不同地區(qū)沙田柚果園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性分析

彭玉嬌，崔學(xué)宇，覃禮蒙，楊艷麗，邵元元，潘桂穎，黃 梅，曾文萍，賈書剛

（1.南寧師范大學(xué)廣西地標(biāo)作物大數(shù)據(jù)工程技術(shù)研究中心，南寧 530001；2.南寧師范大學(xué)北部灣環(huán)境演變與資源利用教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001；3.南寧師范大學(xué)廣西地表過程與智能模擬重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530001）

沙田柚（Citrus grandis var.shatinyu）是我國傳統(tǒng)名柚，由于其具有經(jīng)濟(jì)效益高、適應(yīng)性強(qiáng)的特點(diǎn)，在我國南方廣泛種植[1]，沙田柚著名的產(chǎn)區(qū)包括容縣、梅州、長壽等，在空間分布上具有較大的跨度，生態(tài)環(huán)境和氣候特點(diǎn)差異較大。在土壤學(xué)研究中，土壤微生物群落結(jié)構(gòu)和多樣性特征是評價土壤質(zhì)量的重要指標(biāo)[2]。因此，解析不同地區(qū)沙田柚果園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性對不同地區(qū)沙田柚栽培管理、沙田柚果園的微環(huán)境調(diào)節(jié)、不同地區(qū)沙田柚果園土壤狀況的評估具有重要的意義。土壤微生物在土壤中參與物質(zhì)的形成與轉(zhuǎn)化[3]，而土壤環(huán)境的差異也可以對土壤微生物產(chǎn)生直接的影響[4]。對不同類型小葉章濕地土壤細(xì)菌的研究表明，環(huán)境的差異對微生物有顯著的影響[5]；對不同生態(tài)條件下香鱗毛蕨生長土壤微生物多樣性的研究發(fā)現(xiàn)，土壤微生物多樣性對土壤質(zhì)量變化敏感，人為破壞少的地點(diǎn)微生物多樣性高[6]；對紅樹林土壤微生物多樣性的研究表明，北海和欽州紅樹林土壤微生物差異較大，證明了環(huán)境條件在微生物群落形成中的重要作用[7]；對不同生態(tài)環(huán)境野生櫻桃李的研究表明，養(yǎng)分極顯著影響土壤微生物數(shù)量[8]；對不同生態(tài)條件西瓜栽培土壤微生物多樣性進(jìn)行研究，證實(shí)連作降低了西瓜栽培土壤微生物的多樣性[9]。在大空間尺度對土壤微生物研究報(bào)道多為野生植物，對某一栽培植物的報(bào)道并不多見，關(guān)于不同地區(qū)沙田柚果園土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)并無報(bào)道。沙田柚是我國傳統(tǒng)名柚，有必要對其產(chǎn)區(qū)土壤健康進(jìn)行評估。在沙田柚主要栽培的5?。ㄊ校┑?個縣、區(qū)進(jìn)行取樣，測定沙田柚果園土壤的基本理化性質(zhì)，并利用高通量測序的方法對土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究，以明確不同地區(qū)沙田柚果園土壤和細(xì)菌群落的差異，為沙田柚栽培的精準(zhǔn)管理提供一定參考。

