星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選陳皮健脾固體飲品的提取工藝

羅春花，馮露星，唐雨菲，李明慧，覃小麗，陳衛(wèi)衛(wèi)

廣西中醫(yī)藥大學(xué)（南寧 530200）

中醫(yī)理論認(rèn)為，脾胃為氣血生化的源泉，脾為后天的根本，后天是元?dú)庵荆獨(dú)馐巧眢w健康的基礎(chǔ)[1]。陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的保健功效[2]；而蓮子可健脾益腎、養(yǎng)心安神[3]，兩者合用具有健脾祛濕、理氣安神等保健效果，使脾胃生化有力、氣血充足，可改善氣虛體質(zhì)狀態(tài)。目前保健固體飲品已成為繼碳酸飲料、瓶裝水、果汁飲料之后迅速發(fā)展起來的一種健康飲品。此款飲品是通過引進(jìn)多學(xué)科交叉技術(shù)經(jīng)加工、調(diào)配（或不調(diào)配）等工藝制成的固體飲品，具有體積小、攜帶和運(yùn)輸方便、包裝簡易、沖水速溶、飲用方便、易于保持衛(wèi)生等特點(diǎn)，能滿足普通大眾甚至不健康人群保健養(yǎng)生的不同需求，故開發(fā)前景廣闊。試驗(yàn)以陳皮、蓮子為主料，采用適宜技術(shù)最大程度提取功效成分、保留甘甜口感、去除不良?xì)馕?，擬開發(fā)出一款具有健脾祛濕、理氣安神等保健效果的固體飲品。陳皮、蓮子均屬食藥兩用植物，長期合理食用，不會產(chǎn)生急性、亞急性或者慢性危害，可滿足健康或亞健康人群“治未病”的需要。

在不改變傳統(tǒng)提取方法的基礎(chǔ)上，并考慮工業(yè)大生產(chǎn)的實(shí)際操作、成本等因素，故仍采用水煎煮法提取。橙皮苷為陳皮的主要有效成分，可反映該飲品的保健效果。故試驗(yàn)以橙皮苷含量和橙皮苷在干膏中質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為評價(jià)指標(biāo)，以提取時(shí)間和加水倍數(shù)作為考察因素，用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選陳皮健脾固體飲品的最佳提取工藝，具有實(shí)際意義，可為后續(xù)該產(chǎn)品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 儀器、設(shè)備與試藥

1.1 儀器與設(shè)備

Waters e2695高效液相色譜儀（沃特世科技有限公司）；101-2型電熱鼓風(fēng)干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；TGL-16G高速臺式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；CPA225D電子天平（北京賽多利斯系統(tǒng)儀器有限公司）；UPC-II-10T超純水器（四川優(yōu)普超純科技有限公司）；HWS-8型電熱恒溫水浴鍋（上海博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；98-1-B型電熱套（天津市泰斯特儀器有限公司）。

1.2 試藥

橙皮苷對照品（中國食品藥品檢定研究所，批號：110721-201617）；藥材購自廣西仙茱中藥科技有限公司，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)寧小清高級實(shí)驗(yàn)師鑒定，符合《中國藥典》2015年版一部要求；高效液相使用色譜純試劑，其余為分析純試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 橙皮苷的測定

2.1.1 色譜條件

ODS-2 HYPERSIL色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-0.1%磷酸溶液，等度洗脫（洗脫程序如表1所示），流速為1.0 mL/min，檢測波長為283 nm，柱溫為30 ℃。

表1 流動相等度洗脫程序

2.1.2 對照品溶液的制備

取橙皮苷對照品適量，精密稱定，加甲醇溶解制成質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL的橙皮苷對照品溶液，即可。

2.1.3 供試品溶液的制備

按處方量稱取藥材1份，加入10倍水，煎煮法提取1 h/次，共提取2次，濾過，合并濾液，定容。取適量濾液至離心管中，放至13 000 r/min高速離心機(jī)中離心，離心完成后，用潔凈的注射器吸取上清液，用0.22 μm水相微孔濾膜濾過，即得。

