胸主動(dòng)脈夾層動(dòng)物模型研究進(jìn)展

楊俊，鄔光敏，付品婷，郭媛媛

（昆明醫(yī)科大學(xué)附屬心血管病醫(yī)院/云南省阜外心血管病醫(yī)院 血管外科，云南 昆明 650032）

主動(dòng)脈分為內(nèi)膜（基底膜上的內(nèi)皮細(xì)胞）、中膜（彈性蛋白和平滑肌細(xì)胞）、外膜（膠原纖維和成纖維細(xì)胞）3 層，動(dòng)態(tài)變化著的細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)通過(guò)復(fù)雜的相互作用來(lái)響應(yīng)心臟射血所產(chǎn)生的高強(qiáng)度血流動(dòng)力學(xué)變化，其中任何一環(huán)出現(xiàn)問(wèn)題都有可能導(dǎo)致主動(dòng)脈夾層（aortic dissection，AD），其中以胸主動(dòng)脈夾層（thoracic aorta dissection，TAD）最為多見(jiàn)。TAD因涉及范圍不同被分為Stanford A型（涉及升主動(dòng)脈）和Stanford B型（未涉及升主動(dòng)脈），其主要病理特征為平滑肌細(xì)胞凋亡、細(xì)胞外基質(zhì)降解、炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)、蛋白多糖蓄積[1-2]。對(duì)于AD的研究每種模型都有其擅長(zhǎng)的領(lǐng)域，嚙齒動(dòng)物基因組研究廣泛，生命周期短，常用化學(xué)誘導(dǎo)或轉(zhuǎn)基因方式建模，對(duì)AD發(fā)病機(jī)制的研究最有優(yōu)勢(shì)。基因模型主要以基因敲除、基因過(guò)表達(dá)、或病毒轉(zhuǎn)染等方式來(lái)研究單個(gè)或多個(gè)基因?qū)D的影響?；瘜W(xué)誘導(dǎo)模型是通過(guò)藥物或飲食調(diào)整的方式誘導(dǎo)動(dòng)物產(chǎn)生AD。雖然現(xiàn)在也有通過(guò)主動(dòng)脈顯微手術(shù)誘導(dǎo)的小動(dòng)物模型[3]，但由于體量太小在手術(shù)改進(jìn)、器械測(cè)試和血流動(dòng)力學(xué)評(píng)估等方面與大動(dòng)物沒(méi)有可比性。大動(dòng)物模型的局限性在于無(wú)法復(fù)制AD的內(nèi)側(cè)變性，目前主要是通過(guò)外科手術(shù)或腔內(nèi)途徑侵入性建模，以求外觀上和夾層達(dá)到統(tǒng)一，病理生理方面更接近創(chuàng)傷性或醫(yī)源性AD。

1 小動(dòng)物模型

1.1 化學(xué)或飲食誘導(dǎo)的動(dòng)物模型

β-氨基丙腈（β-a m i n o p r o p i o n i t r i l e，BAPN）是賴氨酰氧化酶抑制劑，可破壞細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境[4]。Ang II除了能升高血壓還有其他非血流動(dòng)力學(xué)作用[5]。Ang II與BAPN聯(lián)合使用是目前最常用的化學(xué)誘導(dǎo)模型。Kurihara等[6]首次用BAPN/Ang II聯(lián)合誘導(dǎo)的方式誘發(fā)AD。他們先用BAPN預(yù)處理小鼠，再給Ang II或NE。結(jié)果顯示，BAPN/Ang II組在泵入Ang II 6 h后開(kāi)始產(chǎn)生AD，24 h 100%產(chǎn)生AD，而B(niǎo)APN/NE組或BAPN組成功率僅10%。后來(lái)Ren等[7]用相同方法使C57BL/6和FVB兩種遺傳背景的小鼠也全部產(chǎn)生了AD，這說(shuō)明此模型可復(fù)制性極高。BAPN通過(guò)破壞未成熟小鼠主動(dòng)脈壁的完整性，誘使主動(dòng)脈內(nèi)側(cè)變性，再經(jīng)Ang II處理后，慢性主動(dòng)脈瘤轉(zhuǎn)為AD。近期Izawa-Ishizawa等[8]在用BAPN/Ang II前先用亞硝基左旋精氨酸甲酯（Nω-nitro-L-arginine methyl ester，L-NAME）預(yù)處理小鼠，L-NAME是NO合酶抑制劑，可使內(nèi)皮氧化應(yīng)激而加重AD。結(jié)果發(fā)現(xiàn)L-NAME組AD患病率顯著提升，內(nèi)側(cè)變性也更明顯。雖然之前已經(jīng)有了成功率1 0 0%的化學(xué)誘導(dǎo)模型，但該模型引入內(nèi)皮損傷因素驗(yàn)證了匹伐他汀能通過(guò)抑制內(nèi)皮氧化應(yīng)激預(yù)防AD的產(chǎn)生。最近Nishida等[9]在Ang II/BAPN的基礎(chǔ)上加鹽水誘導(dǎo)，致AD破裂率增加，發(fā)現(xiàn)高鹽對(duì)AD的惡化作用與IL-17有很大關(guān)系。此外，還有用高脂飲食和Ang II聯(lián)合構(gòu)建的散發(fā)性AD模型，LeMaire等[10]用該模型驗(yàn)證了環(huán)丙沙星對(duì)AD的惡化作用。以上小鼠化學(xué)或飲食誘導(dǎo)模型具體操作見(jiàn)圖1。