1 材料和方法

1.1 樣地選擇

取樣的地點(diǎn)分別是廣東省梅州市盤石村（MZ）、廣東省清遠(yuǎn)市連山縣吉田鎮(zhèn)（LS）、廣西壯族自治區(qū)桂林市陽朔縣興坪鎮(zhèn)（YS）、廣西壯族自治區(qū)玉林市容縣容州鎮(zhèn)（RX）、湖南省永州市江永縣粗石江鎮(zhèn)（JY）、四川省樂山市夾江縣新鄉(xiāng)（LeS）和重慶市長壽區(qū)鄰封鎮(zhèn)（CS），詳見圖1，取樣地制圖底圖來源自然資源部監(jiān)制GS（2019）1697號。7個縣、區(qū)所選地區(qū)均為當(dāng)?shù)厣程镨址N植核心區(qū)域，7個主產(chǎn)區(qū)處于我國南方地區(qū)，跨第二、第三階梯，地勢東西差異較大，地形復(fù)雜多樣，主要包含平原、盆地、山地、丘陵、高原6種類型。在氣候上，以熱帶亞熱帶季風(fēng)氣候?yàn)橹?，整體上呈現(xiàn)出夏季時高溫多雨、冬季時溫和少雨的特點(diǎn)。在如此氣候環(huán)境下多發(fā)育形成紅壤。所有選取的柚場均掛果10年以上，栽培密度為300～450株/hm2，選取的所有柚場均百株以上連片，選擇的柚場1月內(nèi)并未施用過肥料，管理為果農(nóng)管理，所有沙田柚均為容縣引種。

1.2 樣品采集

所有樣品均于2019年7月上旬取樣（7月10日前完成全部取樣），每個取樣地點(diǎn)在果園中心隨機(jī)選擇3株長勢均一的果樹，取樣地點(diǎn)遠(yuǎn)離施肥區(qū)，在樹冠和樹體近中處范圍內(nèi)采用五點(diǎn)法取樣，取樣時去掉表面雜草等雜物，取10～20 cm的表層土壤樣品，混合后為一樣本，每果園取3個樣本，野外取樣用具利用酒精和火焰灼燒滅菌，取樣袋等用具室內(nèi)滅菌后使用。全部21個樣本用于果園土壤細(xì)菌高通量測序及土壤理化性質(zhì)測定。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 測序前組DNA提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物純化

采用SDS法提取土壤總DNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的純度和濃度后，將稀釋DNA濃度稀釋至樣本，終濃度為1 ng/μL。擴(kuò)增引物使用帶Barcode的細(xì)菌16S rDNA-V4區(qū)特異引物（515F和806R，引物序列分別為GTGCCAGCMGCCGCGGTAA和GGACTACHVGGGTWTCTAAT）[10]，擴(kuò)增利用New England Biolabs公司的PhusionHigh-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer和高效高保真酶進(jìn)行PCR，確保擴(kuò)增效率和準(zhǔn)確性。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，使用Gene JET膠回收試劑盒回收產(chǎn)物。用干冰寄送至RCR產(chǎn)物利用瓊脂糖凝膠檢測，利用GeneJET膠回收試劑盒回收擴(kuò)增產(chǎn)物[11]。測序委托北京諾禾致源科技股份有限公司完成進(jìn)行高通量測序。

1.3.2 土壤理化性質(zhì)的測定

便攜式土壤pH計(jì)測定土壤pH值；利用齊一生物科技有限公司提供的試劑盒測量土壤其他指標(biāo)，具體測定原理參見《土壤農(nóng)化分析》[12]（銨態(tài)氮、硝態(tài)氮、速效鉀和無機(jī)磷）；土壤質(zhì)量含水量利用烘干法測量。

1.4 數(shù)據(jù)分析與處理

Excel軟件錄入土壤理化指標(biāo)，SPSS 23軟件對其結(jié)果進(jìn)行后續(xù)處理方差分析；下機(jī)數(shù)據(jù)導(dǎo)出fastq文件。根據(jù)barcode序列區(qū)分各個樣本的數(shù)據(jù)。然后進(jìn)行嵌合體過濾，得到可用于后續(xù)分析的有效數(shù)據(jù)，即Clean reads。Uparse軟件進(jìn)行土壤OTU聚類分析；Qiime軟件（Version 1.9.1）計(jì)算進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)、和Beta多樣性分析Diversity和并構(gòu)建UPGMA樣本聚類樹；R軟件（Version 2.15.3）進(jìn)行繪制稀釋曲線，Rank abundance曲線，物種累積曲線并使用R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析后續(xù)制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同地域沙田柚果園微生物群落多樣性

