人參莖葉總皂苷對(duì)低蛋白誘導(dǎo)的宮內(nèi)生長(zhǎng)受限大鼠的保護(hù)作用

劉旭，單偉

(1.錦州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科一病區(qū)；2.錦州醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院解剖學(xué)教研室，遼寧 錦州 121000)

宮內(nèi)生長(zhǎng)受限(intrauterine growth restriction，IUGR)是以新生兒出生體重低的方式表現(xiàn)出來(lái)[1]。據(jù)估計(jì)，其發(fā)病率約占妊娠的3%，并與圍產(chǎn)期死亡率和嚴(yán)重發(fā)病率相關(guān)，并對(duì)成人生活中的神經(jīng)發(fā)育和心血管健康產(chǎn)生不良影響。目前幾乎沒(méi)有預(yù)防或治療IUGR的方法或藥物。因此，減輕IUGR的發(fā)病率和影響在人類(lèi)和獸醫(yī)醫(yī)學(xué)中都是迫切需要的。

IUGR不僅與營(yíng)養(yǎng)不良有關(guān)，還與氧化應(yīng)激有關(guān)，氧化應(yīng)激會(huì)引發(fā)低度炎癥。此外，IUGR胎兒的抗氧化防御系統(tǒng)被削弱，使氧化應(yīng)激加重。人參具有抗腫瘤、抗輻射、抑制中樞疲勞、改善微循環(huán)等作用。此外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，人參莖葉總皂苷對(duì)小鼠腎損傷具有保護(hù)作用，其機(jī)制可能與改善氧化應(yīng)激、減少炎癥反應(yīng)及抗細(xì)胞凋亡有關(guān)[2]。這些研究也許會(huì)為進(jìn)一步研究人參莖葉總皂苷對(duì)治療IUGR提供一些研究思路。所以，本研究的目的在于明確人參莖葉總皂苷是否對(duì)妊娠期低蛋白飲食誘導(dǎo)的IUGR具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SD大鼠，雄性和雌性只數(shù)按1∶2比例，體重200～230 g，由錦州醫(yī)科大學(xué)提供[SCXK(遼)2017-0002]。

1.2 實(shí)驗(yàn)所用試劑及器材

人參莖葉總皂苷(純度82 %，新賓藥廠，批號(hào)20180312)，LC3和Beclin1抗體(上海生工生物有限公司)。IGF-1(Insulin-like growth factor 1)，GH(Growth hormone)，GHRH(Growth hormone releasing hormone)，SST(Somatostatin)，GSH(Reduced-glutathione)、INS(insulin)，T3(triiodothyronine)，T4(thyroxine)；SOD(Superoxide dismutase)、MDA(Malondialdehyde)等試劑盒均購(gòu)于南京建成生物有限公司。

石蠟切片機(jī)(德國(guó)萊卡LEICA-RM2135)、流式細(xì)胞儀(美國(guó)BD公司FACS Calibur)酶標(biāo)儀(中國(guó)DNM-9602G)、熒光化學(xué)發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(以色列MF-ChemiBIS3.2)、光學(xué)顯微鏡(OLYMPUS，bx60日本)等。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 模型制備及動(dòng)物給藥

動(dòng)物分別在24 ℃和12 h的光照/暗循環(huán)下飼養(yǎng)3 d。雄性和雌性老鼠按1∶2的比例被放在籠子里。IUGR大鼠制備方法參照文獻(xiàn)[3]。具體方法如下：妊娠大鼠立即分為以下3組(n=8)。以空白組為對(duì)照組，飼喂20%(w/w)蛋白飼料。模型組與人參莖葉總皂苷組妊娠第11～21天給予8%(w/w) 低蛋白日糧誘導(dǎo)IUGR。人參莖葉總皂苷在妊娠第11～21天灌胃給藥，劑量為50 mg/kg。在出生后第1天，記錄胎鼠體重、器官重量、每胎仔數(shù)、死亡率和畸形。取胎鼠血清樣品，3000×g，離心15 min。

1.3.2 血清生化指標(biāo)檢測(cè)

胎鼠血清生化指標(biāo)(SST、GHRH、GH、INS、IGF-1、T3、T4)水平采用雙配體酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，按照說(shuō)明書(shū)測(cè)定。生化試劑盒檢測(cè)SOD、GSH、MDA。

1.3.3 光鏡分析

肝臟在4%多聚甲醛固定48 h。70%～95%乙醇1 h，100%乙醇為0.5 h 2次常規(guī)脫水，二甲苯透明，透明時(shí)間不固定，與組織塊大小有關(guān)；浸蠟2次，最后進(jìn)行包埋。石蠟切片機(jī)進(jìn)行切片，厚度為5 μm。HE染色，組織形態(tài)學(xué)觀察。切片用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行檢查。

