熊娟,黃啟紅,陳敏兒,方軍
(廣東省科學(xué)院,廣東省測(cè)試分析研究所(中國(guó)廣州分析測(cè)試中心),廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測(cè)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,廣東省保健食品功效成分檢測(cè)與風(fēng)險(xiǎn)物質(zhì)快速篩查工程技術(shù)研究中心,廣東 廣州 510070)
廣東省素被譽(yù)為養(yǎng)生大省,而魚翅作為廣東著名的養(yǎng)生保健佳品,一直深受人民的喜愛(ài),價(jià)格一度水漲船高。市場(chǎng)流通多為加工后的干魚翅制品,但鯊魚種類繁多,相似物種之間外觀形態(tài)差異小,傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)鑒定難以保證干魚翅制品標(biāo)識(shí)的準(zhǔn)確性[1-3],不良商家以次充好,更有不法生產(chǎn)者從瀕危鯊魚上采集魚翅。本文建立的魚翅DNA 條形碼技術(shù)能更好地規(guī)范廣東省魚翅市場(chǎng)標(biāo)識(shí)亂象,進(jìn)一步保護(hù)瀕危鯊魚[4]。
DNA 條形碼技術(shù)是利用生物體線粒體DNA 中一段保守片段對(duì)物種進(jìn)行快速而準(zhǔn)確的分子生物學(xué)鑒定[5,6]。2005 年,國(guó)際已開始合作實(shí)施魚類生命條形碼計(jì)劃(FISH-BOL),該計(jì)劃以電子數(shù)據(jù)庫(kù)形式構(gòu)建含有DNA 條形碼圖像和地理坐標(biāo)的全球魚類參考標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫(kù)[7,8]。Ward 等[7]利用條形碼方法分析了澳大利亞超過(guò)200 種海洋魚類和印度洋沿岸35 種魚類,表明南非與澳洲海域的魚類之間存在較大差異,地域群系之間種內(nèi)差異性顯著。N-J 進(jìn)化樹分析結(jié)論表明,能夠使用線粒體細(xì)胞色素氧化酶亞基I(Cytochrome Oxidase subunit I,COI)作為海洋魚類的DNA 條形碼標(biāo)準(zhǔn)序列[9]。
本研究中,魚翅制品屬致密結(jié)締組織,含有豐富的硫酸多糖,去除多糖一直是DNA 提取面臨的主要難題。傳統(tǒng)提取方法獲得的DNA 純度低,往往造成后續(xù)分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)失敗,所以高效的提取魚翅DNA 是整個(gè)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行的前提。本研究比較了傳統(tǒng)DNA 提取法和不同DNA 試劑盒提取法,以獲取適合干魚翅制品的方法,保證后續(xù)實(shí)驗(yàn)順利進(jìn)行。提取后的干魚翅制品DNA 經(jīng)過(guò)擴(kuò)增、測(cè)序、進(jìn)化分析,以證明該DNA 條形碼方法對(duì)廣東省干魚翅制品鑒定的適用性。
本研究所用魚翅均由廣州市海味干果行業(yè)商會(huì)提供,其中用于DNA 提取效果研究的6 種魚翅為市面上常見(jiàn)的正品魚翅,并從形態(tài)學(xué)上進(jìn)行物種鑒定,確保品質(zhì)正宗,物種明確,包括:20 沙青片(低鰭真鯊Carcharhinus leucas)、蝶勾(尖齒檸檬鯊Negaprion acutidens)、牙勾(大青鯊Prionace glauca)、8寸五羊勾(絲鯊Carcharhinus falciformis)、10 上勿骨勾(淺海長(zhǎng)尾鯊Alopias pelagicus)和白蟬片(尖吻斜鋸牙鯊Rhizoprionodon acutus)。鑒定后的魚翅作為標(biāo)準(zhǔn)樣品,用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。用于魚翅DNA 條形碼研究的35 種魚翅來(lái)源于廣東省市場(chǎng)流通魚翅,其中2 種是以明膠為主要原料制作的假魚翅,為陰性對(duì)照。
利用經(jīng)典CTAB 法、廣州雙螺旋生物科技有限公司生產(chǎn)的動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒和QIAGEN 公司生產(chǎn)的DNeasy mericon Food Kit 試劑盒提取正品魚翅DNA,采用廣州維伯鑫生物科技有限公司生產(chǎn)的魚源性(fish)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR 法)檢測(cè)DNA 提取效果。
