煙草NTBZIPO38的克隆、鑒定及表達模式分析

趙澤玉 李志遠 孫晉浩 李東微 解敏敏 陳明麗 龔達平

摘要：堿性亮氨酸拉鏈（bZIP）轉(zhuǎn)錄因子是植物中數(shù)量最多、最具有多樣性的基因家族之一，對植物生長發(fā)育及脅迫響應具有重要作用。為探究煙草中bZIP轉(zhuǎn)錄因子的生物學功能，本研究在煙草K326中克隆得到一個bZP轉(zhuǎn)錄因子基因Vtbzipo38，并對其保守結(jié)構(gòu)域進行分析，利用qRT-PCR技術檢測了該基因的表達模式，進一步結(jié)合亞細胞定位及轉(zhuǎn)錄激活試驗對其功能進行了初步鑒定。結(jié)果表明，NTBZIPO38含有典型的bZP結(jié)構(gòu)域，亞細胞定位于細胞核中并具有轉(zhuǎn)錄激活活性。表達模式分析表明，NIBZIPO38在根中表達量最高（p《0.001），并在鹽、干旱、冷、熱、脫落酸（ABA）等非生物脅迫下都有明顯的表達量變化，在ABA處理下尤其明顯（p《0.001）。因此，作為bZP家族中的一員，NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子可能在煙草根系發(fā)育、ABA響應與非生物脅迫中扮演著重要的角色。

關鍵詞：bZIP;煙草;轉(zhuǎn)錄因子;ABA;非生物脅迫

轉(zhuǎn)錄因子（Transcription Factor，TF）是指能夠特異性結(jié)合啟動子順式作用元件，對靶基因轉(zhuǎn)錄具有促進或抑制作用的DNA結(jié)合蛋白叫，對植物生長發(fā)育起著非常重要的作用。bZIP轉(zhuǎn)錄因子是植物中最大的基因家族之一，它由一個高度保守的DNA結(jié)合域（N-X7-RK-X9）和保守度較低的亮氨酸拉鏈區(qū)組成，其中亮氨酸拉鏈區(qū)是bZIP轉(zhuǎn)錄因子的功能結(jié)構(gòu)域，調(diào)節(jié)多種脅迫響應，例如光脅迫響應、病原體防御等。

隨著生物信息學和基因組測序技術的發(fā)展，bZIP轉(zhuǎn)錄因子成為了研究的熱點。目前，已在擬南芥中鑒定到78個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，玉米中有125個bZIP轉(zhuǎn)錄因子，油菜中有247個bZP轉(zhuǎn)錄因子。擬南芥78個bZIP從進化關系上分為13個亞家族（A-M），同一亞家族具有相似的保守結(jié)構(gòu)域與類似的功能，其中D亞族參與兩個不同的生物進程：病原體防御和植物發(fā)育。目前對煙草bZP家族鑒定有所報道，但對其功能研究卻相對較少。

煙草是茄科的一種重要經(jīng)濟作物，由外界環(huán)境引起的生物和非生物脅迫對煙草品質(zhì)及產(chǎn)量有重要影。研究煙草中bZP轉(zhuǎn)錄因子的保守結(jié)構(gòu)域、進化關系、亞細胞定位和多種非生物脅迫下表達分析等具有重要意義。因此，本研究通過比較基因組學的方法對煙草bZIP家族的基因進行功能鑒定分析，為探究煙草bZIP轉(zhuǎn)錄因子的抗脅迫機制打下基礎。

1材料與方法

1.1試劑和材料處理

試驗材料：普通煙草K326。載體：PEASY-BluntZero載體，pCHF3-GFP，pbridge載體。菌株：農(nóng)桿菌GV3101菌株，酵母AH109菌株。材料處理K326種子經(jīng)消毒處理播種在裝有滅菌土壤的花盆中，在幼苗長至6片真葉時，更換為MS液體培養(yǎng)液，培養(yǎng)5d左右后，對其進行脅迫和激素處理①將幼苗分別轉(zhuǎn)移至50mmol/LNACI溶液和ABA溶液中進行鹽處理與激素處理，處理1、3、6h后分別整株取樣，以處理0h煙苗作為對照;②將幼苗分別轉(zhuǎn)移至4℃與37℃培養(yǎng)箱中進行處理，處理1、3、6h后分別整株取樣，以處理0h煙苗作為對照;③將幼苗轉(zhuǎn)移至吸水濾紙上進行干旱處理，在1、3、6h的時間點分別整株取樣，以處理0h煙苗作為對照。每個處理每次取3株生長狀態(tài)近似的整株煙苗。待煙草生長至現(xiàn)蕾期，釆集植株的根莖、下部葉、中部葉、上部葉、腋芽、花的組織樣品，每個組織取3次重復，在液氮中迅速冷凍后放置于-80℃冰箱中保存。