本研究合計(jì)獲得1 791 713條序列，其中有效序列1 681 255條，占總序列數(shù)的93.84%。獲得可用于物種分類的OTUs 10 713條，至少涵蓋60門，68綱，147目，275科，658屬。21個樣本獲得的OTUs數(shù)在2 072～4 198之間；對于各組樣本來說，來自長壽樣本的OTUs數(shù)最小，來自江永樣本的OTUs數(shù)最大。樣本的OTU稀釋曲線如圖2所示，本研究所獲得的稀釋曲線已趨于平坦，證明測序量合理，更大的數(shù)據(jù)量只會獲得少量新的OTUs。

利用花瓣圖分析均一化處理后的各組樣本之間共有、特有的OTUs。如圖所示，合計(jì)969個OTUs為7個不同地區(qū)沙田柚果園所共有，特有OTUs最多的是連山的樣品，特有OUTs數(shù)為645；最少的是長壽的樣本，特有OTUs數(shù)為190（圖3）。

圖3 OTU分布圖Figure 3 Diagram showing the distribution of OTUs

在97%一致性閾值下對7組樣本的Alpha Diversity分析指數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，結(jié)果如表1所示。本研究中，所有微生物群落多樣性和豐富度的指標(biāo)中來自江永的樣本最高，來自長壽的樣本最低。

表1 土壤細(xì)菌多樣性指數(shù)Table 1 Diversity index of the soil bacteria

2.2 不同區(qū)域沙田柚果園土壤優(yōu)勢菌群分布

2.2.1 不同區(qū)域果園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的差異

PCoA 分析（Principal Coordinate Analysis，主坐標(biāo)分析）表明（圖4）:49.56%的變量可以被解釋。由圖4可知，不同的地理位置，對細(xì)菌組成有影響。

2.2.2 不同地區(qū)土壤細(xì)菌門分類水平比較及聚類分析

在門分類水平對7組樣本進(jìn)行分析，樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)在門分類水平具有較高的多樣性，對于不同樣本來說，來自長壽的樣本分離到的門數(shù)目最少，為33個；連山的最多，為49個。這些門主要包括變形菌門（Proteobacteria），不同樣本的相對豐度在 33.61%～40.87%之間；厚壁菌門（Firmicutes），不同樣本的相對豐度在0.71%～16.86%之間；酸桿菌門（Acidobacteria），不同樣本的相對豐度在5.6%～23.48%之間；綠彎菌門（Chloroflexi），不同樣本的相對豐度在1.99%～9.96%之間；芽單胞菌門（Gemmatimonadetes），不同樣本的相對豐度在3.80%～7.92%之間，這些優(yōu)勢菌門在7組樣本的相對豐度比例在64.40%～88.25%之間。有2個菌門僅在容縣的樣本中發(fā)現(xiàn)，分別為Candidatus Staskawiczbacteria（相對豐度 0.013%）和 Candidatus Moranbacteria（相對豐度為0.0017%）；利用優(yōu)勢菌門結(jié)果對其進(jìn)行聚類，結(jié)果由圖5可知，在加權(quán)unifrac距離為0.07的水平上，7組樣本被聚為3類，其中江永、連山、容縣的樣本被聚為1組，梅州、長壽、樂山的樣本被聚為1組，陽朔的樣本被單獨(dú)劃分為1組，這一結(jié)果表明，空間距離近的兩地，細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成不一定聚在一起，仍需結(jié)合氣候條件等對其進(jìn)行深入分析。

圖4 不同地區(qū)沙田柚果園土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的主坐標(biāo)分析Figure 4 Principal coordinate analysis of soil microbial community structure of shatian pomelo orchard

2.2.3 不同地區(qū)沙田柚果園土壤細(xì)菌屬分類水平分析

由圖6可知，梅州和長壽的樣本中，unidentified Burkholderiaceae是最優(yōu)勢屬，相對豐度分別為5.25%和7.42%；連山的樣本中Chujaibacter是最優(yōu)勢屬，相對豐度為5.23%；容縣的樣本中腸球菌屬（Enterococcus）是最優(yōu)勢屬，相對豐度為6.45%；江永和樂山的樣本中鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）是最優(yōu)勢菌屬，相對豐度分別為3.61%和6.74%；陽朔的樣本中unidentified Acidobacteria是最優(yōu)勢菌屬，相對豐度為3.29%。與門水平的結(jié)果不同，優(yōu)勢菌屬在不同樣本中存在地域差異，7組樣本優(yōu)勢屬差異顯著。

