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2021-01-16 07:28:46
探索科學(xué)(學(xué)術(shù)版) 2020年2期
西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院 陜西 西安 710021
變異鏈球菌(Streptococcus mutans,S．mutans,以下簡稱為變鏈菌)一直被認(rèn)為是最重要的致齲菌[1],在人們的口腔微環(huán)境中占有很關(guān)鍵的生態(tài)地位。在其諸多致齲的特性中,耐酸性是一個非常關(guān)鍵的因素。耐酸性主要是指細(xì)菌能在酸性環(huán)境中生長,并在這種環(huán)境下代謝碳水化合物產(chǎn)酸的水平。耐酸性包括了2個層面的概念[2－3],分別被稱為基本耐酸(Constitutive acidtolerance)以及耐酸反應(yīng)(Acid tolerance response,ATR)。此次實驗中介紹了變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS缺陷株分別在不同p H值酸性環(huán)境下的生長狀況,為下一步的研究奠定基礎(chǔ)。
1 材料與方法
1．1 實驗菌株和培養(yǎng)基 變鏈菌Ingbritt C國際標(biāo)準(zhǔn)株及本實驗室成功構(gòu)建并保存的LuxS基因缺陷株[3];TSA固體培養(yǎng)基及牛心腦浸液培養(yǎng)基(BHI)。
1．2 儀器設(shè)備和試劑 紫外分光光度計,美國BECKMAN公司;TGL－16C高速冷凍離心機(jī),上海飛鴿;電熱恒溫水浴箱,杭州藍(lán)天化檢儀器廠;隔水式恒溫培養(yǎng)箱,上海安亭科學(xué)儀器廠;R200電子天平,德國;進(jìn)口96孔微量板。
1．3 實驗方法 將變鏈菌Ingbritt C標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS缺陷株常規(guī)復(fù)蘇,提純鑒定為純菌后,分別于4℃、3 000 r/min離心l5min并棄去上清液,將收集的細(xì)菌沉淀物用無菌生理鹽水稀釋,振蕩器振蕩混勻1 min后,用紫外分光光度計于600 nm處調(diào)整制備為吸光度(A)約為0．7的菌懸液備用。
配制p H值3．5～7．0、間隔0．5的一系列BHI液體培養(yǎng)基,按照l∶10(V/V)的比例將兩種菌液接種于BHI液體培養(yǎng)基,兩種菌株均培養(yǎng)48 h,并設(shè)置為3份樣品。離心棄清后逐一測定吸光度值,以無菌生理鹽水為陰性對照。將兩菌液接種于配制好的p H值3．0的BHI液體培養(yǎng)基,在酸化培養(yǎng)前后分別取樣稀釋,菌液濃度在菌落計數(shù)器上計數(shù)并推算出來,算出的比值即酸化前后菌液濃度之比,又稱之為生存率。
1．3．3 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13．0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,實驗數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,通過雙因素方差分析來比較不同p H組和菌種間的差異,檢驗水準(zhǔn)α＝0．05。
2 結(jié)果與分析
如表1所示,p H值為6．0～7．0時,標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS缺陷株均生長良好,同一p H值時和3組不同p H值下,兩菌株細(xì)菌的生長差異均無統(tǒng)計學(xué)意義;p H值5．5時,兩菌株生長均受到影響,其吸光度都顯著下降;p H值5．0時,缺陷株生長受到明顯抑制,而標(biāo)準(zhǔn)株仍保持一定的生長態(tài)勢;p H值4．5時,缺陷株與標(biāo)準(zhǔn)株相比幾乎沒有表現(xiàn)出生長態(tài)勢,而標(biāo)準(zhǔn)株生長也受到了明顯影響;p H值4．0、3．5時,兩種菌株的生長態(tài)勢都不明顯;將兩菌株在p H值3．0下培養(yǎng)30 min,缺陷株生存率(0．0064%)與標(biāo)準(zhǔn)株生存率(0．0790%)相比明顯降低。