1.2生物信息學分析

以番茄Solyc05g009660.2.1（S/BZIP38）的蛋白序列為種子序列，在煙草參考基因組K326中進行Blastp序列比對，得到候選基因（NCBI上登錄號XM_016595381.1）。利用EXPASY中的Protparam工具（https：/web.expasy.org/protparam）預測候選基因編碼的蛋白氨基酸序列的分子量、等電點等基本理化性質(zhì);在PLANTTFDB（http：/planttfdb.cbi.pku.edu.cn）下載擬南芥和番茄的bZIP轉(zhuǎn)錄因子序列并進行多重比對分析，使用MEGA-X軟件中的鄰接法（Neighbor-.Joining，NJ）（1000Bootstrap）構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，并通過MEME（http：/meme-suite.org/）分析其保守結(jié)構(gòu)域。

1.3NTBZIP基因的克隆

將煙草在研缽中用液氮研磨為粉末，按照RNA提取試劑盒操作步驟提取植物總RNA并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。依據(jù)候選基因CDS序列設計特異性引物進行PCR擴增，上游引物：5-ATGCAAGCTTTCAAAGCAGCA-3'，下游引物：5-CTAGAGTTGGTCCTGGGGC-3'。對符合大小的片段進行膠回收并與1LPEASY-BLUNT/連接轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，用含有卡那霉素的LB平板進行篩選，將陽性克隆送至華大基因進行測序，測序正確的亞克隆載體命名為Blunt-NTBZIP038。

1.4亞細胞定位分析

以構(gòu)建完成的亞克隆載體Bunt-Ntbz/PO38為模板，使用同源重組的方法將Ntbzipo38基因連接到pCHF3-cGFP亞細胞定位的載體上，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)T1，涂布到含有卡那霉素的LB平板上進行篩選，挑選陽性單克隆進行菌液PCR和測序驗證，提取測序正確的重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV3101中，經(jīng)菌液PCR鑒定后將陽性農(nóng)杄菌注射到煙草葉片的背部，培養(yǎng)72h后，取下葉片，在激光共聚焦顯微鏡下觀察GFP信號。

1.5轉(zhuǎn)錄激活試驗

以構(gòu)建完成的亞克隆載體Blunt-NTBZIPO38為模板，使用同源重組的方法將Vtbzipo38基因連接到pbridge載體ECORI位點中轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)T1，涂布到含有卡那霉素的LB平板上進行篩選，挑選陽性單克隆進行菌液PCR和測序驗證，提取測序正確的重組質(zhì)粒與對照pbridge空載分別轉(zhuǎn)入酵母AH109菌株感受態(tài)中，在SD）-Ip營養(yǎng)缺陷培養(yǎng)基上生長，30℃培養(yǎng)48h，篩選陽性克隆轉(zhuǎn)移至顯色培養(yǎng)基SD/-TrpX-gal上倒置避光培養(yǎng)直至顯色。

1.6表達模式分析

以煙草26STRNA基因作為管家基因，根據(jù)NTBZIPO38編碼序列設計定量引物，Ntbzipo38上游引物為：5-AGCTGCGCCTACTTGT！-3，下游引物為：5-CACCTTCCGCAGGAGTCTI-3?？偡磻w系為20L，反應步驟：95℃30s;95℃5s，60℃34s，循環(huán)40次。具體步驟參考7500芡光定量儀說明書，最后根據(jù)2AC法計算基因的相對表達量。

