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      PGPR菌劑在蜈蚣草修復(fù)砷污染土壤中的應(yīng)用研究

      2021-01-16 02:47:16袁明
      種子科技 2021年23期
      關(guān)鍵詞:修復(fù)

      袁明

      摘 ? ?要:為研究PGPR菌劑對蜈蚣草修復(fù)砷污染土壤的作用,采用盆栽進(jìn)行試驗(yàn),在砷濃度150 mg/kg的土壤中接種PGPR菌劑,再培養(yǎng)蜈蚣草。研究結(jié)果表明,接種PGPR菌劑后可以促進(jìn)蜈蚣草生長,土壤中總砷含量減少,顯示PGPR菌劑對蜈蚣草修復(fù)砷污染土壤具有促進(jìn)作用。

      關(guān)鍵詞:蜈蚣草;PGPR菌劑;砷污染土壤;修復(fù)

      文章編號:1005-2690(2021)23-0022-04 ? ? ? 中國圖書分類號:X53 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼:B

      PGPR是植物根際促生菌,可以促進(jìn)植物生長及植物對礦物質(zhì)營養(yǎng)的吸收和利用,是能抑制有害微生物生長的有益菌類。本研究采用蜈蚣草的盆栽試驗(yàn),在蜈蚣草根際施用PGPR菌劑,探討各種PGPR菌劑對蜈蚣草砷超富集能力的影響,得到蜈蚣草與PGPR菌劑共同作用下對砷污染土壤修復(fù)效率的理論依據(jù)。

      1 ? 材料與方法

      1.1 ? 盆栽試驗(yàn)

      將長勢相近的33株蜈蚣草種植于白色塑料花盆中,每個花盆中的土樣為2.2 kg,每日澆清水,前一個月每周澆灌一次植物營養(yǎng)液,每盆20 mL。為保持溫度和濕度,在盆口包上一層保鮮膜。每個花盆中加入亞砷酸鈉,使土壤中砷含量為150 mg/kg。花盆編號1~11號,做3組平行試驗(yàn)。

      1.2 ? 菌株接種

      利用試驗(yàn)前期從蜈蚣草根部分離篩選獲得的具有抗病促生功能的耐砷內(nèi)生細(xì)菌作為PGPR菌劑[1],包括芽孢桿菌、農(nóng)桿菌、假單胞菌3種類群共12株?;?2株菌株的抗病促生能力和拮抗特性進(jìn)行組合,形成PGPR菌劑(具體組合情況見表1),共10組,編號T1~T10。把菌株接種于無菌牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基中,于30 ℃恒溫振蕩培養(yǎng)72 h(活菌數(shù)≥1×108 cfu/mL)。采用澆灌的方式將T1~T10號PGPR菌劑接種于蜈蚣草根部。每一個月重復(fù)加一次菌懸液,總共澆灌4次。以不加菌劑為空白對照(CK)。

      1.3 ? 植物收樣

      蜈蚣草放入光照培養(yǎng)室培養(yǎng)6個月后,將蜈蚣草從花盆中移出,沖洗干凈表面的土壤,移出時避免傷害根莖,然后分開保存根系和地上部[2]。

      1.4 ? 植株生長情況測定

      ①測定蜈蚣草株高:從露出土壤表面的地方測定每根莖的最高點(diǎn)。②測定蜈蚣草葉片總數(shù)。③測定莖粗。④測定鮮重、干重。測定完鮮重后將樣品在115 ℃殺菌0.5 h,然后75 ℃恒溫烘干后稱重。⑤將蜈蚣草地上部與根系分離,用LA-S植物圖像分析儀對根系進(jìn)行洗根分析,得到掃描分析后的根系數(shù)據(jù)與圖片。

      1.5 ? 葉片超氧化物歧化酶(SOD)活性測定

      (1)酶液提取。稱取蜈蚣草葉片0.25 g放入研缽中,加入50 mmol/L、4 ℃、pH值8.2的磷酸緩沖溶液,在水浴鍋中研磨成漿,過濾后將濾液在4 000 r/min下離心20 min,取上清液為待測液。