2.1.4 陰性對照溶液的制備

按處方稱取除陳皮外其他藥材，依“2.1.3”項(xiàng)下方法制備缺陳皮的陰性對照溶液。

2.1.5 方法學(xué)考察

2.1.5.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

精密吸取“2.1.2”項(xiàng)橙皮苷對照品溶液1，2，3，4，5和6 μL，分別注入高效液相色譜儀，以峰面積（Y）為縱坐標(biāo)、進(jìn)樣量（X）（μg）為橫坐標(biāo)，根據(jù)峰面積結(jié)果繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并求得橙皮苷的線性回歸方程：Y橙皮苷=2.00×106X-17 072（r=0.999 9）。結(jié)果說明橙皮苷進(jìn)樣量在0.400 0～2.400 0 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。

2.1.5.2 專屬性試驗(yàn)

取對照品溶液、供試品溶液、陰性對照溶液（缺陳皮），按“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)行測定。由圖1結(jié)果可知，對照品溶液中橙皮苷的色譜峰與供試品溶液中橙皮苷的色譜峰的出峰位置一致，陰性對照液色譜圖中在橙皮苷色譜峰位置不出峰，表明陰性對照液（缺陳皮）中無橙皮苷含量測定的干擾成分。結(jié)果見圖1。

2.1.5.3 精密度試驗(yàn)

取“2.1.2”項(xiàng)下對照品溶液，按“2.1.2”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6針，測定峰面積。結(jié)果顯示，色譜峰面積的RSD值為0.50%（n=6），表明儀器的精密度良好。

2.1.5.4 重復(fù)性試驗(yàn)

按處方量稱取藥材，按“2.1.3”項(xiàng)方法平行制備6份供試品溶液，分別進(jìn)樣，測定峰面積，并計(jì)算RSD。結(jié)果顯示，橙皮苷含量平均值為0.632 4 mg/g，RSD值為1.85%（n=6），表明提取方法重復(fù)性良好。

圖1 陳皮健脾固體飲品的提取工藝專屬性試驗(yàn)結(jié)果

2.1.5.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

稱取處方量藥材1份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項(xiàng)下色譜條件，進(jìn)樣體積為5 μL，以相同的方法分別測定供試品溶液的峰面積，測定時(shí)間點(diǎn)為0，4，8，12，24和36 h。結(jié)果顯示，色譜峰面積的RSD為0.98%（n=6），表明供試品溶液在36 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.5.6 加樣回收試驗(yàn)

稱取處方量藥材9份，對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比控制在1.5∶1，1∶1和0.5∶1左右，每個比例平行操作3份，按“2.1.3”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，根據(jù)“2.1.1”項(xiàng)下的色譜條件分別進(jìn)樣，測定橙皮苷含量，計(jì)算出橙皮苷平均回收率分別為98.67%，93.96%和100.9%，RSD分別為2.44%，2.60%和1.73%。

2.1.5.7 樣品含量的測定

按處方量稱取3批不同批號藥材，按照“2.1.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，按照“2.1.1”色譜條件，測定峰面積，計(jì)算橙皮苷的平均含量。結(jié)果得出：橙皮苷的平均含量為12.741 9 mg/g，RSD值為2.60%。

2.2 橙皮苷在干膏中質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定方法

精密吸取陳皮健脾固體飲品溶液10 mL，置于恒質(zhì)量的蒸發(fā)皿中，水浴加熱將藥液揮發(fā)至不流動狀態(tài)，105 ℃干燥，置于干燥器中，冷卻30 min，迅速精密稱定，直至干膏恒質(zhì)量成功，并計(jì)算橙皮苷在干膏中質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

橙皮苷在干膏中質(zhì)量分?jǐn)?shù)=M/G×100% （1）式中：M為供試品溶液中橙皮苷總質(zhì)量，mg；G為供試品溶液的干膏總質(zhì)量，mg。

2.3 星點(diǎn)試驗(yàn)優(yōu)化提取工藝條件

2.3.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

結(jié)合原方的提取方法、單因素試驗(yàn)結(jié)果和實(shí)際生產(chǎn)經(jīng)驗(yàn)，采用水煎提取法，將提取次數(shù)定為2次，考察因素為加水倍數(shù)、提取時(shí)間。根據(jù)星點(diǎn)設(shè)計(jì)的原理，每個因素設(shè)5個水平，代碼值所代表的實(shí)際操作物理量見表2。