2結(jié)果

2.1NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化和保守結(jié)構(gòu)域分析

利用擬南芥、番茄中已被鑒定的bZIP轉(zhuǎn)錄因子與MbZPの38進行多序列比對，用MEGA-X軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹，分析其親緣關系。系統(tǒng)進化分析表明（圖1），煙草Ntbzipo38與擬南芥Atbzip46、番茄Solyd5g0096602.1聚在一起，同屬于D亞族。保守結(jié)構(gòu)域MEME分析表明（圖2），NTBZIPO38含有一個高度保守的DN識別結(jié)構(gòu)域（N-X7-RK）及亮氨酸拉鏈區(qū)（-X9-L-X6-L-X6-L），可能參與植物防御反應或植物發(fā)育。

2.2Ntbzipl38基因全長的克隆及理化性質(zhì)分析

以普通煙草K326的cDNA為模板進行PCR擴增，目的條帶大小約為1400bp（圖3），將其命名為NTBZIPO38。將目的片段回收純化后連接至peasy-Blunt克隆載體進行序列測定。測序結(jié)果顯示NTBZIPO38的CDS序列全長為1464bp，編碼487個氨基酸。NTBZIPO38的蛋白序列含有完整的bZIP結(jié)構(gòu)域，是一個典型的bZP家族蛋白。利用Protparam工具分析Ntbzipo38的理化性質(zhì)，該蛋白的相對分子質(zhì)量為53.38kDa，理論等電點為6.73。

2.3NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子的亞細胞定位分析

將構(gòu)建完成的35S-NTBZIPの38-GFP融合表達載體轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌GV311中，以35GFP為空白對照，利用瞬時表達的方法注射到煙草葉片中，利用激光共聚焦顯微鏡觀察NTBZIPO38的亞細胞定位。利用DAPI染色指示細胞核，結(jié)果如圖4所示，融合Ntbzipo38的GFP信號只能在細胞核中觀察到，而空載的GFP信號則遍布整個細胞，證明NTBZIPO38是一個核定位蛋白。

2.4NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄激活分析

為了進一步驗證MbZP38的轉(zhuǎn)錄活性，將GAL4BD-NTBZIP038載體轉(zhuǎn)化至酵母AH109菌株中，以GAIL4BD空載為對照，經(jīng)SD-ITp平板上篩選后轉(zhuǎn)至顯色培養(yǎng)基（SD/-Ip/X-gal）上進行轉(zhuǎn)錄激活驗證。從圖5可以看出，含有Ntbzipo38的GAIL4BD-NbZPの38融合表達載體與空載GAL4BD均能夠在SD/-Ip上生長，而只有GAL4BD-NTBZIPO38融合表達載體オ能夠啟動報告基因表達進而顯示藍色，說明NTBZIPO38具有轉(zhuǎn)錄激活活性。

2.5NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子的表達模式分析

對煙草6個不同組織（根、莖、葉、花、芽、蕾）的Vtbzipl38表達量進行實時熒光定量PCR檢測（圖6），結(jié)果表明，Ntbzipの38在煙草的根、莖、葉、花、芽、花蕾組織中均有表達且在花蕾（FB）和根（R）中的表達量顯著高于其他組織。

試驗結(jié)果表明，Ntbzipo38的表達受多種脅迫的誘導。如圖7所示，在鹽脅迫的條件下，NTBZIPO38基因的表達量在處理1h達到最高（10.5倍），與對照0h相比差異極顯著（p-0.001），隨后表達量逐漸下降。NTBZIPの38在ABA處理條件下的表達模式與鹽脅迫類似，均在1h達到最高（13.3倍），處理6h后表達量為對照的4.6倍。而在干旱脅迫下，NbZP38基因在處理3h時達到最高，其他處理時間的表達量略高于對照。NTBZIP38在高溫脅迫條件下與在4℃冷脅迫條件下表達模式相反，高溫脅迫下的Ntbzip038表達顯著下調(diào)，而冷脅迫下NTBZIPO38表達高于對照，且在6h時達到最高，但差異幅度變化不明顯（p-0.05）。NTBZIPO38的表達受多種脅迫的誘導，且在ABA處理條件下變化最大，表明Vtbzip038可能調(diào)控ABA合成代謝通路。

