人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞對自然衰老大鼠海馬自噬水平的影響

張茹鑫，李承罡，杜若琛，原一桐，李宵，趙碧春，張玉娟，王春芳?

(1.山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，太原 030001；2.山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院，太原 030001)

隨著全球人口老齡化的進(jìn)程日益加快，衰老已經(jīng)成為國內(nèi)外神經(jīng)科學(xué)與衰老生物學(xué)研究的熱點(diǎn)問題，而腦是受衰老影響最大的器官之一，腦的衰老會(huì)引起大腦內(nèi)微環(huán)境的改變，主要表現(xiàn)為樹突棘密度的降低、樹突數(shù)量的減少以及突出后模致密物的變薄，這些被認(rèn)為是衰老時(shí)記憶力減退、認(rèn)知功能衰退的原因。研究顯示，在自然衰老的機(jī)體中，ATG蛋白或自噬誘導(dǎo)所需要的其他蛋白如Sirtuin1表達(dá)下調(diào)[1-2]。有研究顯示，通過對釀酒酵母菌中年齡老化因子的無偏篩選，發(fā)現(xiàn)了多個(gè)具有自噬缺陷的短壽突變體(包括117個(gè)短壽突變體中的10個(gè)ATG突變)[3]。在阿爾茲海默癥(Alzheimer’s disease，AD)和亨廷頓病中，自噬有神經(jīng)保護(hù)的作用[1]。在正常人類衰老大腦中，自噬相關(guān)基因5(autophagy-related5，Atg5)，自噬相關(guān)基因 7(autophagy-related7，Atg7)和 Beclin 1表達(dá)下調(diào)，與年齡相關(guān)的骨關(guān)節(jié)炎中UNC-51樣激酶1(UNC-51-like kinase 1，ULK1)、Beclin1和微管相關(guān)蛋白1輕鏈3 II/I(microtubule-associated protein1 light chain 3 II/I，LC3II/I)表達(dá)也下調(diào)[4-5]。這些發(fā)現(xiàn)表明，自噬的減弱可能是造成衰老表型的一種原因，因此提高自噬是抗衰老的有效手段。

人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)自發(fā)現(xiàn)以來，就因其具有高度的自我更新和多向分化潛能而備受關(guān)注，已經(jīng)被用于多種疾病的基礎(chǔ)研究和臨床試驗(yàn)研究。文獻(xiàn)報(bào)道，hUCMSCs通過改善突觸可塑性和內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生恢復(fù)了老年小鼠海馬依賴性學(xué)習(xí)記憶能力[6]。有研究顯示hUCMSCs-exo可以誘導(dǎo)自噬并且穿過血腦屏障到達(dá)灰質(zhì)，減輕帕金森(Parkinson’s disease，PD)大鼠模型的不對稱旋轉(zhuǎn)缺陷[7]。在膀胱腫瘤中通過AKT/mTOR信號(hào)通路，使Atg5、Atg7和Beclin1上調(diào)并使磷酸化蛋白激酶B(p-Akt)、磷酸化哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(pmTOR)下調(diào)增強(qiáng)膀胱腫瘤自噬性[8]。在器官退行性病變中，移植人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞后使各臟器中自噬相關(guān)蛋白 Beclin1、LC3II/I高表達(dá)，證明hUCMSCs通過調(diào)節(jié)自噬提高機(jī)體抗氧化應(yīng)激的能力來延緩衰老[9]。但hUCMSCs對于衰老進(jìn)程中引起的腦部自噬水平紊亂是否有調(diào)節(jié)作用，以及是否可以通過移植來調(diào)控自噬的發(fā)生改善認(rèn)知功能方面的報(bào)道較少。因此，本研究目的是評(píng)估靜脈注射hUCMSCs對自然衰老引起的認(rèn)知障礙的作用及調(diào)節(jié)腦部海馬區(qū)自噬水平的潛力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

50只24月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重約為800 g；15只3月齡清潔級(jí)雄性SD大鼠，體重約為300 g。購于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心【SCXK(晉)2019-0005】，飼養(yǎng)于山西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心屏障環(huán)境中【SYXK(晉)2019-0007】。飼養(yǎng)環(huán)境：晝夜各半循環(huán)照明，濕度恒定，溫度控制在22～25℃。所有操作均符合實(shí)驗(yàn)大鼠的飼養(yǎng)過程和其他實(shí)驗(yàn)操作均符合實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理學(xué)要求(審批號(hào)：SYDL2020004)以及中華人民共和國《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理?xiàng)l例》。

