中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)與缺血-再灌注損傷關(guān)系的研究進(jìn)展

王華卿 張浩 沈東海 魏炳玉 王梓卉 許瑾瑾 鐘曉鳴

475000 開封，河南大學(xué)淮河醫(yī)院心內(nèi)科

中性粒細(xì)胞是人體含量最多的天然免疫細(xì)胞，起到重要的免疫防御作用。通常認(rèn)為中性粒細(xì)胞通過吞噬、釋放抗菌肽抵抗微生物入侵，近年來，研究者發(fā)現(xiàn)了一種新機(jī)制—中性粒細(xì)胞外誘捕網(wǎng)(neutrophils extracellular traps，NETs)[1]。2004年，有研究者初次發(fā)現(xiàn)NETs的存在，在體外用白細(xì)胞介素8(interleukin，IL-8)、佛波酯(phorbol-12-myristate-13-acetate，PMA)或脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激中性粒細(xì)胞后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞表面形成明顯突起，一段時(shí)間后在電鏡下觀察發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周圍存在一種網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[2]。NETs是中性粒細(xì)胞在活性氧(reactive oxygen species，ROS)、肽?；彼崦搧啺泵?(peptidylarginine deiminase 4，PAD4)、自噬等多種因素[3]的影響下釋放出的一種以DNA為基本骨架，附著以顆粒蛋白和組蛋白的高濃度絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。NETs的釋放過程稱為NETosis，這是一種區(qū)別于細(xì)胞壞死與細(xì)胞凋亡的過程，目前并不清楚NETosis的具體機(jī)制是什么，但通常認(rèn)為與細(xì)胞膜的破裂或囊泡的釋放有關(guān)[4]。

1 NETs產(chǎn)生、釋放及與凋亡、壞死的區(qū)別

高分辨率掃描電子顯微鏡顯示，NETs由DNA片段和蛋白質(zhì)組成。經(jīng)過染色后發(fā)現(xiàn)DNA是NETs的主要結(jié)構(gòu)成分，在使用脫氧核糖核酸酶(DNase Ⅰ)短暫處理后造成了NETs的崩解。相反，蛋白酶處理后NETs骨架較為完整，這表示DNA不受影響[2]。通過免疫熒光分析證實(shí)，NETs含有中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶、組織蛋白酶G、髓過氧化物酶、乳鐵蛋白和明膠酶等蛋白質(zhì)，但NETs中不存在常見的胞質(zhì)蛋白[2]。

NETosis包括細(xì)胞的去核化，染色質(zhì)的去濃縮、核膜以及顆粒膜的崩解[1]，并不一定造成細(xì)胞死亡[5-6]。NETosis可以由微生物和內(nèi)源性刺激引發(fā)，例如損傷相關(guān)模式分子和免疫復(fù)合物、膽固醇晶體、細(xì)菌、真菌、病毒等[7]。NETosis不同于細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死：發(fā)生NETosis時(shí)核膜分解后核內(nèi)容物與顆粒蛋白合并、染色質(zhì)去濃縮，細(xì)胞收縮將DNA和蛋白質(zhì)排出形成NETs，NETs在細(xì)胞外固定病原微生物，使其成為免疫細(xì)胞的靶點(diǎn)；細(xì)胞凋亡是程序化死亡，細(xì)胞收縮、染色質(zhì)凝聚、細(xì)胞核分段化、細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)空泡；壞死源于急性細(xì)胞損傷，細(xì)胞膨脹，失去分葉核核型直到細(xì)胞膜破裂并釋放內(nèi)容物到胞外。與凋亡不同的是，NETosis和壞死都導(dǎo)致組織炎癥的發(fā)生[1]。

NETs的釋放方式有兩種(圖1)，第一種是由金黃色葡萄球菌通過補(bǔ)體受體或Toll樣受體2(toll-like receptor 2，TLR2)，或通過大腸桿菌作用于TLR4或TLR4激活的血小板誘導(dǎo)。在幾分鐘內(nèi)發(fā)生NETosis，可獨(dú)立于細(xì)胞死亡而發(fā)生，包括核膜破裂排出染色質(zhì)，釋放顆粒蛋白。釋放NETs后留下活化的無核細(xì)胞質(zhì)，繼續(xù)發(fā)揮吞噬作用；第二種是PMA、抗體、膽固醇晶體誘發(fā)的NETosis，在刺激數(shù)小時(shí)后細(xì)胞膜破裂排出NETs，中性粒細(xì)胞死亡[7]。

