Genistein通過上調(diào)Cyclin D1和CDK4的表達(dá)促進(jìn)卵巢癌OVCAR-5細(xì)胞的增殖

李 雯，李 毅，王中衛(wèi)，任洪濤，張 楊，楊鵬濤，潘淑沛，王亞利

(西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤放療科，陜西西安 710004)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一，其死亡率居?jì)D科惡性腫瘤之首。由于卵巢癌發(fā)病隱匿且缺乏有效篩查手段，70%的患者就診時(shí)已處于晚期。即使行腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)和化療，70%的患者仍會(huì)復(fù)發(fā)。并且每次治療后，大部分患者的復(fù)發(fā)周期會(huì)逐步縮短并產(chǎn)生耐藥性。

早期研究認(rèn)為持續(xù)排卵后傷口愈合引起的細(xì)胞增殖過快和促性腺激素刺激可能是卵巢癌的發(fā)病機(jī)制[1-3]。之后的研究表明卵巢癌的病因要復(fù)雜得多。雌激素受體激活，活性氧(ROS)水平升高和NF-κB介導(dǎo)的炎癥可能都是卵巢癌發(fā)病機(jī)制之一[4-6]。植物雌激素不僅有弱的雌激素活性，而且有清除自由基、抗炎等作用，這些機(jī)制可能有助于其影響癌癥的進(jìn)展。攝入含有植物雌激素的食物可以降低卵巢癌的發(fā)病率[7]。Genistein是廣泛存在于食物和中草藥特別是大豆類食物中植物雌激素的一種主要類型，對(duì)β雌激素受體有高度親和力，可以通過多重機(jī)制發(fā)揮抗癌作用[8]。研究發(fā)現(xiàn)，Genistein可以誘導(dǎo)有抗炎作用的谷胱甘肽過氧化物酶的表達(dá)，以及抑制前列腺癌細(xì)胞株LINCaP和PC-3的增殖[9]。

植物雌激素和卵巢癌流行病學(xué)相關(guān)性研究尚存爭(zhēng)議[10-13]。BANDERA等[14]通過一項(xiàng)病例對(duì)照研究分析食物或補(bǔ)品中植物雌激素的攝入和卵巢癌罹患風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系，尚未發(fā)現(xiàn)兩者之間存在相關(guān)性。然而，QU等[15]納入10個(gè)觀察性研究的Meta分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，植物雌激素的高攝入和卵巢癌罹患風(fēng)險(xiǎn)的降低是有關(guān)的；亞群分析表明異黃烷酮、大豆食品及亞洲飲食方式能夠降低卵巢癌的發(fā)病率。因此，卵巢癌細(xì)胞中植物雌激素的生物活性值得進(jìn)一步的研究。

本研究分析了Genistein對(duì)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-5細(xì)胞增殖的影響，并明確了細(xì)胞生長(zhǎng)、活性和關(guān)鍵細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的表達(dá)。研究結(jié)果可為深入分析Genistein在卵巢癌細(xì)胞中的作用和機(jī)制提供基礎(chǔ)信息。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)卵巢癌細(xì)胞株OVCAR-5細(xì)胞培養(yǎng)于RPMI-1640培養(yǎng)基，含100 mL/L胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素，在37 ℃的50 mL/L CO2環(huán)境下培養(yǎng)。