1.1.2 主要試劑與儀器

Anti-LC3II/I Rabbit pAb (Wanleibio，WL01506)， Anti-P62 RabbitpAb(Wanleibio，WL02385)， Anti-Beclin1 Rabbit pAb(Wanleibio，WL02508)，Anti- β-actin Rabbit pAb(Wanleibio，WL01372)，HRP Conjugated AffiniPure Goat Antirabbit/mouse IgG(BOSTER，BA1054)，PageRulerTMPrestained Protein Ladder(Thermo ScientificTM，26616)，Beyo ECL Star(Beyotime，P0018AFT)，HE染色試劑盒(Solarbio，G1120)，通用型組織固定液(Servicebio，G1101)。

Morris水迷宮和動(dòng)物運(yùn)動(dòng)軌跡跟蹤系統(tǒng)(Noldus，荷蘭)，Y迷宮實(shí)驗(yàn)箱(自制)，新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)箱(自制)，細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heal Force，HF240，中國)，石蠟切片機(jī)(Leica RM 2245，德國)，熒光顯微鏡(OLYMPUS，日本)，電泳儀(Bio-Rad，美國)，轉(zhuǎn)膜儀(Bio-Rad，美國)，高靈敏度化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-Rad，美國)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組及實(shí)驗(yàn)干預(yù)

經(jīng)過行為學(xué)篩選出現(xiàn)學(xué)習(xí)認(rèn)知衰退的24月齡大鼠30只，再將其隨機(jī)分為：細(xì)胞移植組(H組)(15只)，生理鹽水組(C組)(15只)。3月齡大鼠分為：正常年輕組(N組)(15只)。H組：尾靜脈注射hUCMSCs細(xì)胞混懸液500 μL，劑量為每只2×106個(gè)。C組和N組分別尾靜脈注射NaCl，連續(xù)4次。細(xì)胞移植組所有大鼠均無脫失，注射細(xì)胞后無免疫排斥反應(yīng)和急性毒性反應(yīng)，注射后1個(gè)月時(shí)間內(nèi)所有SD大鼠也均無其他異?，F(xiàn)象。

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)

臍帶組織來源于山西省兒童醫(yī)院，經(jīng)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)并經(jīng)過產(chǎn)婦及家屬知情同意。細(xì)胞培養(yǎng)方法參照[10]，將第3～4代細(xì)胞用0.25%胰酶/EDTA消化后，再用0.9%的生理鹽水漂洗，重懸細(xì)胞并調(diào)整密度為每毫升4×106個(gè)。

1.2.3 新物體識(shí)別

細(xì)胞注射結(jié)束1周后，開始新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)方法參照[11]新物體識(shí)別概率視為新物體探索次數(shù)/總探索次數(shù) ×100%表示[12]，新物體辨別系數(shù)視為(新物體探索時(shí)間 -舊物體探索時(shí)間)/(新物體探索時(shí)間 +舊物體探索時(shí)間)表示[13]。數(shù)據(jù)采集處理由ANY-Maze軟件(Stoeling，美國)完成。

1.2.4 Y迷宮

新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)結(jié)束1 d后，開始Y迷宮實(shí)驗(yàn)。自發(fā)交替行為測試：用于測試大鼠短期工作記憶能力。實(shí)驗(yàn)開始時(shí)，將大鼠放入Y迷宮任意臂末端，任其自由探究8 min，攝像系統(tǒng)記錄動(dòng)物的活動(dòng)，記錄分析大鼠的進(jìn)入各臂的順序和總次數(shù)，并計(jì)算交替正確率。交替正確率＝進(jìn)臂正確的次數(shù)/(進(jìn)臂總次數(shù)-2)×100%[14]。

新異臂探索實(shí)驗(yàn)：用于檢測大鼠的空間探索能力，分為兩部分：訓(xùn)練期，用擋板將新異臂隔開，將大鼠放入剩余某臂中，并使其自由活動(dòng)10 min，24 h后進(jìn)行測試部分。測試期，取出擋板，將大鼠隨機(jī)放入一臂中，使其在實(shí)驗(yàn)箱內(nèi)活動(dòng)5 min。錄像并記錄每只大鼠進(jìn)入新異臂的次數(shù)。數(shù)據(jù)采集處理由ANY-Maze軟件(Stoeling，美國)完成。

