綠僵菌與3種殺蟲劑混配對(duì)樟巢螟的協(xié)同作用

楊 華，趙丹陽(yáng)，秦長(zhǎng)生*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，廣州 510640；2. 廣東省林業(yè)科學(xué)研究院/廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣州510520)

樟巢螟Orthagaachatin又稱樟叢螟、樟葉瘤叢螟，屬鱗翅目Lepidoptera螟蛾科Pyrdidae瘤叢螟屬Orthaga，主要危害樟科Lauraceae植物，在廣東省韶關(guān)市、肇慶市以及潮州市等多地造成嚴(yán)重危害(邱華龍等, 2016)。該蟲以幼蟲危害寄主植物葉片，1～2齡幼蟲啃食葉片，2～3齡后開始吐絲結(jié)巢，將小樹枝和葉片粘粘在一起，連同蟲糞卷結(jié)在一起形成10～20 cm大小不等的鳥巢狀的蟲苞，在蟲苞內(nèi)取食嫩枝和嫩葉，發(fā)生嚴(yán)重時(shí)，整株葉片均可以被吃光，嚴(yán)重影響樟樹的生長(zhǎng)及美觀(魏書軍等, 2008; 趙丹陽(yáng)等, 2016)。

目前對(duì)樟巢螟防治主要依賴于化學(xué)防治(張念環(huán)等, 2005; 楊曉娟等, 2006)，但化學(xué)防治會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的“3R”問題。而綠僵菌、白僵菌等昆蟲病原真菌可以主動(dòng)侵入寄主體壁，分泌毒素致死寄主(徐金柱等, 2017)，并在體內(nèi)迅速繁殖，使其發(fā)病迅猛，可在短期內(nèi)有效遏制多種農(nóng)林害蟲種群數(shù)量增長(zhǎng)；還能在寄主缺乏的情況下宿存于土壤中，在適宜條件下能隨蟲口的增加而大量繁殖，與害蟲的發(fā)生保持較好的一致性，能起到對(duì)害蟲持續(xù)控制的作用(Yangetal., 2019)。

本項(xiàng)目選用3株綠僵菌(Ma09、3297和Mf985)、1株白僵菌(GDLY9)及3種高效低毒殺蟲劑(苯氧威、除蟲脲和短穩(wěn)桿菌)對(duì)樟巢螟低齡幼蟲進(jìn)行了毒力測(cè)定，并測(cè)定了金龜子綠僵菌Ma09和3種殺蟲劑混配對(duì)樟巢螟低齡幼蟲的協(xié)同作用，以期篩選出更為安全、低毒、高效的樟巢螟防治藥劑，為樟巢螟的防治提供技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 供試藥劑

供試菌株：蚱蜢綠僵菌Mf985、金龜子綠僵菌Ma09、金龜子綠僵菌3297及球孢白僵菌GDLY9。菌株由廣東省森林培育與保護(hù)利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存，綠僵菌孢子粉含孢量約為3×109孢子/g，白僵菌含孢量約為5×109孢子/g，含水量小于5%。

供試藥劑：苯氧威(3%乳油，河南省鄭州市沙隆達(dá)偉新農(nóng)藥有限公司)、除蟲脲(20%懸浮劑，河南省安陽(yáng)市安林生物化工責(zé)任有限公司)、短穩(wěn)桿菌Empedobacterbrevis(100億孢子/ml懸浮劑，鎮(zhèn)江市潤(rùn)宇生物科技開發(fā)有限公司)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1綠僵菌、白僵菌以及3 種殺蟲劑對(duì)樟巢螟低齡幼蟲的毒力

從林間采集樟巢螟蟲苞帶回實(shí)驗(yàn)室，用細(xì)毛筆挑取健康活潑的2～3齡幼蟲作為供試?yán)ハx。將幼蟲置于15 cm培養(yǎng)皿中，底部鋪有濾紙，以新鮮樟樹葉片飼喂。分別將綠僵菌、白僵菌和3種殺蟲劑配制成一定濃度的藥液并按梯度進(jìn)行稀釋，采用Potter塔噴霧法，將裝有幼蟲的培養(yǎng)皿置于噴霧塔的載物臺(tái)上，每次噴1 mL藥劑到蟲體上，將幼蟲用細(xì)毛筆挑取后轉(zhuǎn)移至養(yǎng)蟲盒中飼養(yǎng)觀察，統(tǒng)計(jì)每日死亡數(shù)。每個(gè)處理30頭，3次重復(fù)，以0.1%吐溫-80溶液為對(duì)照。