2.3 不同地區(qū)沙田柚果園高豐度土壤細(xì)菌潛在功能分析

圖5 細(xì)菌門分類水平的聚類圖Figure 5 UPGMA cluster analysis of bacteria relative abundance on phylum level

圖6 細(xì)菌屬分類水平的比較Figure 6 Comparison of bacteria groups at genus level

對不同樣本中高豐度的土壤細(xì)菌進(jìn)行具體分析（豐度＞0.1%），本研究的7組樣本中，高豐度屬合計(jì)162個，高豐度種合計(jì)74個。

分析不同地區(qū)果園土壤重要的細(xì)菌潛在植物致病菌發(fā)現(xiàn)，在長壽、連山、容縣、江永和陽朔5地假單胞菌屬（Pseudomonas）具有較高豐度，其中容縣的樣本相對豐度達(dá)3.34%；在容縣的土壤樣本中紅球菌屬（Rhodococcus）具有較高的相對豐度為0.13%；在容縣和江永的樣本中芽孢桿菌屬（Bacillus）相對豐度分別為0.24%和0.29%具有較高的相對豐度；在梅州、連山、容縣、江永的樣本中鏈絲（霉）菌屬（Streptomyces）具有較高的相對豐度分別為0.97%、0.21%、0.16%和0.39%；在梅州、連山、容縣的樣本中雷爾氏菌屬（Ralstonia）的相對豐度分別為0.50%、0.36%和0.14%，應(yīng)注意這些菌屬的潛在致病風(fēng)險(xiǎn)。

對其相對高豐度種進(jìn)行研究發(fā)現(xiàn)，Sphingomonas sp在梅州、樂山、容縣、江永和連江都有較高的相對豐度，均大于0.2%；在容縣和連江的樣本中，大腸桿菌（Escherichia coli）具有較高的相對豐度，分別為0.6%和0.2%，在容縣的樣本中，腸道致病厭氧菌脆弱擬桿菌（Bacteroides fragilis）豐度較高，達(dá)0.5%；具有潛在多菌靈降解功能的Nocardioides sp在樂山、容縣、江永和連江具較高的相對豐度，相對豐度分別為0.19%、0.23%、0.14%和0.30%；烷烴降解菌香茅醇假單胞菌（Pseudomonas citronellolis）在容縣的樣本中相對豐度為1.01%，；耐久腸球菌（Enterococcus durans）在容縣的樣本中有相對豐度為4.27%，該菌株可能為腸道來源。

2.4 不同區(qū)域沙田柚果園土壤理化性質(zhì)的差異及對土壤微生物的影響

本研究對7個果園土壤硝態(tài)氮、銨態(tài)氮、無機(jī)磷、速效鉀、pH值和土壤含水量進(jìn)行測定，結(jié)果見表2。由表可知，不同沙田柚果園土壤理化性質(zhì)之間有較大的差異；土壤理化性質(zhì)中的硝態(tài)氮、速效鉀、無機(jī)磷3個指標(biāo)對土壤微生物多樣性影響較大（圖7），其中速效鉀和無機(jī)磷影響α多樣性全部指標(biāo)，速效鉀影響更大；硝態(tài)氮主要影響了群落物種多樣性的指標(biāo)（Simpson、Shannon指數(shù)）。

表2 不同地區(qū)沙田柚果園土壤理化性質(zhì)Table 2 Soil physical and chemical properties of Shatian pomelo cultivated with different areas

圖7 熱圖分析細(xì)菌α多樣性與環(huán)境因子相關(guān)性Figure 7 Heatmap correlation between alpha diversity of bacteria genus and soil physico-chemical properties

