作用。經(jīng)過100 ℃處理后，抑菌圈直徑減小23%以上，其中對表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑減小30.7%，抑菌效果下降。尤其是經(jīng)過121 ℃處理后，提取液的抑菌圈直徑減小超過43%，抑菌效果明顯大幅下降。表明八角茴香提取液具有熱敏性，長時間的高溫處理明顯影響其抑菌效果，因此，八角茴香提取液應(yīng)用于食品保鮮時，應(yīng)避免長時間高溫處理。

圖2 熱處理對八角茴香提取液抑菌效果的影響

2.4 pH對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖3可以明顯看出，八角茴香提取液的抑菌效果受pH影響，且變化顯著。與對照相比，在中性及酸性條件下，提取液抑菌圈直徑大小沒有明顯變化，抑菌效果均較好，但在堿性條件下，提取液未形成抑菌圈，完全沒有抑菌效果。結(jié)果表明，提取液在酸性條件下穩(wěn)定性好，而在堿性環(huán)境中被破壞，因此，將八角茴香提取液應(yīng)用于食品保鮮時，不宜用于堿性環(huán)境。

圖3 pH對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

2.5 紫外照射對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖4可知，和對照相比，經(jīng)過不同時長的紫外照射處理，八角茴香提取液的抑菌圈直徑并未出現(xiàn)明顯變化，提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑變化分別小于5.4%，9.3%，7.8%和8.9%，抑菌活性基本保持穩(wěn)定。結(jié)果表明，八角茴香提取液抑菌性對紫外照射的穩(wěn)定性較好。

2.6 金屬離子對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

由圖5可以看出，加入K+、Na+、Ca+、Fe2+、Fe3+等金屬離子后，對八角茴香提取液的抑菌效果的影響較小，提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑變化分別小于6.1%，12.2%，8.7%和11.5%，抑菌活性較穩(wěn)定。結(jié)果表明，八角茴香提取液的抑菌作用對金屬離子的穩(wěn)定性較好。

圖4 紫外照射對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

圖5 金屬離子對八角茴香提取液抑菌穩(wěn)定性的影響

3 結(jié)論與討論

八角茴香的主要成分含茴香油，具有抑菌防腐作用。八角茴香提取液對食品中常見的細菌抑菌作用明顯，其中對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的抑菌圈直徑分別為29.6，30.2，33.5和34.8 mm。八角茴香提取液對不同細菌的最低抑菌濃度也不同，其中對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.062 5 g/mL，對枯草芽孢桿菌和表皮葡萄球菌的最低抑菌濃度為0.031 2 g/mL。

對八角茴香提取液的抑菌穩(wěn)定性研究發(fā)現(xiàn)，八角茴香提取液在酸性環(huán)境、紫外照射和K+、Na+、Ca+、Fe2+、Fe3+等金屬離子存在情況下，具有較好抑菌穩(wěn)定性，但是對長時間高溫處理和堿性環(huán)境敏感。因此，八角茴香提取液可以適用于多種食品的防腐保鮮，應(yīng)用時避免長時間高溫處理和堿性環(huán)境。

八角茴香是生活中常見的香料，其價格低、分布廣、來源泛、易獲取。八角中含有的天然抑菌成分對常見細菌的抑菌效果好，且對加工條件具有廣泛適用性，因此，八角茴香作為天然防腐劑原料進行研究開發(fā)，并運用于食品的防腐保鮮，具有較好應(yīng)用前景。