表1 變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株和LuxS缺陷株在不同p H下吸光度(A)值的比較
當(dāng)變鏈菌長期生長在相對低的p H值環(huán)境時,可能發(fā)生耐酸反應(yīng),隨之其會具備一定的適應(yīng)性耐酸能力。從表中實驗結(jié)果可知,LuxS基因缺陷株一定程度下能適應(yīng)相對微弱的酸性環(huán)境,其生長可以不受很大影響,仍能正常進(jìn)行。由于變鏈菌攝取食物中的糖類后,進(jìn)行無氧酵解并馬上產(chǎn)生大量的酸,酸積聚促進(jìn)了對牙菌斑的酸沖擊,最終會導(dǎo)致牙釉質(zhì)脫礦,從而促進(jìn)齲齒形成。體內(nèi)p H遙感監(jiān)測證明,在3 min內(nèi),受到年齡階段、牙菌斑的成分和食物中碳水化合物濃度的影響,牙菌斑p H值會隨著糖類的攝入逐漸從7．0降低到4．0[4]。對變鏈菌指數(shù)期浮游細(xì)胞的研究顯示,p H值從7．5變?yōu)?．5超過2 h就會誘導(dǎo)酸耐受反應(yīng),其在p H 3．0下的生存率就會得以提高。因此此次研究將p H值5．5選作預(yù)酸化的p H值。p H值5．5時,兩種菌株的吸光度都明顯降低,其生長能力顯著變?nèi)??？赡苁且驗榫鷥?nèi)多種酶和細(xì)菌細(xì)胞壁在外周酸性p H值的影響下受到了損傷,其完整性及通透性產(chǎn)生了變化,進(jìn)而影響了細(xì)菌的生長繁殖[5]。
變鏈菌生長繁殖和產(chǎn)酸代謝隨著外部環(huán)境p H值進(jìn)一步降低,酸性進(jìn)一步加強時,其生長受到的抑制影響表現(xiàn)就會越強。當(dāng)p H值降至4．0、3．5時,越來越高的酸性環(huán)境已損傷兩種菌株的多種酶和細(xì)胞壁,其菌體生長都受到顯著抑制。
3 結(jié)論
變鏈菌標(biāo)準(zhǔn)株與LuxS缺陷株的耐酸性有一定差異,LuxS缺陷株相對于標(biāo)準(zhǔn)株,抵抗外部的低p H值環(huán)境能力有所下降。兩種菌株在耐酸反應(yīng)方面都表現(xiàn)出了一定的適應(yīng)性,也進(jìn)一步表明了LuxS基因?qū)τ谧冩溇?對其生理功能和毒性調(diào)節(jié)方面具備比較大的影響作用,為后期繼續(xù)研究LuxS基因的其他相關(guān)功能以及發(fā)現(xiàn)齲齒防治的新方法打下良好的基礎(chǔ)。
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配制p H值3．5～7．0、間隔0．5的一系列BHI液體培養(yǎng)基,按照l∶10(V/V)的比例將兩種菌液接種于BHI液體培養(yǎng)基,兩種菌株均培養(yǎng)48 h,并設(shè)置為3份樣品。離心棄清后逐一測定吸光度值,以無菌生理鹽水為陰性對照。將兩菌液接種于配制好的p H值3．0的BHI液體培養(yǎng)基,在酸化培養(yǎng)前后分別取樣稀釋,菌液濃度在菌落計數(shù)器上計數(shù)并推算出來,算出的比值即酸化前后菌液濃度之比,又稱之為生存率。
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變鏈菌生長繁殖和產(chǎn)酸代謝隨著外部環(huán)境p H值進(jìn)一步降低,酸性進(jìn)一步加強時,其生長受到的抑制影響表現(xiàn)就會越強。當(dāng)p H值降至4．0、3．5時,越來越高的酸性環(huán)境已損傷兩種菌株的多種酶和細(xì)胞壁,其菌體生長都受到顯著抑制。
3 結(jié)論
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