圖1 小鼠化學(xué)或飲食誘導(dǎo)模型Figure 1 Chemical- or diet-induced mice models

1.2 基因動(dòng)物模型

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型主要用于遺傳性TAD的研究，遺傳性TAD主要有Marfan綜合征、Loeys-Dietz綜合征、血管性Ehlers-Danlos綜合征3種。Marfan綜合征小鼠主要有F b n 1mgΔ/mgΔ、F b n 1mgR/mgR、Fbn1C1039G/+3種，F(xiàn)bn1mgΔ/mgΔ、Fbn1mgR/mgR小鼠分別在出生后3周、1年內(nèi)死亡[11-12]，F(xiàn)bn1C1039G/+雜合小鼠不會(huì)死于AD，2個(gè)月后出現(xiàn)內(nèi)側(cè)變性[13]，常與化學(xué)誘導(dǎo)聯(lián)用[14]。LDS小鼠主要有Tgfbr1M318R/+、Tgfbr2G357W/+、Tgfb1+/-、Tgfb2+/-、Smad3+/-，其中單倍體不足小鼠（Tgfb1+/-、Tgfb2+/-）單個(gè)等位基因的功能喪失就足以引起主動(dòng)脈根動(dòng)脈瘤，但雜合錯(cuò)義突變小鼠（Tgfbr1M318R/+、Tgfbr2G357W/+）卻更能代表Loeys-Dietz 綜合征的血管表型[15-18]。血管性Ehlers-Danlos綜合征小鼠中只有+/Col3a1△、Col3a1G209S/+、Col3a1G938D/+小鼠能產(chǎn)生少量AD[19-20]。