對微生物屬水平和土壤理化指標(biāo)進(jìn)行冗余分析，在微生物的屬水平，80.55%的細(xì)菌群落變化可以被研究所測量的環(huán)境因子所解釋。土壤理化因子與屬水平細(xì)菌的相關(guān)性分析見圖8，銨態(tài)氮顯著影響3個屬的細(xì)菌OTUs；硝態(tài)氮與6個屬細(xì)菌顯著或極顯著正相關(guān)，與3個屬細(xì)菌顯著或極顯著負(fù)相關(guān)；速效鉀與10個屬細(xì)菌顯著或極顯著正相關(guān)，與1個屬細(xì)菌顯著負(fù)相關(guān)；無機(jī)磷與8個屬細(xì)菌顯著或極顯著相關(guān)，與1個屬細(xì)菌顯著負(fù)相關(guān)；pH與2個屬細(xì)菌顯著正相關(guān)；土壤含水量與1個屬細(xì)菌顯著正相關(guān)，與2個屬細(xì)菌顯著或極顯著負(fù)相關(guān)。

圖8 不同地區(qū)環(huán)境因子對細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的冗余分析Figure 8 Redundancy analysis based on the soil properties and the bacterial community structure

3 討論與結(jié)論

沙田柚因其具有較高的經(jīng)濟(jì)價值和較強(qiáng)的適應(yīng)性在我國南方廣泛種植[13]，由于其栽培地域跨度大，栽培地?fù)碛胁煌纳鷳B(tài)類型和氣候條件。本研究在沙田柚7個主要產(chǎn)區(qū)的規(guī)?；程镨衷耘喙麍@進(jìn)行取樣，對沙田柚果園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究，在微生物的角度解析不同地區(qū)沙田柚果園的栽培土壤特性。在這7個主要產(chǎn)區(qū)中來自永江的樣本細(xì)菌群落多樣性和豐富度最高，而來自長壽的樣本則最低。調(diào)研發(fā)現(xiàn)，永江、容縣有機(jī)肥施用較多，而長壽、梅州化肥施用較多，前人研究有機(jī)肥的部分替代可提高微生物群落物種豐富度結(jié)果為這一推測提供了支持[14]。

生物學(xué)家Baas Becking對微生物的分布有一種假說“Everything is everywhere,but the environmentselects”，即環(huán)境因素是決定微生物群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵，地理的空間屏障并不是其決定因素[15]。門水平的聚類結(jié)果對其進(jìn)行了一定的證實(shí)，空間距離越近的兩地，微生物在門水平不一定聚在一起，這可能是受到小氣候環(huán)境的影響。在門水平分析，在容縣的樣本中變形菌門和厚壁菌門是相對豐度最高的兩個門，這一結(jié)果與本課題組先期在容縣的其他柚場春季沙田柚果園土壤微生物中的研究類似[16]，這兩次研究在容縣不同的沙田柚場取樣，證明了土壤細(xì)菌在一定空間范圍上的穩(wěn)定性；此外變形菌門在所有的沙田柚果園土壤樣本中均具有最高的相對豐度，這一結(jié)果與前人在其他果園中的研究結(jié)果類似[17]，產(chǎn)生這一結(jié)果的原因可能和變形菌門自身為富養(yǎng)菌的特性有關(guān)[18]；梅州、樂山、陽朔和長壽的樣本中，相對豐度第二高的是酸桿菌門，在其他的樣本中也具有較高的相對豐度，這一結(jié)果與土壤pH的結(jié)果對應(yīng)發(fā)現(xiàn)，雖然沙田柚栽培土壤的pH均為酸性，但4地的pH值與其他地區(qū)的相比較低，存在顯著差異，這可能與酸桿菌門自身的嗜酸性相關(guān)[19]。

圖9 熱圖分析主要細(xì)菌屬水平OTUs與環(huán)境因子相關(guān)性Figure 9 Heatmap correlation between dominant OUTs of bacteria genus and soil physico-chemical properties