      (2)超氧化物歧化酶(SOD)活性測定方法。使用鄰苯三酚自氧化法。將50 mmol/L、pH值8.2的Tris-HCl-EDTA緩沖溶液和50 mmol/L鄰苯三酚溶液放在恒溫水浴鍋中,溫度設(shè)定25 ℃。待溫度保持穩(wěn)定后取3 mL Tris-HCl-EDTA緩沖溶液、5μL鄰苯三酚溶液加入試管中,搖勻后迅速放入比色皿中,在紫外分光光度計(jì)中測定吸光度,波長325 nm,每間隔30 s測定一次吸光度,記為A1,此為不加酶液的對照組。

      重復(fù)上述操作,待Tris-HCl-EDTA緩沖溶液、鄰苯三酚溶液混勻后迅速加入5 μL待測液,同樣在波長325 nm處每隔30 s測定一次吸光度,記為A2。

      (3)計(jì)算抑制率S(%)和酶活力性U(U/g)。

      式中:V為反應(yīng)液總體積(mL);N為樣品稀釋倍數(shù)。

      1.6 ? 葉片中過氧化物酶(POD)活性測定

      (1)酶液提取。稱取0.2 g蜈蚣草葉片,然后加入20 mmol/L磷酸緩沖液5 mL,在研缽中研磨成勻漿,轉(zhuǎn)入試管中并以磷酸緩沖液定容到10 mL,以4 000 r/min離心10 min,取上清液為待測酶液。

      (2)反應(yīng)混合液配制。取0.2 ?mol/L磷酸緩沖液(pH值6.0)200 mL加入0.076 mL愈創(chuàng)木酚攪拌溶解,冷卻后加入30%的H2O2 0.112 mL,混勻后保存于冰箱中備用。

      (3)測定方法。取3 mL反應(yīng)混合液加入30 μL酶液,以0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH值6.0)為對照調(diào)零,而后測定OD470值(測定40 s),每30 s讀數(shù)一次。

      (4)酶活性計(jì)算。以每分鐘OD值變化(升高)0.01為1個酶活性單位。計(jì)算酶活性U(U/g)。

      式中:Vt為提取酶液總體積(mL);Vs為測定時取用酶體積(mL);W為樣品鮮重(g);t為反應(yīng)時間(min)。

      1.7 ? 數(shù)據(jù)處理

      試驗(yàn)使用Excel 2010軟件對原始數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析,利用SPSS 17.0計(jì)算Duncan單因素方差。

      2 ? 結(jié)果與分析

      2.1 ? 蜈蚣草生物量參數(shù)

      蜈蚣草生物量參數(shù),株高、葉片數(shù)、莖粗、鮮重、干重見表2。

      試驗(yàn)中,接種T1、T9、T10號組合PGPR菌劑的蜈蚣草與空白對照相比,蜈蚣草的植株高度、莖粗、干鮮重、葉片數(shù)都出現(xiàn)了一定程度的增加。接種T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號組合PGPR菌劑的蜈蚣草,上述生物量參數(shù)出現(xiàn)了一定程度的減少,蜈蚣草生長受到了明顯抑制,株高、莖粗、鮮重、干重、葉片數(shù)都低于空白對照組。蜈蚣草接種不同PGPR菌劑的生長情況見圖1。

      2.2 ? 抗氧化酶系統(tǒng)

      蜈蚣草超氧化物歧化酶與過氧化物酶的活性見表3。

      2.3 ? 蜈蚣草洗根分析

      蜈蚣草的洗根分析如圖2所示,分析數(shù)據(jù)如表4所示。對比空白對照組接種T1、T9、T10號PGPR菌劑的蜈蚣草根系的總根長、根表面積、根平均直徑都有一定程度的增加,T1植株根系平均直徑增長量最大。接種T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號組合PGPR菌劑的蜈蚣草根系總長度、表面積、平均直徑都有一定程度的減少。

      2.4 ? 土壤理化性質(zhì)分析

      土壤理化性質(zhì)如表5所示。11組土壤都為酸性,對比空白對照組可知,施加PGPR菌劑會略微增加土壤的酸性。施加T1、T9、T10號PGPR菌劑還會增加土壤的有機(jī)質(zhì)、速效氮、有效磷、速效鉀含量。