表2 因素代碼水平及對應(yīng)物理量

試驗(yàn)是以橙皮苷含量和橙皮苷在干膏中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為評價(jià)指標(biāo)。數(shù)據(jù)處理方法為“歸一值”，各指標(biāo)均標(biāo)準(zhǔn)化為0～1間的“歸一值”，各指標(biāo)的“歸一值”求算幾何平均數(shù)，得總評“歸一值”，即OD=（d1×d2×d3）1/3。對于取值越大越好和越小越好的指標(biāo)采用Hassan方法進(jìn)行數(shù)學(xué)轉(zhuǎn)換求“歸一值”，試驗(yàn)所用指標(biāo)均要求越大越好，轉(zhuǎn)換公式為di=（yi-ymin）/（ymax-ymin）。

2.3.2 星點(diǎn)設(shè)計(jì)結(jié)果

星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)安排及結(jié)果見表3。

表3 星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)及結(jié)果

2.3.3 模擬擬合

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，以O(shè)D值為指標(biāo)對各因素進(jìn)行多元線性回歸，擬合方程為Y=-0.800 06+0.083 475X1+2.094 75×10-3X2（r=0.934 6，p＜0.000 1）。從擬合方程的相關(guān)系數(shù)可知，OD值與2個考察因素之間線性相關(guān)性結(jié)果不理想，因此該模型不合適，因此選擇采用多元二次項(xiàng)擬合分析。多元二次項(xiàng)擬合方程為Y=-1.6174 9+0.158 68X1+0.010 165X2-5.921 90×10-5X1X2-2.495 74×10-3X12-4.022 93×1（r=0.974 8，p＜0.000 1）。結(jié)果顯示非線性的r值更高，擬合效果更好。

2.3.4 方差分析

由表4可知，多元二項(xiàng)式回歸方程失擬檢驗(yàn)不顯著，說明未知因素對試驗(yàn)結(jié)果干擾很小，模型擬合檢驗(yàn)高度顯著，為成功模型。除X1X2、回歸系數(shù)不顯著外，其他均達(dá)到顯著水平。

表4 回歸模型方差分析結(jié)果

2.3.5 效應(yīng)面優(yōu)化和預(yù)測

采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)軟件，得到陳皮健脾固體飲品的提取工藝的三維效應(yīng)曲面圖和等高線圖，見圖2和圖3，由數(shù)據(jù)處理結(jié)果分析可得到優(yōu)化提取工藝條件為加水量18.24倍、提取時(shí)間1.88 h，可預(yù)測出總評OD值為0.959 7。鑒于試驗(yàn)操作的可行性，并結(jié)合工業(yè)大生產(chǎn)的實(shí)際操作可行性情況考慮，確定最佳工藝條件為加水量18倍，每次提取2 h，共提取2次。

圖2 提取時(shí)間與加水倍數(shù)對總評歸一值影響的三維效應(yīng)面圖

圖3 提取時(shí)間與加水倍數(shù)對總評歸一值影響的二維等高線圖

2.3.6 提取工藝的驗(yàn)證試驗(yàn)

按選取的最佳提取工藝：加水量18倍，每次提取2 h，共提取2次，提取3批樣品，結(jié)果橙皮苷含量均值為20.300 4 mg/g，橙皮苷在干膏中質(zhì)量分?jǐn)?shù)均值為30.406 67%，實(shí)測OD值為0.997 2，與方程預(yù)測值比較，偏差率為-3.91%。表明所建立的數(shù)學(xué)模型具有良好的預(yù)測性，所選工藝條件穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好。

3 討論

3.1 提取方法及考察因素的選擇

提取中藥是一個十分復(fù)雜的過程，對藥物的提取質(zhì)量、有效成分的提取率產(chǎn)生影響的因素有很多，例如提取時(shí)間、提取溶劑、提取次數(shù)、提取溫度等，同時(shí)也會影響成藥療效[4]。綜合考慮能源的損耗、后續(xù)放大生產(chǎn)的合理性，故將提取次數(shù)定為2次。由于處方為傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)方，考慮不改變原有煎煮方法，并且結(jié)合在大生產(chǎn)過程中需考慮成本等因素，故仍然采用水煎煮法提取。因現(xiàn)有試驗(yàn)條件無法控制提取溫度，故選用提取時(shí)間和加水倍數(shù)作為考察因素。