1.2.5 Morris水迷宮

Y迷宮結(jié)束1 d后，開始Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。用來測試大鼠的長期工作記憶能力。實(shí)驗(yàn)方法參照[15]，數(shù)據(jù)采集處理由Ethovision 3.0軟件(Noldus Information Technology，荷蘭)完成。

1.2.6 HE染色

大鼠腹腔注射1%的戊巴比妥鈉(50 mg/kg)，完全麻醉后暴露心臟，先用180 mL 0.9%無菌生理鹽水沖洗，然后180 mL 4%多聚甲醛灌注。待灌注成功后，分離出大腦，置于4%多聚甲醛內(nèi)常溫固定24 h，制作石蠟切片，然后進(jìn)行HE染色，最后中性樹脂封片后鏡下觀察并拍片記錄。通過HE染色觀察海馬內(nèi)部細(xì)胞的結(jié)構(gòu)變化。

1.2.7 Western Blot

將SD大鼠麻醉后快速斷頭，冰上取出大鼠新鮮海馬組織，-80℃冷凍保存。取出加入組織裂解液冰上研磨、低溫離心提取總蛋白。利用BCA法檢測蛋白濃度，各樣本內(nèi)蛋白含量根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算。每組取40 μg進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDSPAGE)，再將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，封閉用含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液，室溫?fù)u床封閉1.5 h，將封閉好的PVDF膜浸泡在以TBST稀釋的LC3II/I(1∶750)，P62(1 ∶1000)，Beclin1(1 ∶750)，β-actin(1∶1000)一抗中，4℃條件下孵育過夜，洗滌后浸泡在以TBST(1∶10000)稀釋的二抗中，室溫?fù)u床孵育2 h。最后將PVDF膜放至凝膠成像儀上，加入ECL化學(xué)發(fā)光劑顯色成像并保存。條帶的灰度值采用Image Lab軟件分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 hUCMSCs的形態(tài)觀察

原代hUCMSCs培養(yǎng)14 d后貼壁生長，第3代細(xì)胞生長狀態(tài)良好，呈長梭形漩渦狀，典型集落生長(圖1A，1B)，細(xì)胞融合至80～90%時(shí)用于實(shí)驗(yàn)。

2.2 hUCMSCs改善衰老大鼠在新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中的學(xué)習(xí)記憶能力

H組大鼠和N組大鼠新物體識(shí)別率和分辨系數(shù)顯著高于C組(P＜0.01)，H組和N組間無顯著差異(圖 2A，2B)。

2.3 hUCMSCs改善衰老大鼠在Y迷宮實(shí)驗(yàn)中的短期工作記憶和空間探索能力

H組和N組自發(fā)交替行為顯著高于C組(P＜0.05)，H組和N組間無顯著差異(圖3A)。H組和N組進(jìn)入新異臂的次數(shù)顯著高于C組(P＜0.05)，H組和N組間無顯著差異(圖3B)。

2.4 hUCMSCs改善衰老大鼠在經(jīng)典水迷宮實(shí)驗(yàn)中的長期工作記憶和空間探索能力

H組和N組大鼠隨著訓(xùn)練時(shí)間延長，逃避潛伏期顯著短于C組大鼠，在訓(xùn)練的第4天差異極顯著(P＜0.01)；H組和N組無差異(圖4A)；在第5天的空間探索實(shí)驗(yàn)中，游泳軌跡可看出H組和N組呈直線式搜索，C組呈曲線式搜索(圖4B)；H組和N組跨越平臺(tái)次數(shù)和目的象限停留時(shí)間顯著大于C組(P＜0.01)(圖4C、4D)；此外，各組大鼠的游泳速度沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(圖4E)。

2.5 hUCMSCs改善衰老大鼠海馬CA1區(qū)和DG區(qū)神經(jīng)元數(shù)量及形態(tài)

H組和N組海馬CA1區(qū)細(xì)胞排列較規(guī)整，結(jié)構(gòu)完好，細(xì)胞核飽滿，C組CA1區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，排列疏松，細(xì)胞核有固縮、碎裂現(xiàn)象(圖5A、5B、5C)。H組和N組海馬DG區(qū)形態(tài)規(guī)整，神經(jīng)細(xì)胞排列緊密，細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核飽滿。C組大鼠海馬DG區(qū)形態(tài)不規(guī)整，細(xì)胞數(shù)量減少，細(xì)胞核固縮，碎裂嚴(yán)重(圖 5D、5E、5F、5G、5H、5I)。

圖1 光學(xué)顯微鏡下處于對數(shù)期生長的第3代hUCMSCs細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Morphology of the third generation hUCMSCs growing in log phase under light microscope