      由表5可知,土壤中的總砷含量有所降低,說明土壤中的砷部分轉(zhuǎn)移到蜈蚣草地上部。與空白對照組相比,添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的土壤中砷含量更低,T1、T9、T10號蜈蚣草從土壤中吸收的砷更多,對土壤中砷的去除效率分別提高了36.36%、9.10%、18.18%。其中,T1號菌劑的效果最好,說明施加PGPR菌劑確實(shí)可以提高蜈蚣草對砷污染土壤的修復(fù)效果。

      2.5 ? 土壤總砷含量與蜈蚣草各項(xiàng)生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

      通過對土壤總砷含量和蜈蚣草各項(xiàng)生理指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性分析,采用SPSS中的雙變量相關(guān)性分析方法,結(jié)果如表6所示。其中,蜈蚣草株高、葉片數(shù)、鮮重、干重、根平均直徑與土壤中總砷顯著負(fù)相關(guān),即與蜈蚣草對砷的吸收量顯著正相關(guān)。

      3 ? 討論

      3.1 ? 接種不同PGPR菌劑對蜈蚣草生長情況的影響

      對比不加菌劑的空白對照,添加T1、T9、T10號PGPR菌劑可以促進(jìn)蜈蚣草生長,提高蜈蚣草的生物量,具體表現(xiàn)在蜈蚣草的株高、干鮮重、葉片數(shù)、莖粗都有明顯增加。這可能是因?yàn)樘砑覲GPR菌劑能夠緩解砷對蜈蚣草的毒性,使蜈蚣草在砷脅迫環(huán)境下也能正常生長。添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號PGPR菌劑的蜈蚣草生長受到抑制,上述各項(xiàng)生物量參數(shù)下降。

      3.2 ? 接種不同PGPR菌劑對蜈蚣草抗氧化酶活性的影響

      添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的蜈蚣草葉片的SOD、POD酶活性都比空白對照組高,添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號PGPR菌劑的蜈蚣草SOD酶和POD酶活性都比空白對照組低。SOD酶和POD酶是蜈蚣草體內(nèi)很重要的抗氧化酶。

      研究表明,蜈蚣草在砷脅迫的環(huán)境下,會產(chǎn)生有毒害作用的自由基,而SOD酶可以清除有毒害的自由基,緩解砷對植物的毒害作用,POD酶能分解SOD酶作用產(chǎn)生的過氧化氫,消除過氧化氫對植物的氧化作用[3]。接種T1、T9、T10號PGPR菌劑能夠促進(jìn)蜈蚣草生長,提高蜈蚣草生物量的原因可能是T1、T9、T10號PGPR菌劑提高了蜈蚣草的SOD、POD酶活性,緩解了砷脅迫環(huán)境對蜈蚣草的毒害作用,相反T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號蜈蚣草生長受到抑制,可能是由于對應(yīng)的PGPR菌劑能會抑制SOD、POD酶活性。

      3.3 ? 接種不同PGPR菌劑對蜈蚣草根系形態(tài)的影響

      對比空白對照組,添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的蜈蚣草根系總根長、根表面積、根平均直徑都有一定程度的增加,添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號PGPR菌劑的蜈蚣草根系總根長、根表面積、根平均直徑都有所下降。本試驗(yàn)中添加的PGPR菌劑對蜈蚣草根系的生長特性有所改變,其中T1、T9、T10號PGPR菌劑提高了蜈蚣草根系長度、表面積與直徑,增大了根系與土壤的接觸面積,有利于蜈蚣草從土壤中吸收砷。添加T1、T9、T10號PGPR菌劑能促進(jìn)蜈蚣草生長、提高植株生物量,可能是因?yàn)镻GPR菌劑引起蜈蚣草根系形態(tài)改變,提高根系體積與活力,可以更好地吸收土壤中的營養(yǎng)物質(zhì)[4]。