1.3.4 流式細(xì)胞儀器檢測(cè)LC3和Beclin1蛋白的表達(dá)

取出肝臟，剪成0.5 cm小塊，放進(jìn)EP管，再將其剪碎，制備組織勻漿，過(guò)濾，離心取上清。加入LC3和Beclin1一抗，室溫孵育30 min。PBS洗滌2次，加入帶有Cy3標(biāo)記的熒光二抗，孵育30 min。PBS洗滌2次。流式細(xì)胞儀激光管提前預(yù)熱25 min，將儀器用熒光微球進(jìn)行調(diào)整?？瞻讟?biāo)定為對(duì)照管，然后分析讀取數(shù)據(jù)，記錄標(biāo)本LC3和Beclin1蛋白的表達(dá)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 新生仔鼠數(shù)量的變化

與空白組比較，模型組新生仔鼠數(shù)量減少，差異顯著(P<0.05)；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組新生仔鼠數(shù)量明顯增加，見(jiàn)表1。

表1 各組新生仔鼠數(shù)量測(cè)定結(jié)果

2.2 新生仔鼠的體重、臟器指數(shù)比較

表2可以看出，與空白組比較，模型組仔鼠平均體重明顯減少，差異顯著(P<0.05)，肝臟指數(shù)比、小腸指數(shù)比明顯增加(P<0.01)；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組仔鼠的平均體重體現(xiàn)出明顯增加，有顯著差異(P<0.01)，小腸指數(shù)比、肝臟指數(shù)比明顯減少(P<0.01)。

2.3 血清中生長(zhǎng)發(fā)育相關(guān)因子檢測(cè)結(jié)果

與空白組比較，模型組新生仔鼠血清中GHRH、GH明顯增加，IGF-1、SST、INS、T3 和T4明顯減少，差異顯著(P<0.001)；與模型組相比，人參莖葉總皂苷組GHRH，GH明顯減少，SST、INS、IGF-1、T3和T4明顯增加(P<0.01)，差異顯著(P<0.01)，見(jiàn)表3。

2.4 血清中抗氧化指標(biāo)比較

與空白組比較，模型組新生仔鼠血清中SOD與 GSH明顯減少，MDA明顯增加，差異顯著(P<0.01)；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組SOD與 GSH明顯增加，MDA明顯減少，差異顯著(P<0.01)，見(jiàn)表4。

表2 各組新生仔鼠體重、臟器指數(shù)、IUGR發(fā)生率比較

表3 新生仔鼠血清中GHRH，SST，GH，INS，IGF-1，T3 和 T4檢測(cè)指標(biāo)

表4 新生仔鼠血清中SOD，GSH，MDA的比較

2.5 肝臟形態(tài)學(xué)檢測(cè)結(jié)果

空白組新生仔鼠肝臟肝索排列不規(guī)則。肝索與肝索之間可以看見(jiàn)肝血竇，在肝血竇里有血細(xì)胞存在?？梢?jiàn)多邊形或圓形的肝細(xì)胞，肝細(xì)胞與肝細(xì)胞之間界限不清晰。肝細(xì)胞大多數(shù)是一個(gè)核，細(xì)胞核圓，位于細(xì)胞的中央，肝細(xì)胞胞質(zhì)豐富。此外，還可以看見(jiàn)與不同發(fā)育階段肝細(xì)胞混合的髓樣造血干細(xì)胞。造血干細(xì)胞成群存在，細(xì)胞核呈小球形、圓形、著色較深。模型組，造血干細(xì)胞和血細(xì)胞較空白組減少；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組造血干細(xì)胞和血細(xì)胞增加，見(jiàn)圖1。

2.6 肝臟LC3和Beclin1蛋白的影響

與空白組比較，模型組新生仔鼠肝組織中LC3和Beclin1表達(dá)明顯增加，差異顯著(P<0.05)；與模型組比較，人參莖葉總皂苷組LC3和Beclin1明顯減少，差異顯著(P<0.05)，見(jiàn)圖2。

↓：髓樣造血干細(xì)胞

圖2 肝組織LC3和Beclin1蛋白的表達(dá)

3 討 論

基礎(chǔ)特征(新生仔鼠數(shù)量、死胎率和畸形率、新生仔鼠體重、臟器指數(shù)和IUGR發(fā)生率)、胎鼠血清生化指標(biāo)、形態(tài)學(xué)指標(biāo)表明，我們成功建立了IUGR的大鼠實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型。對(duì)于治療，人參莖葉總皂苷可以改善以上指標(biāo)。提示人參莖葉總皂苷可能對(duì)IUGR大鼠有治療作用。