圖1 NETs的兩種釋放方式

我們還發(fā)現(xiàn)，不同的研究者對(duì)NETs的釋放過程以及釋放出NETs后細(xì)胞死亡的定義有所不同，在相應(yīng)定義下涉及的細(xì)胞類型也有所區(qū)別。例如有研究者將NETs釋放后的死亡方式稱為NETotic細(xì)胞死亡[8]，但這種方式仍缺乏較為明確的表型[9]，本文仍使用NETosis對(duì)中性粒細(xì)胞胞外誘捕網(wǎng)的釋放過程進(jìn)行稱謂，認(rèn)為NETs釋放后的細(xì)胞死亡是NETosis發(fā)生后的一種結(jié)果。

2 調(diào)控NETs形成的關(guān)鍵因素

PAD4在NETs形成中也起到關(guān)鍵作用，其將組蛋白的精氨酸殘基瓜氨酸化形成瓜氨酸化的組蛋白(CitH3)，只有染色質(zhì)去濃縮才能形成NETs，而瓜氨酸化的組蛋白直接參與了這一過程。用PAD4敲除小鼠與野生型小鼠共同實(shí)驗(yàn)，給予相同的LPS與PMA處理后用蛋白印跡法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PAD4敲除小鼠體內(nèi)沒有CitH3，且沒有發(fā)現(xiàn)NETs的形成[10]。如果對(duì)PAD4敲除小鼠進(jìn)行處理，使其PAD4過表達(dá)后會(huì)發(fā)現(xiàn)小鼠在36 h內(nèi)出現(xiàn)高密度的CitH3、去濃縮的染色質(zhì)，之后形成了大量細(xì)胞外網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。此過程中未發(fā)現(xiàn)caspase-3的剪切，這也證明了PAD4過表達(dá)后引起的不是細(xì)胞凋亡而是NETosis[11]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+峰值對(duì)于在中性粒細(xì)胞激活時(shí)細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)是十分重要，并且PAD4由Ca2+激活[3]。

中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase，NE)與髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)也在調(diào)節(jié)NETs形成過程中起到了重要作用。中性粒細(xì)胞未受刺激時(shí)，NE和MPO儲(chǔ)存在胞質(zhì)的顆粒中。在活化和ROS產(chǎn)生后，NE從顆粒易位至細(xì)胞核并切割組蛋白以及促進(jìn)染色質(zhì)去濃縮。隨后MPO與染色質(zhì)結(jié)合促進(jìn)染色質(zhì)去濃縮。NE對(duì)于NETs形成是必不可少的，NE和MPO協(xié)同增強(qiáng)染色質(zhì)去濃縮，導(dǎo)致細(xì)胞膜破裂和NETs的釋放。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)NE基因敲除小鼠無法形成NETs[12]。

自噬參與NETs的釋放。mTOR(雷帕霉素靶蛋白)是在包括中性粒細(xì)胞在內(nèi)的許多哺乳動(dòng)物細(xì)胞中參與自噬的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。抑制mTOR活化可以驅(qū)動(dòng)自噬發(fā)生，誘導(dǎo)組蛋白瓜氨酸化與NETs的釋放[13]。在使用針對(duì)自噬的抑制劑渥曼青霉素時(shí)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞不再出現(xiàn)空泡化、染色質(zhì)也無法去濃縮，導(dǎo)致了NETosis的減少與細(xì)胞凋亡的增加[14]。

3 NETs與I/R損傷

大量研究表明NETs加劇I/R損傷。動(dòng)脈搭橋術(shù)、溶栓療法、經(jīng)皮腔內(nèi)冠脈血管成形術(shù)、心臟外科體外循環(huán)、心肺腦復(fù)蘇，斷肢再植和器官移植等方法的建立和推廣應(yīng)用，使許多組織器官缺血后重新得到血液再灌注。其目的在于恢復(fù)組織器官功能并起到修復(fù)作用，但同時(shí)也導(dǎo)致了I/R損傷。其發(fā)生機(jī)制尚未闡明，但認(rèn)為線粒體損傷、自由基生成增多、鈣超載、炎癥反應(yīng)過度激活可能是主要原因。