3討論

bZP轉(zhuǎn)錄因子在植物發(fā)育、代謝和各種脅迫反應中起著重要作用。已有研究證實，在植物生長、衰老、損傷、花發(fā)育及種子成熟等生理生化過程都有bZP轉(zhuǎn)錄因子的參與。例如，擬南芥中AbZP9和ATBZIP46被證明參與了調(diào)控葉片、維管發(fā)育1分生組織與花器官的形成，Atbzip34和Atbzip46與其他bZIP成員互作調(diào)控植物發(fā)育叫。本研究對煙草NTBZIP38轉(zhuǎn)錄因子與擬南芥番茄bZIP家族進行進化分析，Ntbzipo38與Atbzip46同屬D亞家族，且有高度相似性，推測Ntbzipo38可能主要在花與根的組織中表達。對NTBZIPO38根、莖、葉、花、芽、花蕾部位進行表達分析發(fā)現(xiàn)，其在根中的相對表達量最高，其次是花蕾，這與我們的猜測基本一致，Ntbzip038與Atbzip46高度同源使其具有了相似的功能，但對于其在花與根中的調(diào)節(jié)機制有待進一步研究。

植物在整個生長發(fā)育過程中，經(jīng)常會遭受非生物脅迫，例如干旱、高溫、低溫等，這些非生物脅迫對植物生長發(fā)育有著直接的影響，因此植物也形成了各種反饋調(diào)節(jié)機制來適應生存環(huán)境的變化。目前對bZP轉(zhuǎn)錄因子的研究主要集中在逆境脅迫下的調(diào)控機制和功能上。研究表明，轉(zhuǎn)OSBZIP72基因水稻抗旱性明顯比野生型水稻強，過表達水稻中的DSBZIP7基因也有類似的功能。PEG模擬的干旱脅迫下，綠豆中的bZIP52表達量顯著上調(diào)，表明bZIP52可能參與植株的干旱脅迫響應。玉米中的Zmbzip60和ZMBZIP72在擬南芥中過表達也能提高其對干旱和高鹽的耐受力。我們對煙草在鹽、干旱、溫度脅迫下的定量處理表明，NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子對干?、鹽、低溫表現(xiàn)為正調(diào)控，對高溫表現(xiàn)為負調(diào)控。但在番茄中同屬D亞家族的SIBZIP382在低溫高溫脅迫下均表現(xiàn)為正調(diào)控，這可能是不同物種在進化過程中出現(xiàn)了功能分化所導致的。

植物的抗逆調(diào)節(jié)離不開植物激素的作用。研究表明，植物在非生物脅迫下的抗逆調(diào)節(jié)機制通常依賴于ABA途徑2。ABA是植物響應脅迫的激素之一，ABA應答主要是結(jié)合與ABA代謝相關基因啟動子保守的ABRE順式作用元件。CHOI2等首次從擬南芥克隆了bZIP家族A亞家族的轉(zhuǎn)錄因子Atbzip35，主要參與調(diào)控干早、高鹽、ABA、氧化脅迫和高溫脅迫。同時，擬南芥中的AmPP2（12通過ABA信號途徑來提高抗旱能力。轉(zhuǎn)玉米基因ZMBZIP72的擬南芥植株對干旱脅迫和鹽脅迫抗性增強，同時對ABA和滲透脅迫的敏感性也增強。在茄科中，番茄SIAREB轉(zhuǎn)錄因子能結(jié)合ABRE元件響應ABA信號，提高抗旱性2。本研究中NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子受ABA處理后表達量在1h之內(nèi)高達13.3倍，與對照有極顯著的差異，表明NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子可能參與了ABA代謝通路的調(diào)控。

4結(jié)論

本研究利用比較基因組學的方法在煙草中克隆到一個bZIP轉(zhuǎn)錄因子NbZP038。對NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子分析表明其含有典型的bZIP結(jié)構(gòu)域，并將NTBZIPO38定位在細胞核，驗證了NTBZIPO38具有轉(zhuǎn)錄激活活性。表達分析發(fā)現(xiàn)NTBZIPO38在煙草的根、莖、葉、花、芽、花蕾組織中均有表達，且在根中的表達量顯著高于其他組織。在鹽脅迫ABA處理、干旱和溫度脅迫下均有明顯的表達量變化，且在ABA處理下表達量變化最大，表明NTBZIPO38轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控ABA通路并且在鹽、干早、低溫等非生物脅迫過程中發(fā)揮著重要作用。本研究初步探討了煙草bZIP家族bZP38轉(zhuǎn)錄因子的功能，下一步應對其非生物脅迫下的調(diào)控機制進行研究。

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