圖2 新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)(，n＝10)Note.Compared with group C，??P＜ 0.01.(The same in the following figures)Figure 2 Novel object recognition test(，n＝10)

圖3 Y迷宮實(shí)驗(yàn)(，n＝10)Figure 3 Y Maze(，n＝10)

圖4 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)(，n＝10)Note.A，B.The time and track of the rats to find the platform in the positioning cruise experiment.C，D.The number of times the rats crossed the platform in the space exploration experiment and the time they stayed in the target quadrant.E.Swimming speed of rats in water maze experiment.Figure 4 Morris water maze(，n＝10)

2.6 hUCMSCs干預(yù)后增強(qiáng)了衰老大鼠海馬中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

H組和N組大鼠海馬中LC3Ⅱ蛋白含量較C組顯著升高(P＜0.01)，LC3Ⅰ蛋白含量較C組顯著降低(P＜ 0.05，P＜ 0.01)，LC3Ⅱ與LC3Ⅰ的比值較C 組顯著升高(P＜ 0.05，P＜ 0.01)(圖6A、6C)，H 組和N 組大鼠海馬中P62蛋白含量較C組顯著降低，Beclin1蛋白含量較C組顯著升高(P＜0.01)(圖6A、6B)。

圖5 各組海馬組織HE染色(，n＝3)Note.Black arrow for nuclear shrinkage，fragmentation.Figure 5 HE staining of hippocampal tissues of each group(，n＝3)

圖6 蛋白條帶和相對含量(，n＝3)Note.A.Western Blot protein bands of Beclin1，P62and LC3II/I.B，C.Compared with group C，?P＜ 0.05，??P＜ 0.01.Figure 6 Protein bands and relative protein content(，n＝3)

3 討論

衰老是隨著年齡的增長，機(jī)體逐漸出現(xiàn)生物學(xué)損傷的過程，有研究表明，中樞神經(jīng)系統(tǒng)最易受到衰老影響，常常伴隨導(dǎo)致認(rèn)知功能下降甚至神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，對老年人的生活造成了巨大的影響，隨著全球老齡化人口日漸增多，這一問題變得更加嚴(yán)峻。hUCMSCs作為一種易獲取、無倫理爭議和免疫排斥反應(yīng)，且具有高度自我分化及更新能力的干細(xì)胞，已經(jīng)應(yīng)用于很多中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病的研究，能夠修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的損傷和衰老過程中的導(dǎo)致的腦部微環(huán)境的改變[6-7，16]，大多是從DNA損傷和氧化應(yīng)激等機(jī)制入手[17]，hUCMSCs對腦衰老與自噬之間的關(guān)系研究較少。因此，本文選取出現(xiàn)認(rèn)知和學(xué)習(xí)記憶能力衰退的自然衰老大鼠為研究對象，通過移植hUCMSCs探討其與衰老所致的認(rèn)知衰退與自噬之間的關(guān)系。

考慮到實(shí)驗(yàn)中水迷宮雌雄鼠的體力和游泳速度的差異，造成實(shí)驗(yàn)結(jié)果出現(xiàn)明顯的兩極分化[18]且加入性別差異后不符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)單一變量的原則，除此以外類似研究多數(shù)也用單一雄性大鼠作為實(shí)驗(yàn)對象[19-20]，因此在本實(shí)驗(yàn)中優(yōu)先選擇了單一性別雄鼠作為研究對象。

據(jù)我們所知，在臨床上，腦室注射經(jīng)常面臨著顱內(nèi)感染甚至更嚴(yán)重的腦損傷，其移植的必要性和轉(zhuǎn)分化的頻率仍有爭議。相比之下，靜脈移植MSCs較為安全，這一點(diǎn)是普遍比較認(rèn)可的。最近一項(xiàng)研究也證明了這種方式的安全性[21]，與在中樞神經(jīng)系統(tǒng)直接給藥有明顯的臨床優(yōu)勢并且更容易接受[22]。因此我們在本實(shí)驗(yàn)中采取了靜脈注射這種侵入性較小的方式，對自然衰老出現(xiàn)認(rèn)知障礙的動(dòng)物模型進(jìn)行慢性治療，移植的劑量與時(shí)間是通過預(yù)實(shí)驗(yàn)來確定的。