3.1 心臟I/R損傷

目前，臨床上主張?jiān)缙谶M(jìn)行再灌注作為急性心肌梗死的主要治療方式之一。溶栓治療和經(jīng)皮腔內(nèi)冠狀動(dòng)脈介入治療都旨在降低心肌損傷的程度。然而，大量的實(shí)驗(yàn)和臨床證據(jù)表明，再灌注可以通過阻塞的冠狀動(dòng)脈恢復(fù)血流，但加劇了心肌損傷程度[15]。心肌I/R存在多種病理生理學(xué)現(xiàn)象，包括心律失常、心肌頓抑、無復(fù)流現(xiàn)象、炎癥等[16]。影響其發(fā)生的關(guān)鍵因素有氧化應(yīng)激、鈣超載、pH的快速恢復(fù)、線粒體膜電位的破壞等[17]。在受到I/R損傷的心肌中發(fā)現(xiàn)了NETs的存在[18]。心肌I/R損傷導(dǎo)致細(xì)胞因子增加、自噬激活和ROS的生成，對(duì)NETosis的發(fā)生十分關(guān)鍵。在心肌缺氧部位的血液循環(huán)中，NETs的形成不僅為血栓形成提供了支架，而且會(huì)加重內(nèi)皮細(xì)胞的損傷，這兩者都是造成冠狀動(dòng)脈無復(fù)流的重要原因。在使用rt-PA的基礎(chǔ)上加入DNase Ⅰ處理后發(fā)現(xiàn)心梗面積下降，M型超聲心動(dòng)圖顯示心臟功能改善且比單一使用纖溶酶原激活劑(recombinant tissue plasminogen activator，rt-PA)或DNase Ⅰ效果顯著[19]。這證明了NETs在心肌I/R中發(fā)揮了加劇損傷的作用。rt-PA和DNase Ⅰ聯(lián)合治療主要針對(duì)I/R中NETs引起的無復(fù)流現(xiàn)象。

3.2 腦I/R損傷

在研究缺血性中風(fēng)的實(shí)驗(yàn)中建立了大鼠永久大腦中動(dòng)脈堵塞再灌注模型(middle cerebral artery occlusion/reperfusion，MACO/R)的模型，中性粒細(xì)胞在受傷后很快滲入受損的腦組織并加重炎癥，隨后在不同的時(shí)間點(diǎn)于軟腦膜、紋狀體、腦實(shí)質(zhì)中發(fā)現(xiàn)了CitH3，證明了NETs的存在。一種損傷相關(guān)模式分子(DAMP)—HMGB1，在MACO/R模型中大量積累在血清中，促進(jìn)了CitH3的形成。全巰基和二硫化物類型的HMGB1分別通過其特異性受體CXCR4和TLR4誘導(dǎo)CitH3。重要的是，HMGB1不僅誘導(dǎo)了NETosis，而且作為NETs的一部分被排出細(xì)胞外，有助于NETosis介導(dǎo)的神經(jīng)元死亡。在神經(jīng)細(xì)胞死亡和NETosis之間存在惡性循環(huán)[20]。腦缺血后處理(ischemic post-conditioning，IPOC)已被證明對(duì)腦I/R損傷具有神經(jīng)保護(hù)作用。IPOC可以抑制自噬與HMGB1釋放。自噬[21]與HMGB1[22]均已被證實(shí)在腦I/R損傷中發(fā)揮了作用；自噬[3]與HMGB1[20]也在NETs形成中發(fā)揮了作用，因此我們考慮自噬與HMGB1可能是通過NETs的形成加劇了腦I/R損傷。

3.3 肝I/R損傷

在肝臟I/R損傷模型中，重組HMGB1蛋白處理后通過TLR4/9增加CitH3表達(dá)和NETs的形成參與了I/R損傷[20]。聚環(huán)氧乙烷(DRP)是一種用于減少血管內(nèi)阻力的無毒聚合物，在小鼠肝臟缺血-再灌注損傷后發(fā)現(xiàn)高水平CitH3，用DRP處理后其含量下降，而且與對(duì)照相比，在DRP處理的肝臟I/R的小鼠中，MPO-DNA復(fù)合物在血清中的含量降低。DRP也會(huì)減少肝臟中血小板聚集和微血栓形成，可能是通過作用于NETs來實(shí)現(xiàn)的，這也證明了NETs可能通過嵌頓血管的無復(fù)流現(xiàn)象造成缺血-再灌注損傷。

3.4 腸I/R損傷

當(dāng)大鼠發(fā)生腸I/R損傷時(shí)，大量中性粒細(xì)胞就會(huì)滲入腸道組織，然后發(fā)生NETosis導(dǎo)致游離DNA(cfDNA)大量釋放到血液中。在缺血1 h和再灌注2 h后，大鼠血清和回腸組織中很容易檢測(cè)到細(xì)胞外DNA。這與先前的諸多研究結(jié)果相吻合，認(rèn)為這證明了NETs的存在。NETs可以破壞腸上皮細(xì)胞而導(dǎo)致炎癥反應(yīng)，加劇了腸道損傷，腸道I/R損傷后細(xì)胞緊密連接和細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的功能完整性被破壞。因此認(rèn)為NETs參與了I/R損傷后的腸道炎癥的發(fā)生[23]。