3.2 評價(jià)指標(biāo)的確定

陳皮健脾固體飲品處方中陳皮為君藥，陳皮具有理氣健脾、燥濕化痰的功效，其主要含有橙皮苷[5]、柚皮苷和檸檬烯等成分。橙皮苷具有調(diào)節(jié)免疫力[6]、促胃腸動力[7]等藥理活性，能夠調(diào)節(jié)免疫功能，促進(jìn)胃腸蠕動，從而起到健脾、理氣作用。脾胃強(qiáng)健，元?dú)獬渥悖瑒t能有效緩解氣虛癥狀，從而達(dá)到治療氣虛體質(zhì)的效果。故采用陳皮的有效成分橙皮苷含量作為評價(jià)指標(biāo)之一。

同時(shí)由于中藥復(fù)方成分復(fù)雜，干膏中含有有效成分及各種雜質(zhì)成分，故不采用干膏率作為評價(jià)指標(biāo)，干膏率越大不代表提取效果越好，也不代表有效成分含量就越大，因?yàn)楦筛嗦蚀笠部赡苁歉筛嘀须s質(zhì)成分較多，因此課題采用橙皮苷在干膏中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)作為另一個評價(jià)指標(biāo)，能夠更加科學(xué)地反映藥物提取效果，橙皮苷在干膏中質(zhì)量分?jǐn)?shù)越大，則干膏中有效成分含量越多，說明提取效果越好。

3.3 數(shù)據(jù)處理

在試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化法必須完成兩方面的工作：①正確描述結(jié)果或指標(biāo)與各考察因素的關(guān)系，即建立合適的數(shù)學(xué)模擬方程。②依據(jù)數(shù)學(xué)方程選取較佳工藝。近年來常用優(yōu)化工藝試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法有析因設(shè)計(jì)、正交設(shè)計(jì)、均勻設(shè)計(jì)、星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法[8]。

當(dāng)因素與水平數(shù)量過多時(shí)，采用析因設(shè)計(jì)法造成試驗(yàn)次數(shù)極高，極耗費(fèi)人力和時(shí)間[9]；采用正交設(shè)計(jì)法時(shí)試驗(yàn)次數(shù)會以水平數(shù)的平方倍數(shù)上升，從而導(dǎo)致在一定周期內(nèi)試驗(yàn)安排操作難度變大[10]；均勻設(shè)計(jì)法雖然可減少試驗(yàn)次數(shù)，但同時(shí)易派生自變量，當(dāng)自變量個數(shù)大于觀測點(diǎn)個數(shù)，得到的多重線性回歸方程不唯一，各結(jié)果彼此之間易出現(xiàn)不可抗差異[11-12]。

星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法是一種科學(xué)的、簡便易學(xué)的試驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化方法，一般用的是二階設(shè)計(jì)，集數(shù)學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)為一體[13]，能夠得出科學(xué)、客觀的數(shù)據(jù)結(jié)果，星點(diǎn)設(shè)計(jì)試驗(yàn)次數(shù)較正交試驗(yàn)少，且試驗(yàn)設(shè)計(jì)更為合理，試驗(yàn)精度高，能夠直接利用軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，并適用于多因素、多水平的試驗(yàn)[14-16]。此外，能夠在軟件直接顯示試驗(yàn)結(jié)果，并對最佳工藝條件進(jìn)行預(yù)測，極大地降低了主觀因素對結(jié)果的影響。因此，試驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選陳皮健脾固體飲品的提取工藝，對最佳提取工藝進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果表明實(shí)際值與預(yù)測值偏差在合理范圍內(nèi)，表明該數(shù)學(xué)模型預(yù)測的結(jié)果真實(shí)可靠，為該產(chǎn)品后續(xù)的研究開發(fā)及工業(yè)化生產(chǎn)提供一定的理論基礎(chǔ)，具有實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。

4 結(jié)論

試驗(yàn)采用星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法優(yōu)選陳皮健脾固體飲品的提取工藝，并結(jié)合工業(yè)實(shí)際生產(chǎn)考慮，確定陳皮健脾固體飲品的最佳提取工藝為加水倍數(shù)18倍，提取時(shí)間120 min，提取2次。驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果測得總評OD值為0.997 2，與理論預(yù)測值接近。表明星點(diǎn)設(shè)計(jì)-效應(yīng)面法對陳皮健脾固體飲品的試驗(yàn)指標(biāo)具有較好的優(yōu)選性和預(yù)測性，所得工藝方法簡單、穩(wěn)定可靠。