內(nèi)蒙古通遼地區(qū)野生蘑菇“天合板”ITS初步鑒定*

龐 杰，康立茹，2，王葆生，于傳宗**，王海燕，孫國(guó)琴，李亞嬌

（1.內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031；2.內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030）

隨著我國(guó)社會(huì)經(jīng)濟(jì)生活的不斷發(fā)展，人們對(duì)野生食用菌產(chǎn)品的需求越來(lái)越多。由于目前野生食用菌資源開(kāi)發(fā)缺乏有效的管理和監(jiān)督制約機(jī)制，主要以掠奪性采挖為主[1-2]；致使我國(guó)大量的優(yōu)質(zhì)野生食用菌資源分布越來(lái)越少，也嚴(yán)重的影響當(dāng)?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境[3]。經(jīng)實(shí)地考察，通遼地區(qū)努魯兒虎山脈有一種獨(dú)有食用菌，俗稱(chēng)“天合板”，目前還無(wú)法人工培育，產(chǎn)量極少，干菇售價(jià)每千克已達(dá)到1 000元～1 200元。近年來(lái)隨著市場(chǎng)需求量的增加，可以采集到的“天合板”食用菌越來(lái)越少，當(dāng)?shù)乩习傩找搽y以采挖。

野生食用菌種質(zhì)資源的收集與鑒定是開(kāi)發(fā)利用的前提[4]。傳統(tǒng)的野生食用菌資源鑒定主要是依靠外觀形態(tài)鑒別[5]。但由于缺乏科學(xué)權(quán)威的評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)，而且有些食用菌種類(lèi)子實(shí)體形態(tài)差異較小，例如錫林郭勒草原上的野蘑菇（Agaricus arvensis）、大肥蘑菇（Agaricus bitorquis）、黃斑蘑菇 （Agaricus xanthoderma） 等，被統(tǒng)稱(chēng)為“黑蘑”，一般僅依賴(lài)形態(tài)特征的傳統(tǒng)鑒定分辨不同較為困難[6]。隨著分子生物學(xué)研究的不斷深入，分子標(biāo)記技術(shù)因其準(zhǔn)確、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，受到人們的重視。在分子標(biāo)記中，轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)序列 （internal transcribed spacer，ITS） 區(qū)域片斷較小，易于分析，是中度保守的序列，其表現(xiàn)為種內(nèi)相對(duì)一致，種間差異比較明顯，這些特征使ITS在真菌物種的分子鑒定及真菌的系統(tǒng)發(fā)育研究應(yīng)用中最為廣泛[7-8]。因此ITS可應(yīng)用于真菌菌種鑒定、系統(tǒng)發(fā)育、條形碼和群體多樣性研究中[9]。以通遼地區(qū)采集到的“天合板”食用菌為試驗(yàn)材料，對(duì)其進(jìn)行ITS鑒定，旨在探明“天合板”食用菌的分類(lèi)學(xué)地位，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和保護(hù)這種地區(qū)特色野生食用菌種質(zhì)資源奠定基礎(chǔ)。

表1 ITS序列于GenBank種比對(duì)結(jié)果Tab.1 Comparison results of ITS sequences on GenBank

1 試驗(yàn)材料

1.1 野生資源采集

2018年在內(nèi)蒙古通遼市采集，由當(dāng)?shù)乩相l(xiāng)依據(jù)形態(tài)特征鑒定為通遼地區(qū)“天合板”食用菌。

1.2 試驗(yàn)方法

DNA提取采用CTAB法[10]，PCR反應(yīng)體系參照參考文獻(xiàn)[11]。PCR 引物為 ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’） 、 ITS4（ 5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’）[12]，由上海生工合成；ITS測(cè)序由北京博邁德基因技術(shù)有限公司完成。

2 結(jié)果與分析

2.1 ITS測(cè)序及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果分析

ITS測(cè)序及NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)結(jié)果見(jiàn)表1。

由表1所示，測(cè)定的樣品子實(shí)體rDNA ITS序列長(zhǎng)度為681 bp，其中CG含量為42.58%，測(cè)序質(zhì)量?jī)?yōu)良。將序列提交至NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，獲得序列號(hào)為MK335698，比對(duì)后共獲得100個(gè)比對(duì)結(jié)果，其中同源性僅與 Leucopaxillus sp.（KY173356.1） 為 99%，最大評(píng)分（Max score） 為1 216；與其他物種同源性在86%～81%，最大評(píng)分647～501。

2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中下載比對(duì)到的100個(gè)DNA序列結(jié)果，采用MEGA v7.0.14軟件（鄰接法，neighbor-joining methhod） 對(duì)DNA序列結(jié)果進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的構(gòu)建及遺傳距離的計(jì)算。系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果見(jiàn)圖1。