1.2 材料Genistein購自德國Merck KGaA公司。抗體的稀釋倍數(shù)、目錄號(hào)和來源分別是：①抗增殖細(xì)胞核抗原小鼠抗體1∶1 000 Cat. No. SC-56, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Dallas, Texas, USA。②抗CDK4兔子多克隆抗體，1∶1 000 Cat. No. ab108357, Abcam Cambridge, MA, USA。③抗Cyclin D1多克隆抗體，1∶1 000 Cat. No. ab40754, Abcam Cambridge, MA, USA。④抗蛋白p21小鼠單克隆抗體，1∶1 000 Cat. No.SC-397, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Dallas, Texas, USA。⑤抗蛋白p27兔子多克隆抗體，1∶1 000 Cat. No.3686S, Cell Signaling, Danvers, MA, USA。⑥抗β肌動(dòng)蛋白小鼠單克隆抗體，1∶1 000，Cat. No.EG-262, 1∶1 000；Excellgen, Rockville, MD, USA。⑦二抗，抗兔子IgG-HRP Cat. No.SC-2301, Santa Cruz Biotechnology, Inc. Dallas, Texas, USA。⑧二抗，山羊抗小鼠IgG-HRP Cat. No.G21040, Thermo Scientific, Waltham, MA, USA。

1.3 方法

1.3.1細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTS檢測(cè) 將OVCAR-5細(xì)胞接種在96孔培養(yǎng)板，用1 μmol/L的Genistein處理后，每隔24 h記1次細(xì)胞數(shù)。在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，通過胰蛋白酶-乙二胺四乙酸的消化作用收集細(xì)胞。用4 g/L的臺(tái)盼藍(lán)(錐蟲藍(lán))溶液混合懸浮的細(xì)胞，并用血細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。對(duì)于MTS法細(xì)胞活性實(shí)驗(yàn)，用1 μmol/L的Genistein處理，在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)，把20 μL含有MTS[3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-5-(3-羧甲酯基)-2-(4-磺苯基)-2H-四唑]細(xì)胞滴度為96的水溶液(Cat.No.G5430, Promega, Madison, WI, USA)加入培養(yǎng)基中。1 h后，將100 μL的培養(yǎng)基從培養(yǎng)板中移開，并用96孔讀板儀(Modulus Microplate Multimode Reader, Turner BioSystems, USA)測(cè)量490 nm處的吸光度。

1.3.2BrdU聯(lián)合檢測(cè)免疫組化實(shí)驗(yàn) 用1 μmol/L Genistein(終濃度)處理OVCAR-5細(xì)胞48 h。將5-溴-2′-脫氧尿苷(BrdU) (Cat. No.000103; Invitrogen, Rockville, MD, USA)加入細(xì)胞培養(yǎng)基中，用2 h和基因組DNA整合。用冰冷PBS洗滌后，用700 mL/L的乙醇在4 ℃下固定細(xì)胞3 h，并用2 mL/L的Triton X-100滲透30 min。按制造商的指示使用BrdU試劑盒(Cat. No.933943; Invitrogen)進(jìn)行BrdU抗體結(jié)合和顯色。對(duì)BrdU陽性的細(xì)胞和所有細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算出BrdU的陽性率。

1.3.3RNA提取和實(shí)時(shí)PCR 用1 μmol/L Genistein對(duì)OVCAR-5細(xì)胞處理48 h后，經(jīng)冰冷PBS洗滌，再用RNeasy超迷你試劑盒(Cat.No.74136，QIAGEN, Valencia, CA, USA)提取出全部RNA。用1 000的分光光度計(jì)(Thermo Scientific, Waltham, MA, USA)測(cè)量RNA濃度。在高容量RNA-to-cDNA試劑盒(Cat. No.4387406, Applied Biosystems, Foster, CA, USA)中，用1 μg RNA合成cDNA。用Primer3程序(http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/primer3/)設(shè)計(jì)實(shí)時(shí)PCR引物(表1)。用ABI 7900HT快速實(shí)時(shí)PCR儀(Applied Biosystems, Dublin, Ireland)做定量實(shí)時(shí)PCR。每個(gè)實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)體系：6 μL實(shí)時(shí)PCR反應(yīng)混合物(Cat. No.75600, VeriQuest SYBR-Green master mix, Affymetrix, Cleveland, OH, USA)，2 μL 1∶100稀釋的cDNA，1 μL正向、反向引物(10 μm)以及2 μL ddH2O。95 ℃變性10 min；40個(gè)循環(huán)擴(kuò)增：95 ℃變性15 s；60 ℃退火30 s；72 ℃擴(kuò)增1 min。GAPDH作為內(nèi)參基因，以使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。解鏈曲線分析證實(shí)了目標(biāo)cDNA的特異性擴(kuò)增。用GAPDH水平使目標(biāo)RNA相關(guān)RNA的表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化。