1.2.2綠僵菌與3種殺蟲劑混配對(duì)樟巢螟低齡幼蟲的毒力

選擇金龜子綠僵菌Ma09分別與苯氧威、除蟲脲和短穩(wěn)桿菌進(jìn)行混配并測(cè)定其協(xié)同增效作用。綠僵菌孢懸液配制成1×106孢子/mL的濃度，加入殺蟲劑，使殺蟲劑稀釋濃度達(dá)到1 000倍，參照1.2進(jìn)行樟巢螟低齡幼蟲的毒力測(cè)定。同時(shí)分別測(cè)定單獨(dú)使用綠僵菌和殺蟲劑對(duì)低齡樟巢螟幼蟲毒力。根據(jù)下列公式計(jì)算協(xié)同毒力指數(shù)(c.i)并將其作為評(píng)判兩種藥劑相互作用的依據(jù)，當(dāng)c.i ≥ 20時(shí)為判定為增效作用，c.i ≤ -20時(shí)為拮抗作用，-20

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

所得數(shù)據(jù)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理分析，采用Duncan氏新復(fù)極差測(cè)驗(yàn)進(jìn)行差異顯著性分析。并運(yùn)用Probit機(jī)率值分析法求出毒力回歸方程、半致死時(shí)間LT50、LT90、95%置信區(qū)間、卡方值、顯著性等(賈春生, 2006)。

2 結(jié)果與分析

2.1 綠僵菌、白僵菌對(duì)樟巢螟低齡幼蟲的毒力

不同濃度下，4種昆蟲病原菌處理后，樟巢螟每日死亡情況(圖1)?？傮w上，死亡高峰期基本在處理后的第3～4天，1×108孢子/mL濃度的孢子懸浮液處理后6 d之內(nèi)樟巢螟全部死亡。低濃度的孢子懸浮液處理后，死亡持續(xù)時(shí)間較長(zhǎng)，7～8 d之內(nèi)仍有活蟲，有些處理甚至持續(xù)至12 d。白僵菌GDLY9的效果要優(yōu)于其他3種綠僵菌。基本上所有濃度處理后6 d之內(nèi)樟巢螟全部死亡。

圖1 樟巢螟在4種昆蟲病原真菌不同濃度下日死亡情況Fig.1 Orthaga achatina larvae daily death of 4 entomopathogenic fungi at different concentrations

表1～表4展示了3種綠僵菌和1種白僵菌對(duì)低齡樟巢螟幼蟲的毒力，回歸分析表明，死亡率與時(shí)間呈線性相關(guān)，并且致死中時(shí)相隨著孢子濃度的增大而降低。當(dāng)孢子濃度達(dá)到108孢子/mL這一級(jí)別時(shí)，4種昆蟲病原菌的致死中時(shí)均在3 d左右，分別為3.21、3.5、3.03、3.01 d。當(dāng)孢子濃度為104孢子/mL這一級(jí)別時(shí)，4種病原菌的致死中時(shí)差異較大，分別為8.48、5.54、5.06和3.89 d，其種白僵菌GDLY9效果最好(LT50為5.06 d)，綠僵菌3297效果最差(LT50為8.48 d)。綠僵菌Mf985和Ma09效果相當(dāng)，LT50均在5 d左右。

2.2 3種化學(xué)藥劑對(duì)樟巢螟的毒力

處理24 h后，苯氧威和除蟲脲的致死中濃度LC50分別為35.89和129.42 μg/mL，苯氧威的效果顯著優(yōu)于除蟲脲；同樣處理48 h后，苯氧威的LC50為13.67 μg/mL，LC90為35.53 μg/mL，均顯著低于除蟲脲(LC50為82.53 μg/mL，LC90為158.38 μg/mL)，說明苯氧威對(duì)樟巢螟低齡幼蟲的防治效果要優(yōu)于除蟲脲(表5)。短穩(wěn)桿菌對(duì)樟巢螟低齡幼蟲也表現(xiàn)出了良好的致死作用(表6)，1×108孢子/mL濃度處理后的LT50和LT90分別為1.28、2.50 d，并且各個(gè)濃度在處理5 d后，死亡率均達(dá)到了100%。