由圖1所示，天合板（THB） 與其他40個(gè)食用菌親緣關(guān)系較近，其中與Leucopaxillus sp.（KY173356） 遺傳關(guān)系最近，通過(guò)遺傳距離判定確定為同一物種親緣關(guān)系。進(jìn)一步對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)中于其系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系較近的40個(gè)食用菌進(jìn)行分析，信息統(tǒng)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 與“天合板”有較近的親緣關(guān)系的食用菌Tab.2 Edible fungi closely related to the THB

（續(xù)表 2）

由表2所示，親緣關(guān)系接近的40個(gè)食用菌按照拉丁名可以分為12種。這12種食用菌分屬3科，分別是口蘑科（Tricholomataceae）、雞油菌科（Cantharellaceae） 和假杯傘科 （Pseudoclitocybaceae），其中口蘑科8種，假杯傘科3種，雞油菌科1種。按照屬分類(lèi)可以分為7個(gè)屬，其中口蘑科的4個(gè)屬，分別是梭孢傘屬[16]Atractosporocybe、假杯傘屬[18-19]Pseudoclitocybe、Musumecia[17]和蠟?zāi)?Laccaria；假杯傘科3個(gè)屬，分別是Harmajaea[15]、杯樁菇屬Clitopaxillus[13]和Musumecia[17]；雞油菌科1個(gè)屬為雞油菌屬 （Cibarius）。

3 結(jié)論與討論

從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)檢索結(jié)果來(lái)看，天合板（THB）與KY173356.1（Leucopaxillus sp.）無(wú)論是從同源性還是從系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)都可以判定為同一種食用菌。然而以Leucopaxillus sp.為關(guān)鍵詞在NCBI中檢索，共計(jì)獲得72個(gè)結(jié)果，其他命名為L(zhǎng)eucopaxillus sp.的食用菌并未出現(xiàn)在“天合板”檢索結(jié)果中，說(shuō)明其與“天合板”并無(wú)親緣關(guān)系，從而可以推斷KY173356的命名可能并不準(zhǔn)確，需要進(jìn)一步研究分析。從NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)信息可知，KY173356采集于錫林郭勒盟多倫縣，與通遼市地理位置較遠(yuǎn)，因此可以判定“天合板”并不是通遼地區(qū)獨(dú)有種類(lèi)。

通過(guò)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)進(jìn)一步分析，Cantharellula foetida（HQ533021.1） 單獨(dú)1種劃分為1類(lèi)，進(jìn)一步查詢發(fā)現(xiàn)其屬于雞油菌科、雞油菌屬，通過(guò)分析NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中其他雞油菌屬物種，判定HQ533021.1可能是口蘑科的某種食用菌，命名也有待進(jìn)一步確定。因此可以判定“天合板”可能屬于口蘑科或假杯傘科的食用菌。Alvarado等[17]研究結(jié)果表明，假杯傘科是為了適應(yīng)多基因系統(tǒng)發(fā)育推論的結(jié)果而從口蘑科提出了一個(gè)新的類(lèi)群分類(lèi)，這也是Musumecia在分類(lèi)中既出現(xiàn)在口蘑科，又出現(xiàn)在假杯傘科中的原因。通過(guò)檢索可知口蘑科下分93屬1 800余種[20]，絕大多數(shù)是美味可食的蘑菇，如松口蘑（Tricholoma matsutake）、雞（Termitornyces albuminosus），還包括可大量栽培的香菇（Lentinus edodes）、側(cè)耳（Pleurotus sp.）等。參考前人對(duì)口蘑科人工馴化研究成果，可以減小對(duì)“天合板”食用菌進(jìn)行人工馴化的難度。

后續(xù)試驗(yàn)需要進(jìn)一步對(duì)“天合板”食用菌子實(shí)體形態(tài)、菌絲體等形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行描述，并選擇在真菌物種鑒定或者系統(tǒng)發(fā)育分析研宄中常用的方法鑒定，如核糖體DNA內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）、細(xì)胞核編碼的核糖體大亞基DNA（nrDNA-LSU）、核糖體DNA基因間區(qū)（nrDNA-IGS）、延伸因子1α啟動(dòng)子 （EF1-α）、RNA聚合酶Ⅱ第二亞基（RPB2）、RNA聚合酶Ⅱ第一亞基（RPB1） 以及線粒體核糖體小亞基（mtSSU） 等[21]，從而明確“天合板”食用菌的分類(lèi)學(xué)地位，為進(jìn)一步開(kāi)發(fā)和保護(hù)這一特色物種奠定基礎(chǔ)。