IUGR能夠改變下丘腦-垂體-腎上腺功能。生長(zhǎng)激素(GH)是腦垂體前葉分泌的191種長(zhǎng)鏈氨基酸激素，在促進(jìn)長(zhǎng)骨生長(zhǎng)、調(diào)節(jié)糖脂代謝、肝功能代謝和能量平衡等方面發(fā)揮重要作用。生長(zhǎng)激素釋放激素(GHRH)和生長(zhǎng)抑素(SST)均由下丘腦分泌。我們的實(shí)驗(yàn)顯示，人參莖葉總皂苷降低了血清中GHRH和GH的水平，上升血清中SST水平。因此，我們認(rèn)為在IUGR中，人參莖葉總皂苷的作用與GHRH/SST/GH有關(guān)。

生長(zhǎng)激素的作用可以通過(guò)胰島素樣生長(zhǎng)因子1(IGF-I)間接介導(dǎo)，IGF-I在肝臟和其他組織中產(chǎn)生。胎齡小的新生兒IGF-1、胰島素(INS)水平明顯低于胎齡適宜的新生兒[4]。與我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與模型組相比，人參莖葉總皂苷組血清中IGF-1和INS水平升高。結(jié)果表明，人參莖葉總皂苷影響IGF-1/INS通路介導(dǎo)的IUGR大鼠。

有研究表明，影響胎兒發(fā)育至關(guān)重要的因素是脂質(zhì)信號(hào)和能量的來(lái)源，而子宮內(nèi)脂質(zhì)含量的改變主要是原因是甲狀腺功能的減退[5]。胎兒組織的終末分化及一般組織的增生，會(huì)受到甲狀腺激素的調(diào)節(jié)，為胎兒的體外發(fā)育做準(zhǔn)備。IUGR嬰兒出生時(shí)血漿T3、T4減少[6]。我們的結(jié)果顯示，在IUGR中，T3和T4在出生時(shí)減少，人參莖葉總皂苷顯著增加了T4、T3的比例，提示人參莖葉總皂苷促進(jìn)了T4 、T3的產(chǎn)生。研究表明，人參原粉及人參水提物對(duì)正常成年大鼠的糖脂代謝及下丘腦-垂體-甲狀腺軸無(wú)明顯影響[7]。正常成年人參食用促甲狀腺激素、T3、T4、睪酮和促腎上腺皮質(zhì)激素水平均下降[8]。這些研究主要集中在正常成年動(dòng)物或成人，但是還沒(méi)有關(guān)于胎兒的報(bào)道。本研究未對(duì)母體激素進(jìn)行檢測(cè)，有待進(jìn)一步研究。

適當(dāng)?shù)淖允杀桓鼜V泛地認(rèn)為是對(duì)抗各種環(huán)境因素的基本細(xì)胞生存機(jī)制，而過(guò)度激活的自噬是加速細(xì)胞死亡的級(jí)聯(lián)反應(yīng)。增強(qiáng)的自噬可能是IUGR胎兒重要的機(jī)制[9]。LC3對(duì)自噬活性至關(guān)重要[10]。此外，自噬體形成所需的關(guān)鍵信號(hào)元件Beclin1和作為降解泛素化底物的選擇性自噬受體的p62也被用作自噬的標(biāo)記物[11]。人參皂苷在不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭袑?duì)自噬有不同的影響。人參皂苷 Rg1抑制海馬神經(jīng)元異常自噬活動(dòng)有關(guān)[12]。人參皂苷Rb1可以抑制阿霉素誘導(dǎo)的自噬相關(guān)結(jié)構(gòu)增加等[13]。也有報(bào)道認(rèn)為，人參皂苷Rg1處理組LC及Beclin 1蛋白表達(dá)水平顯著上調(diào)[14]。我們的數(shù)據(jù)表明，人參莖葉總皂苷顯著降低了自噬水平。其對(duì)自噬的影響與前人研究一致。這可能與IUGR中IGF-1信號(hào)的激活有關(guān)。這些推測(cè)將在今后加以研究。脂質(zhì)過(guò)氧化作用于胎兒生長(zhǎng)受限孕婦孕期明顯增強(qiáng)[15]。超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(SOD)為抗氧化酶的重要組成部分，丙二醛(MDA)為脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物之一。GSH 是體內(nèi)主要的抗氧化劑。我們的數(shù)據(jù)表明，人參莖葉總皂苷顯著拮抗了IUGR的氧化作用。

綜上所述，本研究表明，人參莖葉總皂苷可能在IUGR大鼠中發(fā)揮有效作用。這些作用可能與增加甲狀腺激素、GHRH/SST/GH、激活I(lǐng)GF-1/INS信號(hào)通路、抗氧化、減少自噬有關(guān)。