      3.4 ? 蜈蚣草生長情況與PGPR菌劑中的菌株組合方式的關(guān)系

      添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的蜈蚣草生長情況優(yōu)于空白對照組,蜈蚣草的株高、干鮮重、葉片數(shù)、莖粗都有明顯增加,根系總根長、根表面積、根平均直徑也有一定程度的增加。根據(jù)表1中菌株的組合方式發(fā)現(xiàn),T1、T9、T10號PGPR菌劑中都有芽孢桿菌A,其余生長受到抑制的蜈蚣草中都沒有接種含有芽孢桿菌A的PGPR菌劑。研究發(fā)現(xiàn),芽孢桿菌有抑制病原菌生長、幫助植物提高免疫力、分泌植物激素的能力。因此,芽孢桿菌A對促進(jìn)蜈蚣草生長、進(jìn)一步提高砷修復(fù)有潛在價(jià)值。

      3.5 ? 接種不同PGPR菌劑對土壤理化性質(zhì)的影響

      試驗(yàn)中11組土壤都呈酸性,添加PGPR菌劑會使土壤的pH值略微下降。研究表明,蜈蚣草對酸性環(huán)境有很高的耐受性,能夠在酸性很強(qiáng)的土壤中生長,并且在酸性條件下對砷的吸收能力更強(qiáng)[5]。本試驗(yàn)中添加PGPR菌劑,對土壤pH值的改變不明顯,對蜈蚣草砷吸收能力沒有影響。

      添加T1、T9、T10號PGPR菌劑會增加土壤中的有機(jī)質(zhì)、有效磷、速效氮、速效鉀含量。研究表明,微生物通過降解、合成等各種活動可以提高土壤中的有機(jī)質(zhì)和各種營養(yǎng)成分,導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)改變。

      11組土壤中的砷濃度都有所降低,低于最初未種植蜈蚣草時的濃度(150 mg/kg)。添加T1、T9、T10號PGPR菌劑的土壤中砷濃度低于空白對照組,添加T2、T3、T4、T5、T6、T7、T8號PGPR菌劑的土壤中砷濃度高于空白對照組。這說明添加T1、T9、T10號菌劑的蜈蚣草砷吸收能力增強(qiáng),對土壤砷修復(fù)效果增強(qiáng),其中,T1號PGPR效果最好。這可能是因?yàn)樘砑覲GPR菌劑能夠促進(jìn)蜈蚣草生長,提高了植株生物總量,而更大的生物量意味著相同環(huán)境能富集到更多的砷。T1、T9、T10號蜈蚣草根系總長、根表面積、根平均直徑增加,能幫助蜈蚣草富集到更多砷。

      4 ? 結(jié)論

      通過試驗(yàn)可知,接種T1、T9、T10號PGPR菌劑對蜈蚣草地上部及根系的生長有促進(jìn)作用,并能提高蜈蚣草修復(fù)土壤砷污染的效果,減少土壤中的總砷含量。本試驗(yàn)表明,PGPR菌劑在促進(jìn)蜈蚣草修復(fù)砷污染土壤方面具有潛在價(jià)值。

      參考文獻(xiàn):

      [1]李韻詩,馮沖凌,吳曉芙,等.重金屬污染土壤植物修復(fù)中的微生物功能研究進(jìn)展[J].生態(tài)學(xué)報(bào),2015,35(20):6881-6890.

      [2]余天紅,黎華壽.砷污染土壤微生物修復(fù)機(jī)制及其研究進(jìn)展[J].環(huán)境污染與防治,2014,36(12):77-82.

      [3]馮欣,刁治民,曹玲珍,等.PGPR作為微生物肥料的研究進(jìn)展[J].安徽農(nóng)學(xué)通報(bào),2005,11(6):85-87.

      [4]崔巖山,陳曉晨,付瑾.污染土壤中鉛、砷的生物可給性研究進(jìn)展[J].生態(tài)環(huán)境學(xué)報(bào),2010,19(2):480-486.

      [5]李有志,羅佳,張燦明,等.湘潭錳礦區(qū)植物資源調(diào)查及超富集植物篩選[J].生態(tài)學(xué)雜志,2012,31(1):16-22.

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