研究表明，土壤的理化性質(zhì)、果樹的種類和栽培方式可能造成果園土壤微生物群落的差異[20-21]。本研究在屬水平對沙田柚栽培土壤進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，不同地區(qū)樣本在屬水平差異較大，產(chǎn)生這種差異的原因可能是土壤的理化性質(zhì)和不同地區(qū)的栽培方式導(dǎo)致。土壤細(xì)菌在特定的環(huán)境下可能產(chǎn)生某些特定的功能，目前土壤中的微生物只有不到0.3%可以被培養(yǎng)[22]，因此利用高通量測序的方法是在自然狀態(tài)下研究土壤細(xì)菌群落和功能有效的手段。本研究獲得了658屬的細(xì)菌，相對豐度前30的菌屬中，有8個屬在數(shù)據(jù)庫中被定義為unidentified，這一結(jié)果既證明了高通量測序的靈敏性，又證明土壤細(xì)菌群落功能的復(fù)雜性，對其詳盡的解析仍是一個艱巨而又復(fù)雜的任務(wù)。本研究發(fā)現(xiàn)容縣的樣本中，腸球菌屬的相對豐度較高，對其具體分析發(fā)現(xiàn)，是腸球菌屬耐久腸球菌具有較高的相對豐度，該菌在腸道中具有發(fā)酵的功效，其原因可能是容縣在大力推廣有機(jī)肥替代化肥的項(xiàng)目，動物糞便有機(jī)肥經(jīng)漚肥后施用所導(dǎo)致。

本研究對7個地區(qū)果園高豐度的微生物進(jìn)行潛在功能分析，在5個地區(qū)檢測到植物潛在致病種Sphingomonas sp.，該種在多種植物中有致病的報(bào)道[23-25]，且在沙田柚栽培區(qū)廣泛的高豐度，有必要對其進(jìn)行防范；在容縣和連江的樣本中，發(fā)現(xiàn)動物腸道潛在致病菌Escherichia coli相對豐度較高，該菌在土壤中有將食草動物腸道致病、污染山下水源、甚至進(jìn)入植物組織的風(fēng)險(xiǎn)[26]，此外，容縣的樣本中有發(fā)酵功能的Enterococcus durans[27]和潛在腸道致病菌Bacteroides fragilis[28]都有較高的相對豐度，其來源推測是動物糞便來源有機(jī)肥自身攜帶，故施用動物糞便源有機(jī)肥之前必須先進(jìn)行無害化處理，Nocardioides sp.有潛在多菌靈降解功能[29]，這可能與種植地的農(nóng)藥使用方式有關(guān)，并且有潛在修復(fù)環(huán)境的應(yīng)用價值，Pseudomonas citronellolis在容縣的樣本中有最高的相對豐度，該菌的存在可能降低氮肥的利用效率[30]。

本研究對不同沙田柚果園的土壤理化因子與細(xì)菌的多樣性關(guān)聯(lián)分析結(jié)果表明，速效鉀和無機(jī)磷影響α多樣性全部指標(biāo)，速效鉀影響更大；硝態(tài)氮主要影響了群落物種多樣性的指標(biāo)（Simpson、Shannon指數(shù)）。此外，本研究測試的5個土壤理化因子在細(xì)菌屬水平解釋了80.55%的貢獻(xiàn)率，說明土壤的理化性質(zhì)可能是影響沙田柚栽培果園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的主要因素。

本文對不同沙田柚栽培主產(chǎn)區(qū)果園土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性進(jìn)行研究。結(jié)果表明7個地區(qū)沙田柚栽培果園土壤中，來自長壽的土壤樣本細(xì)菌多樣性最低，有必要利用施用有機(jī)肥等措施對其進(jìn)行修復(fù)；在門水平，變形菌門是全部樣本最優(yōu)勢菌門，在屬水平，不同樣本之間差異較大；栽培方式的差異可能是造成土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性有差異的重要原因，施用糞便來源有機(jī)肥之前，必須對其進(jìn)行充分發(fā)酵和無害處理；硝態(tài)氮、速效鉀、無機(jī)磷是影響土壤細(xì)菌多樣性的主要因素。