魚翅COI 通用引物參考Ward 等[9]篩選出的DNA 條形碼通用引物,對(duì)提取的樣品魚翅DNA 進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,目的片段為COI 基因靠近5’末端,長(zhǎng)度為680 bp 左右的序列,引物序列為:5’-TCAACCAACCACAAAGACATTGGCAC-3’,5’-TAGACTTC TGGGTGGCCAAAGAATCA-3’。擴(kuò)增產(chǎn)物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)定后序列在BOLD(http://www.Boldsys tems.org)以及NCBI(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov)網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行鑒定以及相似度分析,并采用Mega 6.06 構(gòu)建相應(yīng)COI 序列的N-J 進(jìn)化樹、DNAMan 構(gòu)建相應(yīng)COI 序列的聚類同源樹。
高速臺(tái)式離心機(jī),5418R,德國(guó)Eppendorf;基因擴(kuò)增儀,L96G,杭州朗基;熒光定量PCR 儀,7500,Applied Biosystems;微量移液器,1 000 μL、200 μL、100 μL、10 μL,德國(guó)Eppendorf;生物安全柜,BSC-100011B2,蘇凈安泰;凝膠成像系統(tǒng),WD-9413B,北京六一。
1.3.1 實(shí)驗(yàn)材料預(yù)處理
用滅菌二次水充分清潔干魚翅樣品表面,并用95%的酒精輕柔擦拭魚翅表面,清除魚翅表面的雜質(zhì)與灰塵,在烘箱內(nèi)烘干;用滅菌手術(shù)剪刀剪下約50 g 魚翅樣品,盡量剪碎放入研磨機(jī)中,20 000 r/min 研磨20 min,觀察樣品粉碎情況。
1.3.2 DNA 提取
經(jīng)典CTAB 法參照《參考分子克隆》[10]動(dòng)物DNA 提取方法,動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒和DNeasy mericon Food Kit 均參照商品說(shuō)明書。
用魚源性(fish)核酸檢測(cè)試劑盒分析提取DNA的純度。25 μL 的反應(yīng)體系,其成分包括:20 μL 的fish 反應(yīng)液,酶液1 μL,樣品DNA,陰性質(zhì)控和陽(yáng)性質(zhì)控各4 μL。設(shè)置反應(yīng)程序?yàn)椋篐olding Stage 95 ℃10 min,1 個(gè)循環(huán);Cycling Stage 為95℃15 s,55 ℃1 min,40 個(gè)循環(huán),并收集熒光信號(hào)。
1.3.3 DNA 條形碼PCR 反應(yīng)體系
以提取的DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。25.0 μL PCR 反應(yīng)體系如下:10x PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP Mixture 2.0 μL、10 μmol/L 上下游引物各0.5 μL、Taq DNA 聚合酶0.5 μL、模板用量根據(jù)PCR 擴(kuò)增情況而變化,加水補(bǔ)至25 μL。
PCR 反應(yīng)條件為:94 ℃預(yù)變性5 min;94 ℃30 s,55 ℃30 s,72 ℃45 s,35 個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。
1.3.4 DNA 條形碼PCR 產(chǎn)物分析
用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)獲得的樣品DNA 條形碼PCR 產(chǎn)物,將在680 bp 位置有條帶的PCR 產(chǎn)物送至上海生工公司進(jìn)行測(cè)序和序列拼接,獲取680 bp 左右的COI 序列。
搜索BOLD 以及NCBI 網(wǎng)站的數(shù)據(jù)庫(kù),鑒定樣品的COI 序列,比對(duì)分析相似度,根據(jù)比對(duì)結(jié)果,自NCBI 中下載相關(guān)鯊類物種COI 序列。將整理后的樣品DNA 序列和GenBank 下載的相關(guān)序列應(yīng)用MEGA 6.0 軟件進(jìn)行多序列比對(duì),基于鄰接法(N-J)構(gòu)建進(jìn)化樹,選用K2P 替代模型,Bootstrap 自展檢測(cè)1000 次。同時(shí)應(yīng)用DNAMan 構(gòu)建相應(yīng)COI 序列的聚類同源樹。