表1 實(shí)時(shí)PCR引物Tab.1 The Real-time PCR primers

1.3.4Western blotting檢測(cè) 用1 μmol/L Genistein處理OVCAR-5細(xì)胞48 h。經(jīng)冰冷PBS(pH 7.4)洗滌2次，用冰冷裂解緩沖液[150 mmol/L NaCl，50 mmol/L Tris-鹽酸(pH 7.4)，0.1% SDS，0.5%脫氧膽酸鈉，1%諾乃清潔劑P-40]在冰上裂解，并用1% Halt蛋白酶抑制劑混合物(100×; Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)、1 mmol/L苯甲基磺酰氟(PMSF)、5 mmol/L氟化鈉(NaF)及1 mmol/L釩酸鈉(Na3VO4)補(bǔ)充。收集細(xì)胞裂解物，并在4 ℃離心30 min(1 400 r/min)。將35 mg蛋白和SDS上樣緩沖液混合，煮沸5 min，根據(jù)目標(biāo)蛋白相對(duì)分子量于8%～12% SDS-聚丙烯酰胺凝膠中溶解分離。將蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，含有50 g/L脫脂牛奶和0.1% Tween-20的TBS用于阻止非特異性結(jié)合。在主要抗體結(jié)合、廣泛洗滌和第二抗體結(jié)合后，用ECL系統(tǒng)(Cat. No.32106, Thermo Scientific, Rockford, IL, USA)進(jìn)行顯色。剝離膜和檢測(cè)肌動(dòng)蛋白以提供蛋白負(fù)荷控制。

2 結(jié) 果

2.1 Genistein促進(jìn)了OVCAR-5細(xì)胞的增殖與活性為了檢測(cè)染料木黃酮對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)的影響，用1 μmol/L Genistein處理OVCAR-5細(xì)胞，每日細(xì)胞計(jì)數(shù)(圖1)。與對(duì)照組相比，Genistein處理細(xì)胞3 d后，細(xì)胞數(shù)量顯著增多。MTS法實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之一致，經(jīng)處理4 d后，各時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞活性顯著增加(圖2)。這表明Genistein能夠促進(jìn)OVCAR-5細(xì)胞的增殖和活性。

圖1 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖2 測(cè)量細(xì)胞活性的MTS實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2 Genistein促進(jìn)細(xì)胞DNA合成用BrdU免疫組化實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Genistein對(duì)DNA合成的影響。在處理3d后對(duì)陽性細(xì)胞和所有細(xì)胞計(jì)數(shù)，得到陽性率(圖3)，和對(duì)照組相比，實(shí)驗(yàn)組的BrdU免疫組化染色增加，表明DNA合成上調(diào)。該結(jié)果與之前實(shí)驗(yàn)中Genistein促進(jìn)細(xì)胞增殖與活性的結(jié)果一致。

圖3 BrdU免疫組化染色分析實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3 Genistein引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子mRNA水平變化基于上述Genistein對(duì)細(xì)胞作用的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，實(shí)時(shí)PCR測(cè)定PCNA、Cyclin D1、CDK4、p21及p27的mRNA表達(dá)(圖4)。PCNA是DNA合成所需要的，經(jīng)常被用作細(xì)胞周期進(jìn)展的標(biāo)記。Cyclin D1和CDK4是G1-S期轉(zhuǎn)變所需的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子。P21和p27是細(xì)胞周期進(jìn)程的負(fù)調(diào)控因子。Genistein處理2 d后的結(jié)果表明PCNA、Cyclin D1和CDK4的mRNA水平明顯上調(diào)，p21和p27的mRNA水平顯著下降。表明Genistein對(duì)OVCAR-5細(xì)胞G1-S期的轉(zhuǎn)變有強(qiáng)正性作用。