表1 綠僵菌Mf985對(duì)樟巢螟幼蟲的毒力

表2 綠僵菌Ma09對(duì)樟巢螟幼蟲的毒力

表3 綠僵菌3297對(duì)樟巢螟幼蟲的毒力

表4 白僵菌GDLY9對(duì)樟巢螟幼蟲的毒力

表5 苯氧威和除蟲脲對(duì)樟巢螟幼蟲的毒力

表6 短穩(wěn)桿菌對(duì)樟巢螟幼蟲的毒力

2.3 綠僵菌與3種化學(xué)藥劑混配對(duì)樟巢螟低齡幼蟲的毒力

協(xié)同作用結(jié)果(表7)表明，混配劑中，綠僵菌Ma09與3種殺蟲劑混配對(duì)樟巢螟2～3齡幼蟲致死效果均比較好，混配后其校正死亡率分別為100%、85.78%和87.56%，綠僵菌與3種藥劑混配后協(xié)同指數(shù)分別為20.43、27.52和33.13，均大于20，表現(xiàn)出增效作用，并且綠僵菌與苯氧威混配后對(duì)低齡樟巢螟幼蟲的致死率達(dá)到了100%，防治效果明顯。

表7 綠僵菌Ma09與3種殺蟲劑混配對(duì)樟巢螟幼蟲的增效作用

3 討論與結(jié)論

綠僵菌能通過主動(dòng)侵染寄主、穿透昆蟲體壁致死寄主，其發(fā)病迅猛，可在短期內(nèi)有效遏制害蟲種群數(shù)量的急劇增加，將害蟲控制在經(jīng)濟(jì)損害水平以下。據(jù)童應(yīng)華等(2014)報(bào)道，綠僵菌Ma1291-2對(duì)樟巢螟具有較強(qiáng)的致病力，以點(diǎn)滴法將1.0×108孢子/mL的孢子懸液接到2～3齡幼蟲的體表，LT50為6.29 d。本實(shí)驗(yàn)選用的幾種昆蟲病原菌對(duì)樟巢螟低齡幼蟲均具有較強(qiáng)的致病力，1.0×108孢子/mL濃度處理的LT50在3～4 d之間。生物測(cè)定中不同的接種方式導(dǎo)致毒力測(cè)定結(jié)果差異較大，有時(shí)甚至無法比較(Wraightetal., 1998)。規(guī)范的生物測(cè)定方法要求真菌制劑的接種方式盡可能模擬自然侵染，利于田間應(yīng)用，因此最好采用噴霧或者噴粉方式進(jìn)行。此外不同的菌株之間毒力差異也比較大，大量的關(guān)于綠僵菌菌株篩選的研究表明 (臧歡等, 2013; 于浩海等, 2014; 劉晨等, 2014; 練濤等, 2019; 鄧嘉茹等, 2020)，雖然不同的菌株對(duì)不同寄主顯示出了顯著的致病性差異，但篩選出的高致病力菌株的LT50都在2～8 d，利用綠僵菌、白僵菌等開展農(nóng)林害蟲的防治，菌株之間的差異具有較大利用空間，因此針對(duì)不同寄主進(jìn)行菌株篩選是十分必要的。

細(xì)菌殺蟲劑是另一種可利用的生物殺蟲劑，劉樹生(劉樹生, 2009)利用8 000 IU/mg蘇云金桿菌可濕性粉劑防治樟巢螟，7 d后防治效果達(dá)到92.28%，持效期長(zhǎng)。關(guān)麗梅(關(guān)麗梅等, 2018)等人分離出來一株對(duì)樟巢螟具有較高毒力的致病性粘質(zhì)沙雷氏菌(LS-1)，樟巢螟感染該菌后蟲體發(fā)紅、發(fā)黑，變軟，部分甚至流出膿液，感染120 h后，校正死亡率為69.1%，說明該菌株對(duì)樟巢螟具有很強(qiáng)的致死作用。本實(shí)驗(yàn)中所使用的短穩(wěn)桿菌是一種革蘭氏陰性菌，源自田間自然感病的斜紋葉蛾Spodopteralitura幼蟲(王以一等, 2014)，是多種鱗翅目害蟲的重要細(xì)菌性致病菌(楊延芳等, 2016; 王義生等, 2018; 王迎春等, 2019)經(jīng)大規(guī)模發(fā)酵而獲得的產(chǎn)品，已在國(guó)內(nèi)外多個(gè)地區(qū)進(jìn)行了推廣應(yīng)用。本研究表明該菌對(duì)樟巢螟2～3齡幼蟲也具有較高的致死性。各個(gè)濃度下致死中時(shí)在1～3 d，并且5 d后全部死亡。

昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑針對(duì)昆蟲特定生長(zhǎng)時(shí)期，具有高度的選擇性，對(duì)人和動(dòng)物都是安全的，并且與傳統(tǒng)殺蟲劑機(jī)理不同，可以有效緩解因長(zhǎng)時(shí)間大量使用傳統(tǒng)殺蟲劑帶來的抗藥性問題(何佳和蔣志勝, 2003)。苯氧威是一種非萜烯類氨基甲酸酯類化合物，具有胃毒和觸殺作用，并對(duì)多種昆蟲有保幼激素活性，可抑制幼蟲蛻皮，無法發(fā)育成成蟲(孫德瑩等, 2006)。除蟲脲是第1個(gè)苯甲酰苯脲類選擇性殺蟲劑，具有觸殺和胃毒作用，是另一種昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑類殺蟲劑(Yaoetal., 2020)。二者雖然都在蛻皮過程中發(fā)揮作用，但是作用機(jī)制完全不同。苯氧威是一種非甾體保幼激素類似物，主要作用是阻止昆蟲發(fā)育、抑制變態(tài)發(fā)生；而除蟲脲屬于幾丁質(zhì)合成抑制劑，可使昆蟲表皮的幾丁質(zhì)合成過程受阻，沉積受抑制。也正是因?yàn)槎叩淖饔脵C(jī)制不同，將其與綠僵菌混配后獲得的作用效果亦不同(c.i苯氧威=20.43；c.i除蟲脲=27.52)。綠僵菌分泌大量表皮降解酶降解體壁，打通侵入通道，從而成功侵入。而除蟲脲恰恰抑制了昆蟲體壁主要成分幾丁質(zhì)的合成，從而使得綠僵菌更加容易侵染，因此將綠僵菌與除蟲脲混用后具有更好的增效作用。使用微生物殺蟲劑和昆蟲病原菌的混合后相比較化學(xué)殺蟲劑對(duì)環(huán)境和天敵的影響更小。一般情況下，化學(xué)殺蟲劑及其助劑等往往會(huì)對(duì)病原菌孢子造成傷害，但是同為生物源的昆蟲病原細(xì)菌通常不會(huì)對(duì)真菌產(chǎn)生影響(Zouetal., 2013)，因此試驗(yàn)中所選用的綠僵菌與短穩(wěn)桿菌混配后增效作用最好。

據(jù)調(diào)查樟巢螟在大部分地區(qū)1年發(fā)生2代，部分地區(qū)存在3代(樊敏等, 2006; 溫小玲和吳希從, 2007)，第1代整齊，第2代有少數(shù)出現(xiàn)世代重疊現(xiàn)象，7～8月份幼蟲和成蟲同時(shí)出現(xiàn)。因此最佳防治時(shí)間應(yīng)該為第1代幼蟲為害期5～7月份。本實(shí)驗(yàn)所選用的幾種藥劑對(duì)樟巢螟2～3齡幼蟲均有較好的致死效果。但是由于樟巢螟不同于其他鱗翅目害蟲，其幼蟲隱藏于蟲苞中，因此林間防治的時(shí)候常規(guī)的噴霧方法有時(shí)候難以滲入蟲苞中，可考慮將綠僵菌與3種殺蟲劑混合其制成微膠囊粉劑，噴粉機(jī)噴施粉劑，操作簡(jiǎn)單，并且對(duì)環(huán)境要求低(楊華等, 2018)。大面積的林間生物防治技術(shù)的研發(fā)是下一步需要解決的問題，因此需要大量培養(yǎng)綠僵菌孢子粉，而本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)形成了一套完整的金龜子綠僵菌Ma09中試生產(chǎn)工藝，可大量生產(chǎn)綠僵菌孢子粉。但是對(duì)于白僵菌還未形成完整的生產(chǎn)工藝。因此在藥劑混配協(xié)同作用試驗(yàn)中選擇金龜子綠僵菌Ma09而沒有選擇效果更好的白僵菌GDLY9。