2 大動(dòng)物模型

2.1 通過(guò)外科手術(shù)創(chuàng)建的動(dòng)物模型

2.1.1 Stanford B 型主動(dòng)脈夾層（type B aortic dissection，TBAD）大動(dòng)物模型首個(gè)TBAD 大動(dòng)物模型是1959年Blanton 等[21]通過(guò)外科手術(shù)創(chuàng)建的，后來(lái)很多研究對(duì)此進(jìn)行了優(yōu)化，但基本操作變化不大：選犬或豬，左側(cè)開(kāi)胸，截?cái)嘌?，環(huán)形切開(kāi)主動(dòng)脈外膜，在內(nèi)膜和外膜間用各種方法制造AD，切開(kāi)內(nèi)膜，縫合外膜。Fujii 等[22]在假腔產(chǎn)生后用手捏搓使其擴(kuò)大延展，并在切開(kāi)內(nèi)膜后，采用上全下外（裂口上方全層縫合，裂口下方僅縫合外膜和部分中膜）的縫合方式維持假腔通暢。結(jié)果顯示用此方法的3 頭豬都有較為可觀的成活率和假腔通暢率，他們的另一組實(shí)驗(yàn)還提示豬對(duì)戊巴比妥麻醉并不耐受。Terai 等[23]創(chuàng)建了首個(gè)有穩(wěn)定繼發(fā)破口的TBAD 大動(dòng)物模型：將夾層小范圍分離出來(lái)后，用生理鹽水延長(zhǎng)假腔，后用8 F 橡膠管固定假腔形狀，在距第一破口4 cm 處造第二破口，夾層范圍也止于此，縫合方式類似Fujii 等[22]。用此法建模，夾層范圍固定，兩年通暢率極高，但經(jīng)長(zhǎng)期觀察并無(wú)內(nèi)側(cè)變性和血栓發(fā)生。Cui 等[24]提出了一種新的內(nèi)膜固定方法：他們將內(nèi)膜瓣兩側(cè)分別折疊縫合在主動(dòng)脈側(cè)壁上，用這種內(nèi)膜雙角縫合的方式維持夾層破口的穩(wěn)定開(kāi)放，成功率91%。Tang 等[25]創(chuàng)建了兩種模型：不可控模型是在Cui 等[24]的基礎(chǔ)上再升高血壓，可控模則類似Terai 等[25]。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NE 用量若控制不當(dāng)會(huì)使假腔迅速擴(kuò)張導(dǎo)致動(dòng)物死亡率升高。之后Wang 等[26]在假腔延伸到膈以上時(shí)就用硝酸甘油阻斷其擴(kuò)張趨勢(shì)，增加了AD 的可控性。最近Guo 等[27]用10 頭上海長(zhǎng)白豬成功建模：鼻夾剝離中膜，上全下外縫合內(nèi)膜，再升高血壓，成功率100%。最長(zhǎng)存活時(shí)間2年，最長(zhǎng)波及范圍147.6 mm。通過(guò)該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大部分繼發(fā)破口位于分支動(dòng)脈開(kāi)口處，并在此處中止，而且內(nèi)膜瓣撕裂位置越靠近外膜，波及范圍越廣。

2.1.2 Stanford A 型動(dòng)脈夾層（type A aortic dissection，TAAD）大動(dòng)物模型由于病情兇險(xiǎn)，病死率高，關(guān)于TAAD 的慢性大動(dòng)物模型幾乎沒(méi)有。Papper 等[28]于1970年同時(shí)創(chuàng)建了TAAD 和TBAD 犬模型，基本步驟同上，不過(guò)分離中膜采用的是CO2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TAAD 組5 d 內(nèi)病死率高達(dá)87.5%，TBAD 組用相同方法卻造夾乏力，僅形成很有限的假腔，說(shuō)明創(chuàng)建TAAD 模型時(shí)并不能完全照搬TBAD 的建模方法，還需結(jié)合自身血流動(dòng)力學(xué)特征和組織學(xué)特性。Li 等[29]在升主動(dòng)脈起始遠(yuǎn)端2 cm 處切開(kāi)外膜，再用文氏鉗鈍性分離1 cm，用生理鹽水?dāng)U大假腔后用彈性蛋白酶灌注5 min，最后內(nèi)膜雙角縫合，升高血壓，發(fā)現(xiàn)AD最遠(yuǎn)可達(dá)腎動(dòng)脈開(kāi)口處，動(dòng)物產(chǎn)生全身炎癥反應(yīng)、多器官功能受損。Qin 等[30]后來(lái)也用類似方法制造了TAAD。

2.2 通過(guò)腔內(nèi)手術(shù)創(chuàng)建的動(dòng)物模型

2.2.1 TBAD 大動(dòng)物模型1998年Razavi 等[31]經(jīng)腔內(nèi)創(chuàng)建了首個(gè)TBAD 大動(dòng)物模型。他們通過(guò)頸總動(dòng)脈或股動(dòng)脈兩條入路分別順行或逆行制造夾層，由于方法類似，這里以頸總動(dòng)脈為例：肝穿針由9 F 血管鞘進(jìn)入，在距左鎖骨下動(dòng)脈開(kāi)口遠(yuǎn)端4 cm 處，將針尖刺入主動(dòng)脈壁后注射造影劑分離中膜，后將導(dǎo)絲引入假腔，彎曲成環(huán)，與造影劑一同將假腔延伸至腹主動(dòng)脈，最后用真腔內(nèi)的肝穿針刺破假腔內(nèi)的球囊產(chǎn)生繼發(fā)破口，再用球囊擴(kuò)張破口。該模型成功率約75%，6 只出現(xiàn)真腔狹窄，但無(wú)隨訪記錄。Eggebrecht 等[32]將此模型成功用于MRI 下支架植入術(shù)的測(cè)試。后來(lái)Okuno 等[33]改良了此法，他們將改良10 F 外導(dǎo)管（圖2）在腎動(dòng)脈下2 cm 處刺入動(dòng)脈壁，后用導(dǎo)絲和4 F 直導(dǎo)管從下往上逆行剝離中膜。該模型在器械上進(jìn)行了創(chuàng)新，成功率約78.6%。術(shù)中使用的改良導(dǎo)管可以更好的估計(jì)進(jìn)針深度。El Batti 等[34]則是通過(guò)Outback 導(dǎo)管重返真腔產(chǎn)生近端破口的，成功率82%，但此模型真腔壓力大于假腔，與臨床事實(shí)不符。