2.4 Genistein引起細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子蛋白水平變化為了明確上述細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子蛋白水平上的變化，對(duì)Genistein未處理和處理48 h的細(xì)胞中分離出的總蛋白進(jìn)行蛋白印跡分析(圖5)。用來自相應(yīng)LCs的值進(jìn)行密度分析和使結(jié)果標(biāo)準(zhǔn)化。結(jié)果顯示PCNA、Cyclin D1和CDK4的蛋白水平顯著增高，p21和p27蛋白表達(dá)下降。表明Genistein對(duì)OVCAR-5細(xì)胞的作用之一是促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程。

圖4 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子mRNA水平變化

圖5 細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子的蛋白表達(dá)變化

3 討 論

為了評(píng)估Genistein對(duì)卵巢癌細(xì)胞增殖的影響，本研究在用Genistein處理OVCAR-5細(xì)胞后行細(xì)胞計(jì)數(shù)和MTS檢測(cè)，結(jié)果均表現(xiàn)為Genistein促進(jìn)細(xì)胞增殖和DNA合成。為了證實(shí)Genistein對(duì)細(xì)胞周期進(jìn)程的作用，檢測(cè)了多個(gè)細(xì)胞周期活化因子和抑制因子mRNA水平和蛋白表達(dá)水平的變化。CDK4(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶4)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，使視網(wǎng)膜細(xì)胞瘤(RB)基因產(chǎn)物和Smad3的磷酸化，促進(jìn)G1-S期轉(zhuǎn)變[16]。Cyclin D1是細(xì)胞周期蛋白家族中的一員，可以與幾個(gè)CDKs組成復(fù)合體，使重要的細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子磷酸化。PCNA在DNA雙鏈周圍起支架作用，在DNA復(fù)制過程中促進(jìn)DNA聚合酶及其他因子的募集。PCNA的水平反映細(xì)胞周期的正性進(jìn)程[17]。p21是強(qiáng)效的CDKI(細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制因子)，通過結(jié)合細(xì)胞周期蛋白如CDK1和CDK2下調(diào)G1-S期的轉(zhuǎn)變。相似地，p27阻止CDK2和CDK4的活化以減緩細(xì)胞周期進(jìn)程[16,18]。本研究發(fā)現(xiàn)這些細(xì)胞因子mRNA和蛋白表達(dá)變化趨勢(shì)一致。CDK4、Cyclin D1和PCNA等活化因子的水平增加，p21和p27等抑制因子的水平降低，表明Genistein促進(jìn)細(xì)胞增殖很可能是通過促進(jìn)G1-S期轉(zhuǎn)變所實(shí)現(xiàn)的。