根據(jù)魚源性(fish)核酸檢測(cè)試劑盒(熒光-PCR法)說(shuō)明書,擴(kuò)增閾值(CT)≤40 判定為檢出魚源性,表示提取魚翅DNA 成功;CT>40 判定為未檢出魚源性,表示提取魚魚翅DNA 失敗。同一擴(kuò)增條件下,CT 值越小,表示初始擴(kuò)增模板濃度越高;CT 值越大,表示初始擴(kuò)增模板濃度越低。結(jié)果顯示,經(jīng)典CTAB 法提取成功3 個(gè)樣品,動(dòng)物組織基因組DNA提取試劑盒提取成功5 個(gè)樣品,DNeasy mericon Food Kit 試劑盒提取成功6 個(gè)樣品(表1)。樣品3 采用經(jīng)典CTAB 法提取DNA 的CT 值小于動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒提取DNA 的CT 值;而采用DNeasy mericon Food Kit 提取DNA 的所有樣品CT 值均小于采用經(jīng)典CTAB 法和動(dòng)物組織基因組DNA 提取試劑盒提取的DNACT 值,說(shuō)明DNeasy mericon Food Kit 提取的DNA 濃度明顯高于另外兩種方法提取的DNA 濃度。
根據(jù)研究結(jié)果,采用DNeasy mericon Food Kit的方法提取DNA。通過(guò)PCR 擴(kuò)增和測(cè)序,有5 個(gè)干魚翅樣品(sample11、sample28、sample31、sample34和sample35)無(wú)法擴(kuò)增成功,其中sample34 和sample 35 為明膠制品,所以無(wú)法擴(kuò)增出目的片段。而sample11、sample28 和sample31 用魚源性(fish)核酸檢測(cè)試劑盒檢測(cè)閾值均>40,可能原因是在干魚翅的加工過(guò)程中DNA 嚴(yán)重降解,無(wú)法提取足量的DNA 進(jìn)行后續(xù)研究。
本研究獲得了30 個(gè)魚翅個(gè)體的線粒體COI 基因序列。該序列是位于COI 基因5’端一段約為680 bp 的片段。將獲得的COI 序列進(jìn)行數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)及聚類分析鑒定,鑒定結(jié)果如表2 所示。30 個(gè)魚翅分別來(lái)源于13 種鯊魚物種:低鰭真鯊Carcharhinus leucas、大青鯊Prionace glauca、尖吻鯖鯊Isurus oxyrinchus、尖吻斜鋸牙鯊Rhizoprionodon acutus、路氏雙髻鯊Sphyrna lewini、Glaucostegus cemiculus(犁頭鰩科)、絲鯊Carcharhinus falciformis、無(wú)溝雙髻鯊Sphyrna mokarran、尖齒檸檬鯊Negaprion acutidens、舒氏星鯊Mustelus schmitti、高鰭真鯊Carcharhinus amboinensis、淺海長(zhǎng)尾鯊Alopias pelagicus、沙拉真鯊Carcharhinus sorrah。從樣品來(lái)源分析得出:6 個(gè)樣品來(lái)源于大青鯊,5 個(gè)樣品來(lái)源于絲鯊,4 個(gè)樣品來(lái)源于尖吻斜鋸牙鯊,4 個(gè)樣品來(lái)源于路氏雙髻鯊,其他樣品的來(lái)源比較零星分散,說(shuō)明市面上的魚翅多采用大青鯊、絲鯊、尖吻斜鋸牙鯊和路氏雙髻鯊加工而成,偶有其他種類的加工制品;從分類階元分析得出:4 種來(lái)源于真鯊屬,7 種來(lái)源于真鯊科,10 種來(lái)源于真鯊目,說(shuō)明真鯊目的魚類適合于加工魚翅制品,其中又以真鯊科真鯊屬的魚類采用的最多。這13 種鯊魚物種基本涵蓋市面上常見(jiàn)的魚翅物種,從NCBI 中下載這13 種鯊魚物種相似度達(dá)97%的基因序列共32 條,另外下載市面常見(jiàn)魚翅物種Isurus paucus(長(zhǎng)鰭鯖鯊,鯖鯊屬、鯖鯊科、鯖鯊目)基因序列2 條,共計(jì)64 尾鯊魚基因作為日常實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)的基因庫(kù)。
表1 不同方法獲得的DNA 濃度比較結(jié)果Tab.1 The comparison of DNA concentration obtained by different methods