除此之外，有研究表明靜脈移植MSCs在缺血性腦卒中、亨廷頓病[23]和AD[24-25]等模型中均可遷移并定位到大腦區(qū)域[26-27]，但只有一小部分細(xì)胞會(huì)到達(dá)炎癥組織，這表明它們的治療作用可能是由于其分泌的具有免疫調(diào)節(jié)和營養(yǎng)活性的生物活性分子起作用[28-29]，有鑒于此，先前的研究表明，在外傷性腦損傷中，MSCs通過與非神經(jīng)系統(tǒng)器官(如脾)相互作用而起到神經(jīng)保護(hù)作用[30]?？紤]到這些因素，我們認(rèn)為間充質(zhì)干細(xì)胞的治療效果可能是由分泌的生物活性分子或其他免疫細(xì)胞介導(dǎo)的。

Beclin1、LC3和P62參與了自噬發(fā)生的起始、延長、成熟和降解的整個(gè)過程，是判斷自噬過程的關(guān)鍵指標(biāo)。Beclin1是自噬起始的重要組成部分，其與PI3K結(jié)合形成復(fù)合物，招募胞漿中的自噬相關(guān)的蛋白，形成完整自噬體[31]。LC3是哺乳動(dòng)物細(xì)胞中酵母Atg8基因的同源物，一般以LC3I和LC3II兩種形式出現(xiàn)[32]，在Atg4的作用下，LC3I經(jīng)過剪切和泛素化加工修飾，與自噬體膜表面的磷脂酰乙醇胺相結(jié)合，形成LC3II。一般以LC3II與LC3I的比值來評(píng)估自噬水平，作為反映自噬活性高低的一個(gè)有效指標(biāo)[33-34]。p62蛋白作為細(xì)胞自噬調(diào)控過程中的一種可選擇底物，其累積提示自噬能力衰退，而當(dāng)P62被降解時(shí)表示自噬被激活，因此P62與自噬水平負(fù)相關(guān)[35]，本研究發(fā)現(xiàn)與對照組相比移植hUCMSCs的自然衰老大鼠的海馬組織中Beclin1和LC3II/I的比值表達(dá)量顯著增加，P62蛋白表達(dá)顯著下降，表示hUCMSCs干預(yù)誘導(dǎo)Beclin1合成增加，激活自噬的起始階段。LC3II合成增加，參與自噬溶酶體膜的延伸，直到自噬溶酶體形成，并在后期與P62相互作用后使P62在溶酶體降解，形成完整的自噬流。證明hUCMSCs干預(yù)后增強(qiáng)了衰老大鼠海馬自噬水平，改善了隨著年齡增加導(dǎo)致的自噬缺陷。

本課題還發(fā)現(xiàn)在Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)中，移植hUCMSCs后的大鼠在定位航巡實(shí)驗(yàn)中第2、3、4天的逃避潛伏期明顯低于對照生理鹽水組，并且與3月齡大鼠無差異(未給數(shù)據(jù))；在撤掉水下隱藏平臺(tái)后，細(xì)胞移植組經(jīng)過原平臺(tái)位置的次數(shù)以及在目的象限停留的時(shí)間明顯高于對照生理鹽水組，說明移植hUCMSCs后，自然衰老大鼠的長期工作記憶和空間探索能力的水平有所提高。Y迷宮實(shí)驗(yàn)用來檢測大鼠的空間工作記憶及片段式學(xué)習(xí)記憶，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)移植hUCMSCs組大鼠與生理鹽水組相比自發(fā)交替行為正確率和進(jìn)入新異臂的次數(shù)顯著增加。新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)中，細(xì)胞移植組大鼠探索新物體的次數(shù)顯著高于生理鹽水組大鼠，以上行為學(xué)實(shí)驗(yàn)表明，hUCMSCs對自然衰老大鼠的片段式記憶，長期工作記憶和空間探索能力均有所提高。在本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)干細(xì)胞移植可改善自然衰老大鼠短期內(nèi)的認(rèn)知衰退，長期的效果還有待探索。

綜上所述，靜脈注射間充質(zhì)干細(xì)胞是一種很有前途的治療方法，其對改善腦衰老引起的腦部神經(jīng)元丟失，自噬減弱以及對工作記憶和對物體及方位的學(xué)習(xí)記憶衰退起著重要的作用。MSCs治療神經(jīng)退行性病變?nèi)蕴幱谠缙谘芯侩A段，在今后的課題研究中，應(yīng)致力于解開這種治療的具體機(jī)制，將從hUCMSCs如何具體影響衰老大鼠海馬的自噬水平以及能否長期改善腦衰老引起的認(rèn)知方面的衰退進(jìn)行更加深入的研究。