3.5 腎I/R損傷

PAD4在I/R誘導(dǎo)的急性腎損傷中起關(guān)鍵作用。在小鼠腎I/R之前，用DNase Ⅰ處理可以抑制NETs形成并且部分保護(hù)小鼠免受I/R誘導(dǎo)的腎損傷。PAD4特異性抑制劑YW3-56有效抑制I/R誘導(dǎo)的小鼠腎損傷。在PAD4缺陷小鼠中，來自野生型小鼠的中性粒細(xì)胞的轉(zhuǎn)移足以促進(jìn)腎臟中的NETs形成和I/R后腎功能的降低。相比之下，在接受來自PAD4缺陷小鼠的嗜中性粒細(xì)胞的PAD4敲除小鼠腎臟中未顯示出可檢測(cè)的NETs，并且受到I/R誘導(dǎo)的腎損傷的保護(hù)。通過該實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NETs的有無和腎功能的降低與否是同步的[24]。

3.6 肢體I/R損傷

TLR已被證明在介導(dǎo)靜脈血栓形成和心臟和大腦的I/R損傷中發(fā)揮了關(guān)鍵作用，且TLR在NETs形成中發(fā)揮了重要作用[7]。TLR4突變小鼠后肢I(xiàn)/R損傷的減輕也與NETs的減少有關(guān)。通過野生型(WT)小鼠與TLR4突變(TLR4m)小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，將小鼠后肢進(jìn)行I/R，發(fā)現(xiàn)WT組的肌纖維損傷顯著大于TLR4m組，WT組的MPO陽性細(xì)胞顯著多于TLR4m組，顯現(xiàn)出MPO標(biāo)記陽性的細(xì)胞即中性粒細(xì)胞密度增加的區(qū)域也顯示NETs含量的增高。NETs主要存在于間質(zhì)組織，血管周圍和微血管血栓中。經(jīng)免疫熒光顯示在TLR4m 組中NETs的量較低，并且在對(duì)照對(duì)側(cè)后肢組織切片中檢測(cè)不到NETs的存在，而在DNase Ⅰ處理后對(duì)WT組織切片進(jìn)行NETs染色后發(fā)現(xiàn)免疫熒光顯示間質(zhì)中NETs顯著減少[25]。

NETs在器官I/R損傷中起到了負(fù)面的作用，表現(xiàn)為降低器官功能、引起炎癥、與內(nèi)皮細(xì)胞作用并造成損傷、導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞死亡、嵌頓微血管等。

4 結(jié)論

中性粒細(xì)胞在I/R損傷中起到關(guān)鍵作用，NETs由中性粒細(xì)胞釋放，且NETosis與I/R損傷的機(jī)制存在交集，例如通過NADPH產(chǎn)生ROS、Ca2+超載與對(duì)PAD4的激活、TLR家族的TLR4在炎癥反應(yīng)與NETs形成中均發(fā)揮作用，因此NETs參與并影響了組織器官的I/R損傷。現(xiàn)在，尚不明確NETs是通過何種機(jī)制參與并影響I/R損傷，我們猜測(cè)可能是NETs作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞造成水腫以及細(xì)胞間隙增大并在損傷部位聚集造成了微血管嵌頓、損傷黏膜上皮細(xì)胞及細(xì)胞聯(lián)接加劇炎癥、NETs上附著的顆粒蛋白具有細(xì)胞毒性造成組織細(xì)胞損傷并延緩組織修復(fù)、刺激巨噬細(xì)胞與樹突狀細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子造成炎癥反應(yīng)過度激活等，以此為研究方向可能會(huì)有所進(jìn)展。通過減弱I/R損傷后的氧化應(yīng)激、抑制PAD4的活性、防止Ca2+濃度劇烈變化、抑制TLR4參與的信號(hào)通路活性、減弱NETs上的顆粒蛋白毒性可能會(huì)緩解NETs造成的損傷[26-27]。將NETs作為治療的靶點(diǎn)或采用針對(duì)NETs的治療方案可以減緩I/R損傷，這對(duì)疾病治療具有重要意義。

利益沖突：無