構(gòu)建64 尾鯊魚基因的分子系統(tǒng)發(fā)育樹顯示(圖1),同一個(gè)物種的不同個(gè)體基本都能形成單系,節(jié)點(diǎn)支持率大都為99%~100%,但同科聚類效果不是很明顯。如真鯊目中,真鯊科的7 種物種和雙髻鯊科的2 種物種節(jié)點(diǎn)支持率僅為78%。而不同目間的遺傳距離明顯更大,這與傳統(tǒng)的鯊魚分類學(xué)結(jié)果一致,證明了鯊魚線粒體COI 基因種內(nèi)具有高度的保守性,種間具有明顯的差異性。
同時(shí)進(jìn)行的64 尾鯊魚基因聚類分析顯示(圖2),同一物種都位于同一分支,且不同個(gè)體的魚類的COI 序列相似度均大于95%,說(shuō)明DNA 條形碼技術(shù)鑒別魚類較為準(zhǔn)確,不隨個(gè)體有較大的變化;不同魚類物種相似度各不相同,其中真鯊科和雙髻鯊科的屬間相似度均為89%,而真鯊目三個(gè)屬間的相似度為87%,分類階元越高,相似度逐漸下降,最低相似度為76%。構(gòu)建的同源樹不僅能反應(yīng)不同魚類的親緣關(guān)系,還能直接看出不同魚類COI 序列的相似度,表明親緣關(guān)系較近的物種,特別是聚類到一個(gè)種類的物種可以通過(guò)DNA 條形碼技術(shù)進(jìn)行鑒別。
本文采用經(jīng)典CTAB 法和試劑盒提取不同魚翅制品的DNA。一般采用微量核酸蛋白測(cè)定儀定量分析DNA 來(lái)檢測(cè)DNA 的純度,但并不能完全反映DNA 中的雜質(zhì),需要采用凝膠電泳進(jìn)一步確認(rèn),過(guò)程相對(duì)繁瑣,準(zhǔn)確度較低。本文通過(guò)魚源性(fish)核酸檢測(cè)試劑盒測(cè)定提取DNA 的閾值,分析出提取DNA 的濃度,直接分析目的基因的濃度,排除其他因素的干擾[11,12]。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:DNeasymericon Food Kit 提取的DNA 含量明顯高于另外兩種方法提取的DNA 含量,更適合作為本實(shí)驗(yàn)中魚翅的提取方法。
近年DNA 條形碼技術(shù)在海洋魚類的鑒定上也取得了較好的鑒定效果,但鑒定對(duì)象多為新鮮或是冰凍魚類。這些魚類大多細(xì)胞組織保存完好,而針對(duì)市售魚翅的DNA 條形碼鑒定鮮有報(bào)道[13-18]。廣東省做為魚翅制品銷售流通的大省,對(duì)魚翅標(biāo)識(shí)需要更完善和更精確的鑒別技術(shù)。本研究在35 種市場(chǎng)流通魚翅中,獲得了30 個(gè)魚翅個(gè)體的線粒體COI基因序列,在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中不可避免出現(xiàn)擴(kuò)增失敗的情況,原因可能是DNA 在魚翅制品加工過(guò)程中發(fā)生了降解[19]。通過(guò)NCBI 比對(duì),選取基因序列相似度達(dá)到90%以上的物種作為同源物種。統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示,30 個(gè)魚翅分別來(lái)源于13 種鯊魚物種。
表2 不同魚翅在NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)的鑒定結(jié)果Tab.2 Identification results of different sharks in the NCBI database
圖1 64 尾魚翅的COI 序列N-J 進(jìn)化樹Fig.1 Neighbor Joining tree based on COI sequences of sixty-four sharks
圖2 64 尾魚翅的COI 序列的聚類同源樹Fig.2 Homology tree based on COI sequences of sixtyfour sharks
對(duì)于物種序列同源性較高的COI 序列,DNA 條形碼技術(shù)推薦采用基于遺傳距離的Neighbor Joining法構(gòu)建進(jìn)化樹[20,21]。這種方法處理較多的COI 序列時(shí),速度較快并能反映出物種間的親緣關(guān)系。本研究獲取的序列同源性比較高,大多為真鯊目和鯖鯊目物種,僅有一例為犁頭鰩科鰩形目。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)采用的聚類同源樹分析顯示:同種魚翅樣品的序列因分類親和性而與相關(guān)參考序列聚在一起,形成一個(gè)聚類關(guān)系,以此可根據(jù)NCBI 中參考序列的物種信息確定樣品所屬分類。由此可以得出結(jié)論:本實(shí)驗(yàn)建立的DNA 條形碼方法適用于魚翅制品的鑒定研究,且大多可以鑒定到種的水平。