文獻(xiàn)檢索發(fā)現(xiàn)大量關(guān)于植物雌激素對(duì)癌細(xì)胞作用的研究，但觀察結(jié)果存在爭(zhēng)議。大多數(shù)使用來自乳腺、大腸和前列腺等惡性腫瘤細(xì)胞株的研究表明Genistein能夠抑制癌細(xì)胞的增殖[11-12]。與之相反的是CHEN等[19]觀察到在寬范圍濃度(0.001～1 μmol/L)內(nèi)的Genistein以劑量依賴的方式刺激Hela細(xì)胞的增殖。用Genistein處理Hela細(xì)胞組織引起細(xì)胞的S期增加、G1期減少，表明Genistein可能促進(jìn)G1-S期轉(zhuǎn)變。而且，Genistein處理后細(xì)胞凋亡減少、Αkt和ΝF-κB活化。因此推斷Genistein可能通過雌激素受體介導(dǎo)的PPI3K/Akt/ΝF-κB通路促進(jìn)Hela細(xì)胞增殖[19]。LUCKI等[20]得到了相似結(jié)果，他們發(fā)現(xiàn)Genistein通過誘導(dǎo)酸性神經(jīng)酰胺酶的表達(dá)刺激MCF-7乳腺癌細(xì)胞生長(zhǎng)。Genistein對(duì)癌細(xì)胞作用的差異可能是由不同的細(xì)胞因子引起的。首先，ERα或者ERβ的活化可引起不同的細(xì)胞應(yīng)答，ERα活化有刺激作用，ERβ活化有抑制作用。因此最終的細(xì)胞應(yīng)答取決于兩種ER在不同細(xì)胞或組織中的比例。第二，低濃度Genistein與ERβ結(jié)合，高濃度Genistein與ERα、ERβ均結(jié)合，細(xì)胞效應(yīng)將相應(yīng)變化為抑制或刺激[21]。第三，當(dāng)培養(yǎng)基沒有雌二醇或其他更強(qiáng)的雌激素化合物時(shí)，Genistein弱的雌激素效應(yīng)將表現(xiàn)出來。但是當(dāng)實(shí)驗(yàn)體系包含相當(dāng)高水平的雌二醇或者其他強(qiáng)的雌激素化合物時(shí)，Genistein將和這些強(qiáng)雌激素化合物競(jìng)爭(zhēng)并表現(xiàn)為抑制作用。雖然一些研究強(qiáng)調(diào)要清除培養(yǎng)基和血清中預(yù)先存在的雌激素，但是其他研究只用了含有酚紅的培養(yǎng)基和含有雌激素的血清，這可能會(huì)對(duì)最終觀察到的結(jié)果產(chǎn)生影響。第四，通過雌激素受體或其他通路介導(dǎo)的表觀遺傳機(jī)制，可能有助于Genistein作用產(chǎn)生[22]。RIETJENS等[23]提出一個(gè)二次元模式，可以解釋關(guān)于異黃酮對(duì)細(xì)胞增殖看似矛盾的作用。除了ER介導(dǎo)的反應(yīng)外，異黃酮可能也通過一些尚未解釋清楚的機(jī)制影響DNA甲基化、組蛋白修飾和miRNA的表達(dá)模式。

本研究用無酚紅培養(yǎng)基和無雌激素培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，這可能部分解釋了Genistein在無雌激素環(huán)境下的雌激素效應(yīng)。重要的是，上述結(jié)論可能也適用于活體環(huán)境，并可能釋了為什么會(huì)從年齡、絕經(jīng)狀態(tài)或BMI(已知影響內(nèi)源性雌激素水平的因素)等不同人群的流行病學(xué)研究中獲得不一致的結(jié)果。在活體內(nèi)Genistein對(duì)癌癥發(fā)展的影響可能會(huì)受到其他因素如腫瘤免疫、微環(huán)境及細(xì)胞間相互作用等的影響。即使Genistein的攝入對(duì)卵巢癌的發(fā)生有預(yù)防作用，也不一定是由其直接抑制細(xì)胞增殖引起的。從這個(gè)角度看，需要在雌激素化合物的背景水平下進(jìn)行更全面的研究，以確定Genistein對(duì)癌細(xì)胞的確切作用。

綜上所述，本研究評(píng)價(jià)了廣泛存在于食物和中草藥中植物雌激素的主要類型——Genistein在無雌激素環(huán)境中對(duì)卵巢癌OVCAR-5細(xì)胞的細(xì)胞增殖作用。結(jié)果表明Genistein能明顯促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞增殖。此外，Genistein作用細(xì)胞可引起多個(gè)細(xì)胞周期調(diào)節(jié)因子和標(biāo)志物表達(dá)的改變。這些發(fā)現(xiàn)豐富了目前對(duì)植物雌激素生物活性的認(rèn)識(shí)，并將促進(jìn)今后對(duì)其潛在分子機(jī)制的研究。