圖2 外導(dǎo)管操作示意圖（外導(dǎo)管尖端被削成適應(yīng)主動(dòng)脈壁的角度，刺破主動(dòng)脈內(nèi)膜，創(chuàng)建初始破口）Figure 2 Schematic representation of the operation of the outer catheter(the tip of the outer catheter cut in an angle adapted to the aortic wall,and puncturing the aortic intima to create an initial rupture)

2.2.2 TAAD 大動(dòng)物模型2018年Boufi 等[35]經(jīng)腔內(nèi)創(chuàng)建了TAAD 大動(dòng)物模型，自心尖插入8 F 改良鞘管，調(diào)整好角度，再用Outback 導(dǎo)管（A 組）或EchoTip Ultra 內(nèi)鏡超聲針（B 組）刺破主動(dòng)脈壁并向前推進(jìn)，隨后用造影劑和成環(huán)導(dǎo)絲一起順行延伸假腔，之后將導(dǎo)絲環(huán)縮至鋒利刺破內(nèi)膜瓣形成繼發(fā)破口并有球囊擴(kuò)張。結(jié)果顯示A 組產(chǎn)生的假腔范圍有限，平均長(zhǎng)度僅23 mm，無(wú)繼發(fā)破口，成功率66%。B 組假腔平均長(zhǎng)度110 mm，7 只產(chǎn)生繼發(fā)破口，成功率80%，此外B 組還能觀察到AD 長(zhǎng)度與繼發(fā)破口的位置有一定關(guān)系，這在以往的血流動(dòng)力學(xué)研究中也有說(shuō)明[36]，或許以后可以通過(guò)調(diào)整繼發(fā)破口位置來(lái)控制AD。從該實(shí)驗(yàn)可以看出經(jīng)心尖入路能更便捷的進(jìn)入升主動(dòng)脈，且實(shí)驗(yàn)中所用的超聲針可標(biāo)記入針深度，腔內(nèi)建模的技術(shù)難度正隨著新器材的出現(xiàn)而不斷下降。腔內(nèi)模型不破壞主動(dòng)脈正常結(jié)構(gòu)，更符合夾層病理特點(diǎn)，在術(shù)式和器械評(píng)估方面略勝于外科模型。最近就有研究用腔內(nèi)模型評(píng)估了一種新型開(kāi)窗剪的實(shí)用性[34]。

3 總結(jié)

小動(dòng)物目前已經(jīng)產(chǎn)生了成功率100%的化學(xué)誘導(dǎo)模型，而且還能通過(guò)對(duì)不同基因和化學(xué)誘導(dǎo)劑的靈活調(diào)節(jié)來(lái)研究各種分子機(jī)制。大動(dòng)物模型操作難度較高，可復(fù)制性不如小動(dòng)物模型。就手術(shù)治療來(lái)說(shuō)，TBAD具有更穩(wěn)定的大動(dòng)物模型，其腔內(nèi)發(fā)展也更迅速[2,37-39]。與此相比，雖然已經(jīng)誕生了首個(gè)FDA批準(zhǔn)的專用于TAAD的腔內(nèi)器材[40]，但目前較多TAAD新技術(shù)仍只能通過(guò)離體模型[41]、健康大動(dòng)物[42]進(jìn)行臨床前評(píng)估，得出的結(jié)果難免刻板。大動(dòng)物模型的局限在很大程度上制約了TAAD的手術(shù)進(jìn)步。目前外科手術(shù)仍然是TAAD的推薦術(shù)式[43]。TAAD的腔內(nèi)治療仍然存在瓶頸和困難，這都需要更加完善的動(dòng)物模型來(lái)進(jìn)行實(shí)踐。對(duì)這些臨床難題的模擬也會(huì)是未來(lái)大動(dòng)物模型的一個(gè)發(fā)展趨勢(shì)，或許可以嘗試用Ang II、BAPN或高脂飲食來(lái)輔助建模。